噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

サマリー

提示された方法は、ジャガイモの剥離葉にマンドゥカセクスタ幼虫の適用を通じて自然な手持ちの損傷植物組織を作成します。植物組織は、昆虫のハーブに対する早期応答に関与する6つの転写因子ホモロの発現のためにアッセイされる。

要約

昆虫のハーブボリーの遺伝子発現研究の多重栄養性は、生物学的複製の多数を必要とし、より簡単で、より合理化されたハーブプロトコルの必要性を作成する。噛む昆虫の摂動は、通常、植物システム全体で研究されています。この生物戦略全体が普及しているが、同様の観測値を単一の剥離した葉に複製できる場合は必要ない。信号伝達に必要な基本的な要素は、リーフ自体の中に存在することを前提とします。シグナル伝達の初期の事象の場合、細胞は摂動からシグナルを受け取り、そのシグナルを遺伝子発現のためにアッセイされる隣接細胞に送信するだけで済みます。

提案された方法は、単にデタッチメントのタイミングを変更します。植物全体の実験では、幼虫は、最終的に植物から切り離され、遺伝子発現のためにアッセイされる単一の葉に限定されます。切除の順序が逆化した場合、植物研究全体の最後から、剥離研究の第1位まで、摂食実験が簡素化される。

ソラナム管状var.ケネベックは、単純な組織培養培地における節点転写によって伝播し、必要に応じてさらなる成長のために土壌に移される。葉は親植物から取り除かれ、摂食アッセイがM.sextaの幼虫期で行われるペトリ皿に移される。損傷した葉組織は、信号伝達における比較的初期の事象の発現のためにアッセイされる。遺伝子発現解析では、侵入特異的Cys2-His2(C2H2)転写因子を同定し、早期応答研究で剥離葉を用いた成功を確認した。この方法は、植物全体の侵入よりも実行が容易であり、より少ないスペースを使用します。

概要

ハーブは、植物が攻撃を識別し、その生存のための適切な応答をマウントすることができる一連の分子イベントを動かしています。植物は、昆虫を噛むから2つの基本的な手がかりを受け取ります。1つは組織への物理的損傷から、もう1つは昆虫特有の物質から。損傷関連分子パターン(AMP)は、幼虫の口部によって生み出される損傷に応答して放出され、ホルモンジャスモン酸の増加および防御遺伝子1の転写をもたらす明確に定義された創傷応答を引き起こす。最もよく知られているダンプの1つは、システミン、葉が傷ついた後に大きなプロシマリンタンパク質の切断によって形成されるポリペプチド2、3である。ジャスモン酸創傷応答は、毛虫唾液、腸中身(逆流)およびFEC(フラス)4に由来することができる、ハーブ動物関連分子パターン(HAMP)によってさらに調節される。昆虫は、防御応答5を高めるか、または回避するためにこれらの物質を使用します。転写因子は、下流防衛遺伝子6、7、8の調節を介して防御応答におけるホルモン信号からのメッセージを中継する。

実験室の設定で使用される植物昆虫の相互作用研究の中には、昆虫による自然な摂食方法を近似する目的で、シミュレートされたタイプの植物と昆虫の相互作用研究があります。模擬ハーブは、通常、ダンプの放出を引き起こし、防御遺伝子の産生を引き起こすのに十分な昆虫の口分けの特定のメカニズムを模倣する様々なツールを使用して植物組織に人工的な損傷を作成することによって達成されます。口腔分泌物や逆流剤などの他の昆虫特異的成分は、多くの場合、HAMP9、10、11からの寄与を複製するために追加される。特定のサイズと創傷のタイプの作成と正確な量のHAMPの適用は、研究のこれらのタイプの1つの利点であり、より再現性の高い結果を提供することができます。植物組織への損傷が被養昆虫や実験室で飼育された昆虫の適用によって達成される自然なハーブ類研究は、創傷サイズとHAMP量が昆虫の行動によって支配され、変動性を追加するので、しばしばより困難である。データ。自然対シミュレートされた方法とその長所と短所は、文献12、13、14でよく議論されています。

転写因子などの早期シグナル伝達事象を研究するには、葉の一定の割合を比較的短い時間で消費する必要があるため、幼虫はすぐに噛み始め、葉が分析のために凍結されるまで消費を維持する必要があります。M.sextaは、その幼虫の段階の多くの間に複数のソラナス植物の貪欲なフィーダーであり、比較的短い^時間15で最大ダメージを与えるのに理想的です。これは、昆虫が葉面16、17に接触した直後に植物応答が起こるので、早期シグナル伝達事象を研究する際に便利である。封じ込めの一般的に使用されるクリップケージの方法は、複数のケージが幼虫の除去または追加を可能にするために実験全体を通して継続的な調整を必要とするように、不器用であることを証明します。葉はまた、同時に複数の昆虫の餌を支えるのに十分な大きさと強さでなければなりません。これらのタイプのジャガイモ植物は、摂食を観察するために大量のスペースを必要とします。幼虫はしばしば葉の表面の下側に移動し、また摂食観察を非常に困難にします。これらの実験を行うために植物全体を使用することは明らかに面倒です。

現在の研究では、植物全体ではなくペトリ皿に分離された剥離葉を使用して、ハーブを研究するための植物全体のアプローチを合理化し、簡素化しています。本研究におけるプロトコルの適用は、M.セクスタ幼虫による生体損傷後のジャガイモ葉の早期誘導C2H2転写因子の群の観察に限定される。

プロトコル

注: 次のプロトコルは、1 人のユーザーがセットアップし、観察を行い、サンプルを収集するように設計されています。同じセットアップの複数の実行を組み合わせて生物学的複製を増やすことができます。実験の追加の繰り返しは、遺伝子発現に対する可能な日次的影響を排除するために、1日の同時に設定する必要があります。プロトコルは、5つの別々の収穫時間ポイントのための3つの「出没」葉を作成するように設計されています。各タイム ポイントの一致したコントロール リーフは、合計 30 個のサンプルを作成します。実験は、様々な葉の大きさと幼虫の段階で行うことができますが、葉の大きさ、幼虫の段階および侵入時間は、手順全体を通して一貫していることをお勧めします。

ジャガイモ植物の調製

注:滅菌技術を必要とするすべてのステップは、組織培養^{フード18、19}で行う必要があります。

1. 植物の供給源からケネベックの植物を準備します。
   1. 伝播媒体を準備する。
      1. ムラシゲとスコウグ(MS)の4.43gをビタミンパウダーで加え、スクロース20g、寒天2gを1Lの逆浸透(RO)精製水に代用し、スピンバーで2Lフラスコに入れます。フラスコを攪拌プレートに移し、混ぜます。攪拌を続けながら、NaOHを使用してpHを5.8に調整します。
         注:寒天はオートクレーブが行われるまで溶解しません。
      2. 保存料/殺生物剤の1 mLを液体サイクルに20分間加えます(121°C,101.3 kPa)。サイクルが終了した直後にオートクレーブから培地を取り出し、50°Cまで冷却します。無菌および冷却された伝播媒体の100 mLを、組織培養フード内の滅菌技術を用いて無菌培養容器(例えば、マゼンタまたはプラントコン)に移す。
   2. プラント材料を準備します。
      1. ケネベック種子ジャガイモとして引き抜きソースを取得し、タップH₂O.で洗浄することにより、土壌のすべての痕跡を除去し、無菌メスで2cmの部分にカットします。
      2. 70%エタノールに15sを浸し、続いて1:1漂白剤で13分(1部RO水:1部濃縮殺菌/商業グレードの漂白剤)で芽を出します。無菌H2Oで5回すすいでくす。
      3. 生殖不能技術を用いて組織培養フードに伝播培地を用いて生殖組織培養容器に移植する。血管を植物組織培養室に移し、2\u20123週間、または植物が24°C、16h光(140μmol·m-2·s-1)/8h暗い光周期で形成されるまで成長する。
2. 節行組織培養ジャガイモ植物を準備します。
   1. 節行伝達媒体を準備する。
      注:これは、同じ日に使用することができるか、または前もって作られ、節行転写まで4°Cで保存することができる10の組織培養容器を作ります。
      1. 36.43 gの栄養寒天ミックスを、スピンバー付きの2Lフラスコに1LのRO精製水に加えます。フラスコを攪拌プレートに移し、混ぜます。攪拌を続けながら、KOHを使用してpHを5.8に調整します。
         注:寒天はオートクレーブが行われるまで溶解しません。
      2. 液体サイクルで20分間オートクレーブ(121 °C、101.3 kPa)。サイクルが終了した直後にオートクレーブから培地を取り出し、50°Cまで冷却します。無菌培養容器内の滅菌技術を用いて無菌培養容器(材料の表を参照)に滅菌冷却された円節転写剤の100mLを移す。
   2. 節行カットを準備します。
      1. 植物由来の植物を栽培するケネベックの植物を入手する(ステップ1.1.2で製造)。プラントレットには、少なくとも 3 ~ 4 つのノード (分岐点) が必要です。生殖不能のはさみやメスを使用して葉を取り除きます。主幹の近くに枝を切り、約2mmの枝組織を残す。
      2. 各分岐点またはノードの上下に約2mmを切断することにより、茎から節点のセクションを削除します。前の容器と同じ向きで、節行伝達媒体(ステップ1.2.1.2で生成)を含む無菌組織培養容器内に節行切断を配置します(分岐は上向き)。
      3. 結節切断を伴う血管を植物組織培養室に移し、24°C、16h光(140μmol·m-2·s-1)/8h暗い光周期で2\u20123週間成長する。
         注:各節点切断は、新しい植物に成長します。各容器の切断の数は葉のサイズを決定する。容器ごとの切り取りが少ない切断は、より大きな葉をもたらす。1容器あたり3つの植物は2\u20123週間で15ミリメートルx20ミリメートルの葉を持つことになります。
3. (オプション)栽培されたケネベックジャガイモの植物を作った土壌を準備します。
   注:より大きな葉を生産するために、節点伝播ジャガイモ植物を土壌に移すことができます。
   1. すべての根組織が寒天から放出されるまで、培地から植物を穏やかに引っ張って、節行伝達媒体で成長したジャガイモ植物を土壌に移す。
   2. 根から第1ノードのすぐ上の土壌に移し、移植の周りの土壌を軽く詰めます。土壌が根系と接触することを保障するために穏やかに水。
   3. 16h光(140 μmol·m^-2·s-1)/8 h暗い光周期および25/20 °C昼/夜の温度の成長室に置く。
      注:植物は、上部2つの完全に膨張した葉がアッセイに適したサイズに達したときに準備ができています。
4. (オプション)塊茎栽培のジャガイモ植物を準備します。
   注:塊茎から成長したジャガイモの植物は、より大きく、より堅牢であり、植物に幼虫を飼育する場合、または一晩幼虫の摂食が望ましい場合に役立ちます。
   1. 10 mLペレットの遅い放出肥料を補充した土壌ミックスを含むポットに10の深部にジャガイモ塊茎6を置きます。
   2. 16h光(140 μmol·m^-2·s-1)/8 h暗い光周期および25/20 °C昼/夜の温度の成長室に置く。植物は塊茎の植え付けから約30\u201240日の準備ができています。
      注:花を咲かせ始めた植物は使用しないでください。

2. 餌付け用昆虫の調製

1. M.セクスタの所望の幼虫期を得る。
   注:この研究のための幼虫は、第5イン^スター20を通じて人工的な食事で飼育され、社内昆虫の経験豊富な個人によってステージングされました。幼虫はまた、植物組織上で部分的または完全に飼育されてもよい。幼虫はモルトの直前に食べないし、モルトの直後に食べる可能性が最も高いので、適切なステージングが重要です^21.
2. 幼虫を適切な封じ込め容器(例えば、6-、12-、24ウェル組織培養皿)に幼虫を移す。料理には1匹の幼虫が1匹あるはずだ。
   注:幼虫は食料源なしで領土やカニバリズムの行動を示す可能性があり、一緒に収容すると負傷する可能性があります。
3. (オプション)これは幼虫の摂食を改善するかもしれないので、2時間まで幼虫を飢えさせる。
   注:幼虫は、この時間の間に成長室に格納された格納容器にする必要があります。

3. 侵入実験用のコンポーネント設定

注:図 1の回路図の概要を参照してください。

1. 収穫時間ごとに配置テンプレートを作成します。
   注:収穫時間ごとに5つの異なるトレイを設定すると便利です。これはサンプルを整理し、皿が彼らの配置を変えることなくセットとしてより効率的に動かすことを可能にする。ダメージ率の計算を実行する場合は、侵入前と侵入後の画像を同じ焦点距離でキャプチャする必要がある場合に不可欠です。
   1. 6つの適切な大きさのペトリ皿のセットを保持し、白い紙とラインを保持することができる5頑丈なトレイを取得します。
      注:ペトリ皿のサイズは、供給アッセイのために選択された葉のサイズに基づいています。葉は側面に触れることなく、皿に簡単に収まるはずです。例えば、60 mm x 15 mm の皿は、長さまたは幅が 50 mm までの葉に適しています。
   2. 各トレイの用紙に適切な大きさのペトリ皿を使用して、6つの円のセットをトレースします。一組の円に「コントロール」A、B、C、もう一方の「出没」A、B、Cにラベルを付けます。また、各配置テンプレートに適切な収穫時間のラベルを付けます。
2. (オプション)「侵入前」と「侵入後」の画像キャプチャ用のカメラを設定します。
   1. 配置テンプレート内のすべてのペトリ皿の画像キャプチャのための適切な焦点距離でスタンドにカメラを固定します。
3. 収穫時のポイントチューブにラベルを付けます。
   1. 配置テンプレートの各円に対応する30、1.7 mLマイクロ遠心管のセットにラベルを付けます。管にラベルを付け、摂動(制御/出没)、植物複製文字(A、BまたはC)および収穫時期(侵入後の分数)を適切に識別します。
4. ステップ3.1.1で選んだペトリ料理を準備します。
   1. ステップ3.1.1から30ペトリ皿のそれぞれに滅菌フィルターペーパーディスクを置きます。ディスクを湿らせる滅菌水を追加します。余分な水を皿に溜まさないようにしてください。各配置テンプレートの6つの円のそれぞれに各料理を配置します。
   2. 各配置テンプレートの横に3つのジャガイモ植物を配置します。植物がすべて同じ年齢と相対的なサイズであることを確認します。

4. 侵入の実行

注: 1 つの収穫時間ポイント/配置テンプレートが一度に設定されます。

1. 滅菌はさみで各植物から上の2つのサイズ一致した葉を取り除き、コントロールペトリ皿に1枚の葉を置き、各植物(A、B、C)に出没したペトリ皿に1枚を置きます。このプロセスをできるだけ早く実行します。
2. (オプション)配置テンプレートをカメラスタンドに転送して、「侵入前」の画像をキャプチャします。
3. できるだけ早く柔らかいタッチ鉗子を使用して、各出没した皿に幼虫を転送します。目的の「侵入」時間のタイマーを設定します。
   注:幼虫が葉組織を消費している期間は「侵入時間」です。これは、実際の侵入の開始前にいくつかのテストの葉/幼虫を使用して経験的に決定することができるものです。選択された「侵入時間」は、すべての出没した葉に対して一貫している必要があります。
   注:幼虫は柔らかいタッチ鉗子によって注意して扱われるべきである。第2〜第4の星は、彼らの角または中間部によって穏やかにつかむことがあります。
4. すべての幼虫が食べていることを確認するために摂食を観察してください。幼虫は摂食行動に基づいて追加/除去する必要があります。ペトリ皿の蓋はできるだけおおおおおお手入れしてください。
   注:葉ごとに複数の幼虫を使用することができる。
5. 侵入時間の終わりに葉から幼虫を取り除きます。収穫時間のタイマーを開始します。
6. (オプション)配置テンプレートをカメラスタンドに転送して、「侵入後」の画像をキャプチャします。
   注:配置テンプレート内の6つの葉はすべて、特定の収穫時に収穫されます。

5. 葉の収穫

1. 各収穫時点の終わりに対応するラベル付きチューブに各葉を転送し、すぐに液体N2にチューブをドロップすることによって凍結します。RNAを単離するまで-80°Cで収穫した植物組織を保存します。
2. 収穫時間ごとに手順 4\u20125.1 を繰り返します。

6. 遺伝子発現解析のための葉組織の処理

1. 冷凍葉組織をマイクロペストルで粉末状に粉砕する。
2. 前述^の22として遺伝子発現のための総RNAおよびプロセスを単離する。

7. (オプション) 葉の損傷を推定する

1. 葉の損傷率を視覚的に推定するか、侵入前および後の画像の葉面積を計算します。
2. ソフトウェアツール(例えば、フェノ^{フィート)23}で葉面積を測定します。
3. リーフエリアの測定値から、損傷のパーセンテージを計算します。
   ダメージ率 = [(葉前 - リーフ面積の後)/リーフ面積前] x 100.

結果

リーフ消費は、プロトコルの成功を定義します。健康で正確にステージングされた幼虫は、葉の表面に配置した直後に摂食を開始し、摂食は、侵入時間を通じてかなり一貫した方法で継続する必要があります。ビデオ1では、上部の幼虫は配置直後に噛み始め、摂食中に一貫した速度を維持する。これは、侵入後の早期遺伝子発現事象をアッセイする場合に特に重要である。底部の幼虫は葉の材料を消費しなかったし、失敗した侵入の例です。

葉の消費中の視覚的近似は十分な損傷が作り出されることを保障するために監視される。消費される葉の材料の量は、侵入前後の葉の画像を使用して損傷の割合として計算することができます。図2は、異なる種類のジャガイモ植物におけるM.セクスタ幼虫の異なる発達段階による消費の変動率を示す。図2Aの葉は、2週...

ディスカッション

既存の植物全植物のハーブの方法論の使用は、この特定の研究の目標を達成するために必要としない(すなわち、侵入に対する応答のための候補遺伝子のセットをスクリーニングする)。剥離した葉の精製の明らかな利点は、ハーブアッセイを行うのにかかる時間を短縮することである。クリップケージを持つ植物全体の扱いにくい性質は排除され、2週間の若い植物は葉を収穫するために使用することができるので、アッセイは、より早く行われます。また、給餌中にはるかに小さなフットプリントと少ない成長室スペースを必要とします。これらのリソースが限られている場合は、どちらも重要です。

このアッセイの限界、すなわち剥離は、防御遺伝子発現がアッセイされるときに遭遇する。剥離自体が創傷反応を引き起こすので、剥離が防御遺伝子発現の基底レベルにどのような影響を及ぼすかを評価することが重要である。模擬ハーブを含む1つの研究では、よく知られている防御遺伝子プロテアーゼ阻害剤II(PIN2)の転写レベルは、「葉の採取中に引き起こされる創傷」に起因する可能性が高い剥離ジャガイモの葉の対照葉において予想外に高かった。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天代替品	PhytoTechnology Laboratories	G3251	製品は、Gelzan
格納容器(6,12または24ウェルディッシュ)	Fisher Scientific	08-772-49、08-772-50、08-72-51	企業がこれらの製品を販売
マンドゥカエッグ	カロライナバイオロジカルサプライ	カンパニー143880	30-50卵
manduca卵	五大湖のホーンワーム	NA	50、100、250または500卵
manducaの幼虫	カロライナ生物学的供給会社の	特定の幼虫のinstarの要求	任意の
instar manducaの幼虫五	大湖のホーンワーム	の特定の幼虫のinstarの要求	任意のinstar
遠心チューブ、1.7 ml	Thomas Scientific	1158R22	、液体N2でテストされており、
むらしげ&爆発しませんSkoog(MS)基礎媒体w /ビタミン	PhytoTechnology Laboratories	M519	、繁殖培地
栄養素寒天混合物	PhytoTechnology Laboratories	M5825	製品を作るために使用されますSkoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan
paper filter discs	フィッシャーサイエンティフィック	09-805A	Whatmanサークル-ペトリ
皿、60X15 mmまたは100X15 mm	ッシャーサイエンティフィック	FB0875713AまたはFB0875712	の購入サイズ
	任意の	Bサイズ(非有機)	はメイン州の農家を示唆していますs交換
ポット、10"	グリフィン温室供給株式会社	41PT1000CN2
防腐剤/殺生物剤	植物細胞技術	NA	製品は、PPM(植物防腐剤混合物)
種芋の外植片ソース	任意の	Bサイズ(有機ではない)	メイン州の農家を示唆していますs交換
徐放性肥料(14-14-14)	任意の	NA	オスモコートは、人気のブランド名
ソフトタッチ鉗子	BioQuip	4750
土壌ミックス	グリフィン温室用品株式会社です。	65-51121	製品はサンシャインLC1ミックス
無菌培養容器	ファイトテクノロジー研究所	C2100	マゼンタ型容器、PTL-100
無菌培養容器	フィッシャーサイエンティフィック	ICN2672206	製品はMP Biomedicals Plantcon