提示された方法は、ジャガイモの剥離葉にマンドゥカセクスタ幼虫の適用を通じて自然な手持ちの損傷植物組織を作成します。植物組織は、昆虫のハーブに対する早期応答に関与する6つの転写因子ホモロの発現のためにアッセイされる。
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この記事について
サマリー
要約
昆虫のハーブボリーの遺伝子発現研究の多重栄養性は、生物学的複製の多数を必要とし、より簡単で、より合理化されたハーブプロトコルの必要性を作成する。噛む昆虫の摂動は、通常、植物システム全体で研究されています。この生物戦略全体が普及しているが、同様の観測値を単一の剥離した葉に複製できる場合は必要ない。信号伝達に必要な基本的な要素は、リーフ自体の中に存在することを前提とします。シグナル伝達の初期の事象の場合、細胞は摂動からシグナルを受け取り、そのシグナルを遺伝子発現のためにアッセイされる隣接細胞に送信するだけで済みます。
提案された方法は、単にデタッチメントのタイミングを変更します。植物全体の実験では、幼虫は、最終的に植物から切り離され、遺伝子発現のためにアッセイされる単一の葉に限定されます。切除の順序が逆化した場合、植物研究全体の最後から、剥離研究の第1位まで、摂食実験が簡素化される。
ソラナム管状var.ケネベックは、単純な組織培養培地における節点転写によって伝播し、必要に応じてさらなる成長のために土壌に移される。葉は親植物から取り除かれ、摂食アッセイがM.sextaの幼虫期で行われるペトリ皿に移される。損傷した葉組織は、信号伝達における比較的初期の事象の発現のためにアッセイされる。遺伝子発現解析では、侵入特異的Cys2-His2(C2H2)転写因子を同定し、早期応答研究で剥離葉を用いた成功を確認した。この方法は、植物全体の侵入よりも実行が容易であり、より少ないスペースを使用します。
概要
ハーブは、植物が攻撃を識別し、その生存のための適切な応答をマウントすることができる一連の分子イベントを動かしています。植物は、昆虫を噛むから2つの基本的な手がかりを受け取ります。1つは組織への物理的損傷から、もう1つは昆虫特有の物質から。損傷関連分子パターン(AMP)は、幼虫の口部によって生み出される損傷に応答して放出され、ホルモンジャスモン酸の増加および防御遺伝子1の転写をもたらす明確に定義された創傷応答を引き起こす。最もよく知られているダンプの1つは、システミン、葉が傷ついた後に大きなプロシマリンタンパク質の切断によって形成されるポリペプチド2、3である。ジャスモン酸創傷応答は、毛虫唾液、腸中身(逆流)およびFEC(フラス)4に由来することができる、ハーブ動物関連分子パターン(HAMP)によってさらに調節される。昆虫は、防御応答5を高めるか、または回避するためにこれらの物質を使用します。転写因子は、下流防衛遺伝子6、7、8の調節を介して防御応答におけるホルモン信号からのメッセージを中継....
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プロトコル
注: 次のプロトコルは、1 人のユーザーがセットアップし、観察を行い、サンプルを収集するように設計されています。同じセットアップの複数の実行を組み合わせて生物学的複製を増やすことができます。実験の追加の繰り返しは、遺伝子発現に対する可能な日次的影響を排除するために、1日の同時に設定する必要があります。プロトコルは、5つの別々の収穫時間ポイントのための3つの「出没」葉を作成するように設計されています。各タイム ポイントの一致したコントロール リーフは、合計 30 個のサンプルを作成します。実験は、様々な葉の大きさと幼虫の段階で行うことができますが、葉の大きさ、幼虫の段階および侵入時間は、手順全体を通して一貫していることをお勧めします。
ジャガイモ植物の調製
注:滅菌技術を必要とするすべてのステップは、組織培養フード18、19で行う必要があります。
- 植物の供給源からケネベックの植物を準備します。
- 伝播媒体を準備する。
- ムラシゲとスコウグ(MS)の4.43gをビタミンパウダーで加え、スクロース20g、寒天2gを1Lの逆浸透(RO)精製水に代用し、スピンバーで2Lフラスコに入れます。フラスコを攪拌プレートに移し、混ぜます。攪拌を続けながら、NaOHを使用してpH....
- 伝播媒体を準備する。
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結果
リーフ消費は、プロトコルの成功を定義します。健康で正確にステージングされた幼虫は、葉の表面に配置した直後に摂食を開始し、摂食は、侵入時間を通じてかなり一貫した方法で継続する必要があります。ビデオ1では、上部の幼虫は配置直後に噛み始め、摂食中に一貫した速度を維持する。これは、侵入後の早期遺伝子発現事象をアッセイする場合に特に重要である。底部の幼虫は葉の材料を消費しなかったし、失敗した侵入の例です。
葉の消費中の視覚的近似は十分な損傷が作り出されることを保障するために監視される。消費される葉の材料の量は、侵入前後の葉の画像を使用して損傷の割合として計算することができます。図2は、異なる種類のジャガイモ植物におけるM.セクスタ幼虫の異なる発達段階による消費の変動率を示す。図2Aの葉は、2週.......
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ディスカッション
既存の植物全植物のハーブの方法論の使用は、この特定の研究の目標を達成するために必要としない(すなわち、侵入に対する応答のための候補遺伝子のセットをスクリーニングする)。剥離した葉の精製の明らかな利点は、ハーブアッセイを行うのにかかる時間を短縮することである。クリップケージを持つ植物全体の扱いにくい性質は排除され、2週間の若い植物は葉を収穫するために使用することができるので、アッセイは、より早く行われます。また、給餌中にはるかに小さなフットプリントと少ない成長室スペースを必要とします。これらのリソースが限られている場合は、どちらも重要です。
このアッセイの限界、すなわち剥離は、防御遺伝子発現がアッセイされるときに遭遇する。剥離自体が創傷反応を引き起こすので、剥離が防御遺伝子発現の基底レベルにどのような影響を及ぼすかを評価することが重要である。模擬ハーブを含む1つの研究では、よく知られている防御遺伝子プロテアーゼ阻害剤II(PIN2)の転写レベルは、「葉の採取中に引き起こされる創傷」に起因する可能性が高い剥離ジャガイモの葉の対照葉において予想外に高かった。
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
著者らは、この研究で使用される昆虫を提供し、幼虫のステージングに関する専門知識を提供してくれたボブ・ファラーとアレクシス・パークに感謝したいと思います。原稿の批判的なレビューのためのマイケル・ブラックバーンとサイカト・ゴーシュに感謝します。
本書における商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的でのみ行われ、米国農務省の勧告または推奨を意味するものではありません。
USDAは機会均等プロバイダーであり、雇用主です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 寒天代替品 | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | 製品は、Gelzan |
| 格納容器(6,12または24ウェルディッシュ) | Fisher Scientific | 08-772-49、08-772-50、08-72-51 | 企業がこれらの製品を販売 |
| マンドゥカエッグ | カロライナバイオロジカルサプライ | カンパニー143880 | 30-50卵 |
| manduca卵 | 五大湖のホーンワーム | NA | 50、100、250または500卵 |
| manducaの幼虫 | カロライナ生物学的供給会社の | 特定の幼虫のinstarの要求 | 任意の |
| instar manducaの幼虫五 | 大湖のホーンワーム | の特定の幼虫のinstarの要求 | 任意のinstar |
| 遠心チューブ、1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | 、液体N2でテストされており、 |
| むらしげ&爆発しませんSkoog(MS)基礎媒体w /ビタミン | PhytoTechnology Laboratories | M519 | 、繁殖培地 |
| 栄養素寒天混合物 | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | 製品を作るために使用されますSkoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | フィッシャーサイエンティフィック | 09-805A | Whatmanサークル-ペトリ |
| 皿、60X15 mmまたは100X15 mm | ッシャーサイエンティフィック | FB0875713AまたはFB0875712 | の購入サイズ |
| 任意の | Bサイズ(非有機) | はメイン州の農家を示唆していますs交換 | |
| ポット、10" | グリフィン温室供給株式会社 | 41PT1000CN2 | |
| 防腐剤/殺生物剤 | 植物細胞技術 | NA | 製品は、PPM(植物防腐剤混合物) |
| 種芋の外植片ソース | 任意の | Bサイズ(有機ではない) | メイン州の農家を示唆していますs交換 |
| 徐放性肥料(14-14-14) | 任意の | NA | オスモコートは、人気のブランド名 |
| ソフトタッチ鉗子 | BioQuip | 4750 | |
| 土壌ミックス | グリフィン温室用品株式会社です。 | 65-51121 | 製品はサンシャインLC1ミックス |
| 無菌培養容器 | ファイトテクノロジー研究所 | C2100 | マゼンタ型容器、PTL-100 |
| 無菌培養容器 | フィッシャーサイエンティフィック | ICN2672206 | 製品はMP Biomedicals Plantcon |
参考文献
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.
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再版と許可
