分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

塩分は、高血圧のための主要な危険因子です。^1,2米国心臓協会推奨 2,300 ミリグラム (mg) 1 日あたりのナトリウム (Na⁺) 摂取量の最大値。米国の人口の 10% 未満の場合は、この勧告を遵守します。^{3,4 +} Na 摂取量の適度な削減血圧を下げるし、冠動脈心疾患と米国で脳卒中の年次の新しいケースを 20% 削減します。⁵余分な塩の消費の主な問題は、高血圧の人口の 50% が塩感受性を表わすこと後ナ^{ナ+ロードや血圧のような低下血圧で 10 mmHg 増加として定義されている +}制限と利尿。⁶塩感度は、また、正常血圧の個人の 25% で発生し、死と心血管イベントの独立した予測因子は。^7,8高血圧腎臓を含む塩センシング機構がよく研究されて;ただし、最近の研究は、免疫細胞が Na⁺を感じることができることをお勧めします。^9,10

最近の証拠は、外腎 Na⁺で変更処理が間に Na⁺の蓄積を引き起こすでき、炎症を促進するを示唆しています。^11,12当研究室および他示されている自然免疫と適応免疫システムの両方の細胞が高血圧の悪化に貢献します。^9,13,14,15さまざまな高血圧の刺激は、アンジオテンシン II、ノルエピネフリンおよび原因になる食塩マクロファージ、単球、腎臓と血管系に潜入し、Na⁺保存、血管収縮、血圧を促進する T リンパ球を含む標高と終末器官損傷。^{9,16,17,18,19,20}は先行研究で我々 は isolevuglandin (IsoLG) を Dc に蓄積を発見-アンジオテンシン II、DOCA-塩高血圧症を含む様々 な高血圧性刺激に対する応答における付加体のタンパク質。¹⁴ IsoLGs 蛋白質のリジン付加物と急速に脂質過酸化反応の反応性の高い製品、その蓄積が DC の活性化に関連付けられています。¹⁴高 Na⁺は IsoLG 蛋白質のための強力な刺激を設けて最近は Dc に dc⁹ナ⁺エントリはアミロライド敏感なトランスポーターを介したマウスにおける付加物します。Na⁺は、カルシウム (Ca^{2 +}) Na⁺/Ca^{2 +}交換器を介して交換されます。Ca^{2 +}活性化プロテインキナーゼ C (PKC) 増加した活性酸素 (O₂^{· -}) につながる NADPH オキシダーゼの活性化し、IsoLG 蛋白質付加物生成。⁹養子伝アンギオテンシン II のサブ昇圧線量への応答での Dc 素数の高血圧の塩公開します。⁹

CD11c の識別⁺ Dc 組織からは免疫組織および RT-PCR に以前制限されています、Dc の分離は、細胞のフローサイトメトリーによる並べ替えに制限されています。流れ cytometry セルソートは免疫細胞の隔離のための強力な方法が、それはコストがかかり、時間がかかりと実行可能なセルの低収量に 。したがって、我々 は組織の消化、体外刺激 CD11c の養子の転送のためのステップ バイ ステップ プロトコルを最適化してきました⁺ Dc 高血圧を研究します。

ヴァンダービルト大学の制度的動物ケアおよび使用委員会は、本明細書に記載されている手順を承認しました。マウスが建物し、の世話をガイドに従ってケアおよび実験動物の使用 (国民アカデミーの出版物。改訂 2010 年)。

1. マウスから脾臓の単離

1. RPMI 1640 の準備: 10 %fbs、0.10 mM HEPES 1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 μ M β-メルカプトエタノール、1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
2. 10-12 週間を安楽死させる-CO₂吸入による古い C57bl/6 男性マウス。胸とマウスの側面を 70% エタノールをスプレーします。左側には、皮膚、脾臓を公開する腹腔内を慎重に開きます。
3. 慎重に腸と肝臓をマウスの左側に移動小さな鉗子を使用し、優しく高級はさみを使用して脾臓を切除します。
   注:この手順を実行する必要があります非常に慎重に消化管への損傷は、汚染を引き起こすことができます。
4. 各場所は、RPMI 1640 培地 3 mL を含むラベルの 15 mL の円錐管に脾臓を摘出しました。

2. 脾臓から単一細胞懸濁液の生成

注:脾臓は、機械的解離プラス酵素消化を組み合わせることによって単一細胞懸濁液に解離することができます。

1. コラゲナーゼ D (1 mg/mL; 0.29 U/mg 凍結乾燥) を追加することによって脾の消化ソリューションを準備し、DNase I (0.1 mg/mL) 準備 RPMI 1640 媒体 (手順 1.1 参照)
2. 鉗子を使用すると、脾の消化溶液 3 mL を含む C 管 (解離管) に脾臓を転送します。
3. 製造元の指示に従って半自動ホモジナイザーを用いた機械的解離を実行します。
   1. C 管は回転アームに密に配置されて、半自動ホモジナイザーに C 管を配置します。C 管を配置すると、60 の脾臓 04.01プロトコルを実行する半自動ホモジナイザーに開始ボタンを押して s。
      注:機械的解離は、軽くフィルターを脾臓を研削して、50 mL のコニカル チューブの上に 40 μ m のフィルターを配置するも実行できます。脾臓を研削後を通じて RPMI メディアの 10 mL で 40 μ m フィルターをすすいでください。
4. 機械的解離後、ホモジナイザーからチューブを外し、酵素消化を行います。連続回転 (20 rpm) 37 ° C で 15 分間のサンプルをインキュベートします。
5. 40 μ m ストレーナー フィルタ リング後 50 mL の円錐管にピペットでソリューションを転送します。ダルベッコ PBS (dPBS) 10 mL で 40 μ m ストレーナーを洗浄します。4 ° C で 10 分間 300 x gで細胞を遠心分離します。
6. 遠心分離後、上清を完全に吸引し、dPBS 10 mL に再ペレットを洗浄します。300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心

3. CD11c の分離⁺脾の単一細胞懸濁液から Dc

1. DPBS の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁し、検定とトリパンを使用してセルの数をカウント除外を青。
2. 300 x でg、4 ° C で 10 分間遠心分離によって細胞をペレットします。
3. 完全に上清を吸引し、磁気活性化細胞選別 (Mac) バッファーの 400 μ L でペレットを再懸濁します。
4. (材料の表を参照してください) CD11c のマイクロ ビーズが 1 x 10 の⁸のセルごとの 100 μ L を追加します。
5. 渦細胞懸濁液と 4 ° C で冷蔵庫で 10 分間インキュベート
6. 10 mL の血球を洗浄する Mac バッファーを追加します。300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心
7. 完全に上清を吸引し、Mac バッファーの 500 μ L で再懸濁します。

4. 磁気分離 CD11c の⁺ Dc

注:磁気分離装置の磁気分離が手動で行われる LS の列 (テーブルの材料を参照) が備わっています。磁気分離は、自動磁気分離装置で自動的に実行できます。(材料の表を参照)。

1. Mac 区切り記号および流れを収集するために各列の下 15 mL コニカル チューブの磁場に LS 列を配置します。
2. 3 mL のバッファーを持つ LS 列をすすいでください。
3. LS の各列に細胞懸濁液を置き、ラベルのないセルを含むフローを介して収集します。
4. LS 3 mL の Mac バッファーを通過するラベルのないセルの収集を洗い流します。LS 列 2 回以上を洗います。
5. 磁選機から LS の列を削除します。各列に 5 mL の Mac バッファーを追加し、しっかりときれいな 15 mL の円錐管に LS 列を突っ込むことにより磁気標識細胞をすぐに洗い流します。
   注:高純度の細胞懸濁液を取得する CD11c 細胞の二重絶縁を行うことが重要です。したがって、4.5 を 3.1 の手順を繰り返します。純度基準に図 4を参照します。この手順は CD11c の純度を向上させる⁺細胞の 90-95% に。
6. CD11c を決定する⁺ DC トリパン ブルー色素排除を使用して検定番号。0.4% トリパン ブルー溶液で 1:1 希釈でセルのサンプルを希釈します。
   注:非実行可能なセルは、染色される青、生菌無染色まま。
   1. これを行うには、慎重に細胞サンプル希釈 10 μ L で診断を記入し、1 分間インキュベートします。
   2. 生菌数を決定するがロードされている商工会議所の 1 × 1 mm²の 4 マスのセルをカウントします。

5. CD11c の体外高塩治療に⁺ Dc

1. 500 mL 1640 に 10 %fbs、0.1 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウム、50 μ M β-メルカプトエタノール、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを追加して DC 培養培地を準備 RPMI。
2. NaCl の 1.17 グラムを重量を量ると 50 mL の滅菌ファイティングファルコン管に配置することによって DC 高塩細胞培養媒体 (400 mM) x 10 を準備します。生理食塩水は、ソリューションまで 50 mL ファルコン管と渦に 50 mL の滅菌 DC 細胞培養基 (5.1 の手順で準備) を追加します。
3. すぐに細胞文化フードで 0.2 μ m フィルターを通して吸引ろ過を使用して高い塩 DC 文化メディアをフィルターします。
4. 4ºC で 10 分の 300 x gで脾臓から各細胞懸濁液を遠心します。1 x 10⁶セル/mL の濃度で DC 培地で細胞ペレットを再懸濁します。
5. ピペットのファルコン プレート 24 ウェル平底で DC サスペンションの 900 μ L (約 1 x 10 の⁶セル)。190 mM の最終的なナトリウム濃度も高い塩 DC 文化メディアの 100 μ L を追加します。プレートをラベルと 37 ° C で腐植質 48 h の CO₂インキュベーター。

6. 養子伝高塩処理 CD11c⁺ Dc

1. 48 h の体外刺激後削除 37 ° C からプレート腐植質 CO₂インキュベーター。
2. 細胞の培養基、CD11c 再懸濁しますには、上下⁺ dc すべての CD11c ピペット ピペット⁺ DC に対応する懸濁液 1.6 mL チューブをラベル付けします。よくメッキごとにこの手順を繰り返します。
3. 遠心分離機の各 CD11c⁺ DC 300 x g 4 ° C で 10 分間の懸濁液上清を吸引します。100 μ L の滅菌 dPBS で DC ペレットを再懸濁します。
4. 27 G 1/2 インチ針装備 1 mL 注射器に描く DC サスペンション。
5. 配置、素朴な男性 10 週齢 c57bl/6 マウス 2% 未満イソフルラン安定した外科平面を達成するために。ペダル反射の欠如と麻酔のレベルを確認します。ゆっくりと慎重にでは安定した外科平面が達成されれば、約 30 ° の角度でレトロな軌道空間に針を紹介します。
   注:眼の損傷を防ぐため、目から下、27 G 針の傾斜面を指す必要があります。
6. ゆっくりとスムーズに注入、CD11c⁺ DC サスペンション (約 1 x 10 の⁶セル)。注入が完了したら、一度、目を損傷しないように意識しているレトロな軌道スペース用の針を慎重に取り外します。
   注:注入後必要がありますほとんど、あるいは全く出血します。CD11c の養子転送注入 (例えば尾静脈) の静脈内投与法を用いた、⁺の Dc を実行できます。コントロール マウス受信 CD11c⁺通常塩メディアで培養した Dc。
7. 鼻の円錐形から、マウスを削除し、麻酔からの回復の間に約 30 分間、それらを監視します。

7. 14 日の低用量のアンギオテンシン II の準備 (140 ng/kg/分)

1. 5 M の NaCl の 500 μ L と酢酸の 300 μ L を追加することによりアンジオテンシン II のバッファーを準備します。量子サティス (QS) 脱イオン H₂0 30 mL まで。
2. アンジオテンシン II はアンジオテンシン II バッファーで 5 mg/mL 原液に溶解します。浸透圧側脳室内各マウスの体重によると 140 の ng/kg/分の速度でアンジオテンシン II を届けよう最終的な濃度を達成するために追加のバッファーを持つアンジオテンシン II 原液を希釈します。
   注:不可欠であるアンジオテンシン II (mg) = (マウスの重量 (g) x 0.2 mg/日 × 14 日)/1,000
   アンジオテンシン II (mg) を用意 (不可欠であるアンジオテンシン II x 260 μ L) を =/ポンプ率 (0.25 μ L/hr)
   アンジオテンシン II 在庫量 (μ) = 準備アンジオテンシン II 濃度 (5 mg/mL) x 1,000 をストック/
   希釈量 (μ L) = 270 - アンジオテンシン II の在庫数量
3. 希薄化するアンジオテンシン II の在庫数量を追加ステップ 7.2 で計算されたボリュームに基づいて (アンジオテンシン II バッファー)。
4. 無菌細胞文化フードの下で浸透圧側脳室内を開きます。
5. 希釈アンジオテンシン II ソリューションを追加し、注射器と針から任意の空気を吐き出します。浸透圧側脳室内の下部に付属の針を挿入し、ゆっくりとゆっくりと慎重に膀胱から針を引き込めている間アンジオテンシン II ソリューションを注入します。
6. 浸透圧側脳室内の頭を完全に浸透膀胱に挿入して、膀胱に空気を取得しないように注意を払うこと。

8. 14 日低用量アンジオテンシン II 浸透圧ミニポンプの注入

1. CD11c の養子移転後 10 日⁺ Dc、麻酔を開始し、継続的に適切な外科的平面を維持する 2% イソフルランを受信する鼻の円錐形にマウスを移動イソフルランの商工会議所の場所マウス。
2. 手術部位を準備するバリカンで首の背側に沿って毛を削除します。手術の開始前に 7.5 %betadine 続いて 70% エタノールできれいに剃毛エリア。
3. 皮膚に小さな切開 (約 1.5 cm) を作成します。止血剤を浸透圧側脳室内の配置を皮下ポケットを作成する切開部に挿入します。
4. 皮下のポケット、側脳室内に挿入します。すぐ皮膚 2 3 外科ステープル傷し、傷に 7.5 %betadine の別のアプリケーションを適用し、感染を防ぐためにステープル。
5. 檻に返す前に麻酔からの回復時に 30-60 分間マウスを監視します。
   注:必要がありますマウスの浸透圧側脳室内注入後 3-4 日まで監視します。

9. フローサイトメトリーによる解析のための受信者のマウスの脾臓の単離

1. 低用量アンジオテンシン II 注入後 14 日を特定後体外の高い塩を受信マウスから脾臓に養子転送によって Dc が扱われます。(手順 1 と 2) 上記の正確な手順に従ってください。

10. 表面の汚損

1. ポリスチレン FACS 管、4 ° C で 8 分間 350 × gで遠心分離機に 1x PBS で再停止される脾細胞を転送します。遠心分離後、上清を吸引します。Mac バッファーおよび遠心分離 (350 x g、8 分、4 ° C) の 1 つの mL で 2 回洗浄します。
   1. 脾細胞に必要な流フローサイト メーター パネルの数に基づいて異なるポリスチレン FACS チューブ均等に分割します。
2. ライブ/デッド細胞生存率染色するには、1x PBS および遠心分離機 (350 x g、8 分、4 ° C) の細胞を洗います。1 mL の 1x PBS に再懸濁します、細胞生存率を 1 μ l 添加染色 (材料表を参照してください)。4 ° C で 15 分間インキュベート (冷蔵庫や氷の上) の光から保護するために箔で覆われています。
3. 細胞生存の汚れ、インキュベーション中に MAC バッファーの適切なボリュームに染色細胞表面の抗体のカクテルを準備します。
4. 1 ml の遠心分離機 (350 x g、8 分、4 ° C)、MAC バッファーのセルを洗浄し、抗体のカクテルの 100 μ L を各細胞ペレットを再懸濁します。4 ° C で 30 分のためのライトから保護された孵化させなさい
   注:各フロー フローサイトメトリー抗体は、ユニークな非常に役に立つとそれぞれの特異抗体の線量の滴定曲線を実行することによって必要な抗体の最適な量を決定することをお勧めです。
5. 1 mL の MAC バッファーで 2 回細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる解析の MAC バッファーの適切な量で脾細胞を再懸濁します。

図 1は、上記説明の手順の概略を表します。CD11c の孤立したマウス脾臓を並べ+磁気細胞 48 h. CD11c の通常の塩メディア (NS; 150 モル塩化ナトリウム) または高い塩メディア (HS; 190 ミリ モル塩化ナトリウム) でメッキを並び替えで Dc+の Dc に対してレトロ軌道によって転送されるし、素朴な受信者マウスに注入。10 日後、マウスは 14 日の低用量アンジオテンシン II (140 ng/kg/分) 輸液の浸透圧ミニポンプを植え付けられます。アンジオテンシン II の 14 日間投与、中に血圧は無線テレメトリ データや尾カフ脈によって記録されます。

典型的な血圧解析を表す図 2 (バルバロら9から変更) に注入される次の Dc および低用量アンジオテンシン II 輸液の浸透圧ミニポンプの養子の転送。ノートでは、アンジオテンシン II の低投与量の (140 ng/kg/分) は通常のマウスの血圧を増加しませんサブ昇圧線量。マウス通常塩処理 CD11c の受信+ Dc (黒丸) 血圧を維持通常アンジオテンシン II 注入中に高い受信マウス塩処理 CD11c 中+収縮期血圧の増加は Dc (赤丸) 展示。図 2高塩が CD11c を扱われることを示しています+アンジオテンシン II のサブ昇圧線量に対して Dc プライム高血圧。

分離 CD11c の純度を決定する+セル、図 3Aに示すゲート戦略を使用してフロー フローサイトメトリー解析を行った。分かった CD11c の向上充実を実現合計脾細胞と比較して、+細胞 (図 3B)。図 4に製造元のプロトコルのトラブルシューティングを行う CD11c ビーズ濃度を利用しました。次の 100 μ L (図 4A) を使用して脾細胞の磁気分離は、200 μ L (図 4B)、または 300 μ L (図 4C) CD11c マイクロ ビーズの利回り約 65%、55%、および CD11c の 50%+

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