方法論記事

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

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DOI：

10.3791/59147

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2019年2月11日

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1Japan Science and Technology Agency (JST), PRESTO, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 4Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba

この記事について

サマリー

拡張期間にわたってシロイヌナズナ葉の蛍光ライブ イメージングを実行するためのシンプルで汎用性の高い方法を報告する.シロイヌナズナの遺伝子組換え植物免疫関連プロモーターの制御下で蛍光レポーターの遺伝子を表現する植物免疫応答の時空間の理解を得るための例として使用します。

要約

ゲノムワイドな転写リプログラミングに関連付けられている植物免疫応答、感染部位で開始されます。したがって、免疫応答は、空間的そして一時的に規制されています。自動蛍光顕微鏡との組み合わせで免疫関連プロモーターの制御下で蛍光遺伝子の使用は植物免疫の時空間的制御を理解する簡単な方法です。様々 な生体内蛍光イメージング実験の数のために使用されているルート組織と対照をなして浮遊微生物感染症の配列に遭遇葉組織のいくつかの蛍光ライブ イメージング例が存在します。したがって、拡張期間にわたって住セルイメージ投射のためのシロイヌナズナ植物の葉をマウントする簡単な方法を開発しました。Pathogenesis-Related 1 (防衛関連マーカー遺伝子のプロモーターの制御下で核局在化信号 (NLS) に黄色い蛍光蛋白質(YFP) genefused 形質転換シロイヌナズナ植物を使いました。PR1)。腐pv と遺伝子組換え葉を浸透させた。トマトDC3000 (avrRpt2) (Pst_a2) をひずみし、YFP シグナル自動蛍光顕微鏡を用いた 40 h の合計のための生体内タイムラプス イメージングを実行します。このメソッドは、植物免疫応答に関する研究のみならず、様々 な発達のイベントと葉組織で発生している環境の応答の分析にも利用できます。

概要

植物免疫応答を含む複数のトランスクリプションによって調整される動的転写リプログラム ホルモン1および要因。トランスクリプトーム データの蓄積は、植物の免疫システムの情報収集の機会を提供します: たとえば、シグナル伝達のネットワーク構造カスケード2。ただし、植物の免疫系時空のダイナミズムの知識限られた3,4、5が残っています。

以前の研究で防衛関連遺伝子発現の時空間的制御分析されているほとんどのままの交配および β-グルクロニダーゼ (GUS) レポーターの試金6,7、8を使用しています。これらのメソッドは、その場で興味のある様々 な遺伝子の転写活性化を可視化する私たちを有効にします。ただし、これらの手順は、標本の固定化を必要とし、したがって、すべての時空間情報の損失で。免疫力、時間をかけて進行状況などの生物学的イベント。ルシフェラーゼ レポーターとして使用が利益3のプロモーターのダイナミクスのキャプチャを有効にします。ただし、高価な基板と高感度検出器、ルシフェラーゼ アッセイが必要です。遺伝子組換えシロイヌナズナを生成した単純なプロシージャを使用して植物免疫応答の時空間の側面の私達の理解を高めるために黄色い蛍光蛋白質(YFP) を表現する植物遺伝子の融合、Pathogenesis-Related 1 (PR1)9防衛関連マーカー遺伝子のプロモーターの制御下で核局在化信号 (YFP NLS)。エフェクター トリガー免疫 (ETI)、特定の病原体感染9による植物免疫のフォームの中にしばしば発生するプログラム細胞死 (PCD) のプロセスをキャプチャするクロロフィルの自家蛍光、生きている細胞のマーカーを使いました。,10.シロイヌナズナ葉の生活などのオブジェクトを自由に移動で蛍光シグナルのダイナミクスを監視、複雑なイメージの社内構築や利用可能なソフトウェアの商業的処理が必要です。また、問題を解決する簡単な方法は、標本の移動を防ぐします。ここでは、自動蛍光顕微鏡下で長期的な観察のための形質転換シロイヌナズナ植物の葉を住んでいる取り付け用汎用性とシンプルな方法を考案しました。メソッドでは、土壌で栽培したそのままなプラント内ダイナミクス葉を数日間かけてプロモーターをキャプチャすることが出来ます。

プロトコル

注: それは睡眠を防ぐために重要なタイムラプス イメージング中にリビングの葉の動きをサンプリングします。葉の機械的応力を最小限に抑えるため、葉の穏やかな固定が必要です。唯一の適切に準備された葉のサンプル様々 な画像解析に適したタイムラプス画像を生成します。PR1遺伝子プロモーター (pPR1 YFP NLS 植物) と腐太陽光発電の制御の下でNLS YFP融合形質転換シロイヌナズナ植物を使用してプロトコル。トマトDC3000 (avrRpt2) 株 (Pst_a2) を例として説明します。

1 植物と病原体の準備

  1. オートクレーブ土とプラスチック電池プラグ トレイ (資材表) を入力します。
  2. セル (図 1A) あたり 1 つの形質転換シロイヌナズナ種子をまきます。
  3. 23 ° C で維持成長部屋にトレイを転送し、2-3 週間連続の白色光の下で植物を育てます。
  4. 病原体接種前 2 日間は連勝腐pv です。トマトDC3000 avrRpt2は、NYG 媒体 (ペプトン 5 g/L、3 g/L 酵母エキス、グリセリン 20 mL/L、15 g/L 細菌寒天、pH 7.0) 含む 100 mg/L リファンピシンおよび 50 mg/L カナマイシンにグリセロール ストックから (Pst_a2) を負担し、48 h 28 ° C の孵化させなさい。
  5. プラスチックの先端を使用して媒体の表面に表示される細菌細胞を採取、10 mM MgCl2を含むプラスチック製のチューブに転送、再懸濁します。600 で溶液の光学濃度 (OD) を測定 (外径600) nm。108コロニー形成単位 (CFU) 細菌細胞の最終的な細胞濃度を調整/外径600に通常対応する mL = 0.211。

2. 病原体接種

  1. 植物を傷つけることがなく 2-3 週齢の工場を含むセル プラグを慎重にカットします。空のセルのプラグトレイにセルを設定 (2 x 2 細胞は十分な) (図 1B) の良いバランスを維持します。
  2. 接種のため目に見えて健康的な葉を選択します。一般に、第 3、第 4、および第 5 葉 (#3 #4、#5図 1Cにそれぞれ) 植物の底から、扱いやすい。使用の良い再現性の実験のセットで同じ位置にある葉します。水土壌の長期のタイムラプス イメージング接種前に植物を保持します。
  3. 必要に応じて、 pPR1などストレス応答性プロモーターの解析の場合、植物、自然を強調したないように YFP シグナルの不在を確認する病原体接種前蛍光顕微鏡下葉を調べます。除外は、実験から示す YFP シグナルを残します。
  4. 病原体と直接接触を避けるために浸潤する前に使い捨てラテックス手袋を着用します。細菌懸濁液を葉の背軸側に潜入 1 mL 無針プラスチックのシリンジを使用して慎重に (108 CFU/mL)11 (図 1D)。葉の半分上の小さな部分の接種はpPR1活動の良い可視化を実現にします。浸透した地域が残りの葉と比較して色の濃い緑として表示されます。非常に浸潤時に葉に機械的な損傷が発生しないように注意します。
    注: 必ず浸透した地域にある全ての細胞間スペースが完全に病原体のサスペンションと成就 (垂直方向)それ以外の場合、PCD ドメインは蛍光顕微鏡の下で視覚化することは困難になります。これは単に浸透した地域における暗い緑化の完了によって確認できます。
  5. 柔らかい紙タオルで浸透した葉の浸透したセクションを周囲から細菌懸濁液の過剰を吸収します。

3. 接種葉の取付

  1. 接種後すぐに浸透した葉は、スライド ガラスの中央に位置して、サージカル テープ (資材表) を使用してプラスチック製のトレイをスライド ガラスを修正します。ガラス スライド (図 2A) 内接種葉身が完全に取り付けられていることを確認します。
  2. 二重プラスチック テープを準備 (0.2 mm 厚のテープの場合材料の表を参照) と 2 つにカット部分 (図 2B; 1 と 2 の部分) 浸透した葉の葉柄に沿ってスペースに合うように。図 2B図 2Aに示すように両方向矢印の長さに収まるように両方向の矢印で示されているこれらの 2 つの部分の長さを配置します。
    注: 2 つの部分のそれぞれからコーナーを切断葉身への損傷を回避できます (図 2B矢印; また 3.4 以下の手順を参照してください)。同じような厚さのプラスチック テープの任意の種類は、橋をかけて、葉柄に適しています。プラスチック テープの剛性は、次に示す手順の中に簡単に処理にとって重要です。
  3. 各部分のカットのコーナーに合わせます (図 2C) 葉身の基部とそのテープ作品 1 と葉柄のどちら側でも 2 の棒高級ピンセットのペアを使用して。テープ部分には葉柄や葉の刃が触れないことを確認します。
    注: 葉身の基部にこれらのプラスチック テープの二重部分はスペーサーとして機能し、取付中の葉柄に物理的なストレスを防ぐ。
  4. 図 2Bの両方向矢印のサイズに合わせて、テープ作品 1 と葉柄 (上にブリッジを形成する 2 の上に固執する二重プラスチック テープ (図 2B3 の部分) の追加部分を準備します。図 2D, E)。図 2D、Eで矢印で示された位置にテープ部分の直接間葉柄と葉のブレードをひかないように非常に注意します。
  5. 優しくサージカル テープ (図 2F作品 4) 葉身の先端スライド ガラス上の小片を貼るようなこと葉身は非常にそっとスライド ガラスに固定します。だけ強く押しガラス スライド (図 2F、赤色の破線で囲まれた領域) に直接触れるサージカル テープの部分、ない葉を覆う他の部分。
  6. 優しく、葉柄の国境でサージカル テープ (図 2G5 の部分) の別の小さい部分をスティックし、プラスチック テープ、その葉柄非常にそっとスライド ガラスとプラスチック テープの両方に作品を修正です (1、2、および 3) を個セットします。だけしっかりとスライド ガラスとプラスチック テープ部分 (図 2G、赤色の破線で囲まれた領域) にスライド ガラスに直接触れる施術の一部を添付しない葉柄を覆う他の部分。
  7. 200 μ L ピペット チップ (図 2H) を使用して顕微鏡の視野に移動するから隣接葉を防ぐため。優しく浸透した葉から近隣の葉を保持するために土壌にピペット チップを挿入します。可能なルート損傷を避けるため土壌に深く入りすぎてヒントを挿入しないように注意します。
    メモ: 準備の植物、蛍光顕微鏡イメージングのため準備ができています。

4. 顕微鏡によるタイムラプス観察

  1. 蛍光実体顕微鏡を入れます。
    注: ここでは、自動顕微鏡 1.4 メガピクセルの高感度モノクロ 12 ビット モードでデジタル カメラを使用装備 (材料表)。顕微鏡は、タイムラプス イメージング中に 23 ° C で室温を維持するために十分な換気とエアコン ユニットが装備暗い部屋または暗いキャビネットに配置必要があります。
  2. イメージングのための顕微鏡の対物レンズの下の上のスペースで植物を設定します。
  3. タイムラプス イメージング用パラメーターを設定 (表 1の例を参照してください)。露光のプログラム ステップ光植物免疫12の主要な影響を持っているので、時間経過イメージ投射の間隔期間中を確認してをください。
    1. 従来の YFP フィルター (励起 500 520 nm; 排出量 540-580 nm) を使用して、YFP シグナルを視覚化します。
    2. (励起 540-580 nm; 排出量 610 nm ロングパス) PCD ドメインが YFP 陽性細胞層9 (図 3に囲まれた暗い領域 (蛍光なし) として表示されるように、クロロフィルの自家蛍光を視覚化するテキサス赤 (TXR) フィルターを使用します。A)。
    3. 手順の追加の光暴露従来エピ明るいフィールドの設定を使用します。
      注: 実験前に、エピ明るい光源のパワーを測定し、自分の植物の成長の条件のレベルに調整。
  4. タイムラプス イメージング プログラムを実行します。数日間で長期的な観測は、たとえば、露光ステップの間に、適切な植物の水まきを検討してください。
  5. 画像取り込み後余分なチャンネル用光照射間隔 (表1 3 8 チャンネルに対応) でデータ セットからを省略します。フィジー9など別の画像解析ソフトウェアを使用して、関心領域 (ROI) 分析など、さまざまな方法でデータを分析します。

結果

ここでは、我々 はPst_a2を使用-タイムラプス イメージングのための例として ETI を誘発します。一連のうちいくつかは、図 3Bのとおり、イメージとコマ撮り映画 (補足の映画 1)9時間経過データが得られました。Pst_a2中 pPR1 YFP NLS を使用して実験の成功で- pPR1の一時的な活性化誘導 ETI は PCD のドメイン (図 3B) 細胞のいくつかの層で、巣を表現する YFP から明らかな観察されました。9. pPR1 PCD ドメインを通常周囲細胞の活性化約 5 時間ポスト接種 (hpi) 約 12 hpi のピークで起動し、最大 40 の hpi (図 3B)9を続きます。エピ蛍光システムを使用して画像を得たので、ここで得られた YFP シグナルは上と同様に表皮葉肉細胞を含むいくつかの向軸細胞層から生成されました。

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図 1: に細菌の病原体の侵入に使用するメソッド、シロイヌナズナを用いた葉。(A) セル成型トレイの 2-3 週齢シロイヌナズナ植物が栽培されました。(B) 1 個のセルを接続接種と観察に使用する選択したプラントはカットし、バランスを維持するために空のセル成型トレイに配置を含みます。(C)第 3、第 4、および第 5 葉 (#3 #4、#5 それぞれ) 画像解析に適しています。(D) 浸透病原体懸濁液の無針注射器を使用して選択した葉。浸透したエリアは、残りの葉より暗い緑の色に基づいて認識ができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: 浸潤のマウントに使用メソッドシロイヌナズナタイムラプス イメージングのための葉。(A) 接種葉の下に固定スライド ガラスを持つシロイヌナズナ植物の写真。浸透した葉は、スライド ガラスの中央に配置されました。両方向矢印は、プラスチック テープのスペーサーの長さを示します。(B) プラスチック テープのスペーサーと橋の準備。ダブル - 層状プラスチック テープを 2 つに切った、スペーサーのための小品 (1 と 2) と別の部分 (赤色の破線で囲まれ 3) 橋を準備するカットされました。双方向矢印の長さは、(A) の両方向矢印の長さとほとんど同じ。1 と 2、矢印で示された部分の 4 つのコーナーの 1 つが切られました。二重プラスチック テープ (1 と 2 の番号) の (C) 2 個セットは、葉柄と葉の刃が直接接触することがなく高級ピンセットのペアを使用して葉柄に沿ってスライド ガラス上に慎重に貼り付けていた。(D) 二重プラスチック テープ (3 番号)、(B) から作成されたの追加部分はテープ 1 と 2 の間の葉柄を引かないを確保しながら両方の基底のスペーサー (1 および 2)、葉柄にブリッジを形成する上に置かれました。矢印で示された位置。(E) 写真録音の葉柄。矢印で示された位置にプラスチック テープ部分の間に直接植物組織をキャッチすることが重要です。(F) A (番号 4) サージカル テープの小片は、葉身の先端周りスライド ガラスにそっと貼り付けられました。赤色の破線で囲まれた領域だけは、スライド ガラスの上にしっかりと押されました。サージカル テープ (番号 5) の (G) 別の小さい部分は優しく葉柄およびプラスチック テープ作品の枠に貼り付けられます。スライド ガラスとプラスチック テープの部分に、葉柄をそっと修正するため赤色の破線で囲まれた領域だけが押されました。(H) 2 使い捨てのピペット チップは、隣接葉が個人差のビューのフィールドに移動することを防ぐために使用されました。ピペット チップは、適切な位置に土壌に直接挿入されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 代表の結果を使用して、シロイヌナズナ取付方法葉。(A) 蛍光表面画像形質転換シロイヌナズナ葉 (pPR1 YFP NLS 工場)。葉の部分はPst_a2を浸透させた (108 CFU/mL) その米粒の表面に 22 時間接種 (hpi) で捕獲され、画像。PPR1プロモーターがアクティブ化された核 YFP フィルターを使用して検出し、テキサス赤 (TXR) フィルターを使用して、クロロフィルの自家蛍光の損失に基づいてプログラム細胞死 (PCD) が検出されました。スケール バー = 2.5 mm。 (B) ここで説明されているプロトコルを使用して取得した 800 の画像のコレクションから選択いくつかのコマ撮り画像。これらのデータは、40 hpi のpPR1活動の時空間ダイナミクスの体内の概要を提供します。YFP と TXR 画像のマージされた画像が表示されます。スケール バー = 2.5 mm。 (C) 遺伝子組換え葉 (pPR1 YFP NLS 工場) のモック浸透。モックの浸潤における 10 mM MgCl2タイムラプス イメージングによる先行している葉の背軸側に浸透していた。模擬治療異所性pPR1アクティビティが発生していないと 13 hpi でクロロフィルの自家蛍光を妨害しなかった。矢印は、モック浸潤の位置を示します。スケール バー = 2.5 mm.これらのイメージは、以前の研究9から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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表 1:本研究で用いたタイムラプス イメージング プログラム。

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補足映画 1: 時空間ダイナミクスを示す時間経過の映画pPR1遺伝子の活性化シロイヌナズナ次エフェクター トリガー免疫 (ETI) による葉Pst_a2接種。PPR1 YFP NLSコンストラクトを運ぶ遺伝子組換え葉の背軸側の部分だったPst_a2を浸透させた (108 CFU/mL)。40 h の合計は 3 分間隔で画像を取得しました。表示時刻スタンプは、形式 dd:hh:mm:ss.sss のです。この映画は、以前の研究9から変更されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

ディスカッション

シロイヌナズナ葉自動蛍光顕微鏡を使用して長期的な観察のための興味のプロモーターの制御下で蛍光レポーターの遺伝子を表現する生活をマウントする簡単な方法を報告する.ルートの組織に蛍光レポーターのタイムラプス観察が頻繁に実行されます。ただし、葉組織でのみ、いくつかの同様の研究を行った。葉は根は頻繁に埋葬、固体寒天媒体に固定されたに対し、空間で自由に移動することができるので、これは可能性が最も高い。

このレポートで ETI Pst_a2による中にpPR1活動の時空間ダイナミクスに着目。上記の詳細な葉の穏やかな固定、に加えてプロモーター活性化や PCD など携帯電話のイベントの時空間ダイナミクスを明確に可視化することが重要です。PPR1 活動と PCD を示す細胞間の区別はシャープではない場合、地区に浸透した間隙のすべては完全に病原体の懸濁液に満ちていることを確認 (手順 2.4 参照)。これは、以来、これらの顕微鏡標本の同じ垂直位置に沿ってすべての検出信号をキャプチャ全体フィールド蛍光実体顕微鏡を使用するときに重要です。クロロフィルの自家蛍光の上または PCD ドメイン内のセルの下に生き残った細胞からは簡単に蛍光を示すない死んだ細胞をマスクします。YFP シグナルのもです。

タイムラプス イメージングのための条件は、異なる実験条件の下でいくつかの予備的な実験を通して慎重に確立する必要があります。顕微鏡システム、遺伝子組換え植物病原体.などいくつかの要因に依存するタイムラプス イメージングのためのパラメーターこれらのパラメーターを得るためには、最初にpPR1の最初のライセンス認証とほぼ一致する 7 広島で浸透した葉で YFP シグナル強度のさまざまな露出時間を分析しました。5 s の露出は、この研究で使用される顕微鏡と YFP の信号をキャプチャするために適切なとして決定されました。クロロフィル蛍光イメージングの同様のテストを行った。試験片の 3 分間隔の間の光への露出は、最大露光時間を持つ通常の明視野イメージングとしてタイムラプス イメージング プログラムにプログラムされました。私たちのシステム (材料表) では、明視野イメージング、TXR、YFP に加えて 2.5 分を持っていることができました。この制約は、3 分間隔の選択の主な理由だった。次に、この時間経過状態植物のサンプルに明らかな破損は生じなかったし、異所性光ストレス関連の活性化pPR1 (図 3B、C) を誘発しなかったことを確認しました。これは本研究で使用したプログラムの開発につながった。したがって、蛍光イメージングの 3 分間隔とPst_a2の間にpPR1のダイナミクスをキャプチャするために十分な認め-ETI9を介する。

プロモーター記者構造蛍光レポーター、NLS に融合を特に利用されている多くのグループや研究コミュニティから容易に利用可能です。久保ら刊コンストラクトを用いてください。13。 ここで説明したプロトコルが葉組織を調べること、植物の生物学の研究で使用ことができます適切な遺伝子組換え植物が利用可能な場合したがって。私たちのシンプルで簡単なプロトコルで発生する生物学的イベントの時空間ダイナミクスを分析するために鋭敏である人のための絶好の機会を離れると、免疫応答などを提供します。説得力のあるテープの部分を用いて試料にわずかな物理的なストレスを誘導することです。ただし、この問題は、(図 3C) 実験にモックの治療など適切な正と負のコントロールを含めることによって制御できます。実験の条件は、さらに変更し、異なる条件の下でこれらのコントロールを分析することによって最適化できます。

近年、イメージング機器と技術の急速な発展は、生命現象の複雑な時空間的側面の研究者の興味を刺激しました。任意のイメージング解析適切な取り付け、試料の固定は、最も重要な課題の一つです。本研究で開発したシロイヌナズナ葉取付リビングのシンプルで汎用性の高いメソッドを適用し、様々 なイメージング実験用に最適化できます。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、日本科学技術振興機構によって支えられた [s ちゃん、N.N. に ERATOJPMJER1502 に PRESTO117665」と (補助金 [若手研究 (B)、研究活動スタート支援 [住ベに 22880008] 学術振興会23780040 住ベに])。優れたテクニカル サポート、pBGYN ベクトルを提供するためPst_a2株と t. 出村を提供する j. パーカー、A. 仙崎、鈴木裕、Y. 杉澤と E. 別役に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バクト寒天BD biosciences214010
バクトプロテアーゼ ペプトン No. 3BD biosciences211693
バクト酵母抽出物BD biosciences212750
BM2 土壌Berger
グリセロールナカライ テスク17017-35
カナマイシン硫酸和光113-00343
ライカM205FA、DFC365FX、LED_MCI、ライカEL6000(Las Xソフトウェア制御)カマイクロシステムズイエロー蛍光タンパク質(YFP)とテキサスレッド(TXR)フィルターが取り付けられています
塩化マグネシウム六水和物ワコー135-00165
マイクロスライドガラス(サイズ:76 mm、26 mm、厚さ:1.0 –1.2 mm)松波S1112
マイクロポアサージカルテープ (1.25 cm × 9 m)3M1530-0
無針 1 ml プラスチックシリンジテルモSS-01T
プラスチックセルプラグトレイ (セルサイズ:44 mm  &44mm &44 mm)田中産業htray-bk72任意の  同様のサイズのセルを持つトレイは
Rifampicin を使用できますnacalai tesque30259-81
プラスチックテープ (厚さ 0.2 mm × 幅 19 mm & 長さ 10 m)YamatoNo0200-19-1  同様の厚さのプラスチック/ビニールテープを使用できます
ライ

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