強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して > 単一の実験で 1,000 TFs。
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方法論記事
人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
各人間の遺伝子を調節する転写因子 (TFs) のセットを識別するは、多数の実験と計算のアプローチの統合を必要とする困難な作業です。このような 1 つの方法は、酵母 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の領域、レポーター遺伝子を用いた酵母核の環境でテストします。Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば.、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子の活性化のため上映することができます。Y1H 画面を実行する最も公開されたプロトコルは DNA 餌酵母に TF 獲物ライブラリまたは配列の変換に基づいています。ここでは、パイプラインについて述べる、強化された Y1H と呼ばれる (eY1H) 試金、TF 獲物系統高密度配列を使用して配列コレクションを持つ DNA 餌株を交配による TF DNA の相互作用を尋問するところ、1,536 のスクリーニングができる (HDA) ロボットプラット フォームコロニーの形式です。これにより、スループットが劇的に増加 (60 DNA 餌系列 > 1,000 TFs 研究員あたり 2 週間はかかる) と再現性。画面とそれらの解決方法の中に発生する問題の例と同様、1,086 人間 TFs の配列に対してヒトプロモーター配列をテストすることによって期待される結果の種類を示しています。
概要
バイオメディカル分野で中心的な問題は、各人間の遺伝子を調整するメカニズムを決定します。転写は遺伝子発現を制御する最初のステップと対象の各遺伝子は、転写因子 (TFs) の規制を受けます。人間はエンコードのことを考える > 1,500 TFs1、2、各遺伝子の発現を制御する TFs の完全なセットを識別する開かれた挑戦に残る。
TF DNA の相互作用をマップする 2 種類の方法を使用できます: TF 中心と DNA の方法3 (図 1 a)。TF を中心とした方法でまたは DNA 結合特異性を決定するゲノム DNA 領域にバインドするための関心の TF がプローブされます。これらのメソッドには、クロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて高スループット シーケンス、タンパク質結合マイクロ アレイと SELEX4,5,6が含まれます。DNA を中心とした方法では、DNA 配列に結合する TFs のセットを決定する興味の DNA シーケンスがプローブされます。このようなメソッドの....
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プロトコル
1. 準備
-
Sc −U アリルメ プレート (150 mm ペトリ皿)
注:これらのプレートは、DNA 餌酵母菌の成長のために使用されます。- ドロップ アウト ミックス、イースト窒素ベース (YNB)、アデニン hemisulfate 920 mL の水、5.9 (メディアのリットル当たり 1 mL; 構成の表 2を参照してください約) 5 M NaOH で pH のアンモニウムの硫酸塩を溶解します。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。
- 2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。
- 液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。
- すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。グルコースを追加撹拌プレートによく混合し、55 ° C の水浴中にクールします。
- ロイシンとトリプトファンをメディアに追加します。撹拌プレートによく混ぜ、150 mm 滅菌シャーレ (一皿 〜 80 mL) に注ぐ。室温で 3-5 日間の乾燥、ポリ袋でラップし、常温で 6 ヶ月保存します。
- YAPD 長方形プレート
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結果
EY1H 試金から結果の分析と 3 つの主な要因を考慮すべき: DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動、TF DNA の相互作用、および肯定的なコロニーの数に対応するレポーターの活動の強さ。DNA の餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動 (すなわち、autoactivity) は、全体的な成長と TF 獲物がない場合でも、読み出しプレートの酵母コロニーの色を指します。理想的には、非 autoactive 系統表示背景白または茶色色、肯定的な相互作用のための植民地とされている大きくて青い。Autoactive DNA 餌系統はヒスチジンと X gal の存在下で DNA 餌8酵母転写活性化因子の結合に関連している可能性が高い板のすべてのコロニーのための青の色に欠けているメディアで酵母の増殖を示します。検出された TF DNA の相互作用に対応する記者活動 (すなわち、コロニーのサイズ) と青色の強度の強度親和性、酵母で TF の発現レベル、サイトとの距離をバインドの数などの多くのパラメーターに依存します。ある酵母の最小プロモーター レポーター遺伝子と DNA 餌ひず.......
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ディスカッション
ここで大きく説明ロボット eY1H 交尾スクリーニング アプローチは、以前のライブラリ スクリーニングと比較して興味や変換に基づく配列スクリーニング アプローチの DNA 領域にバインド TFs のセットを識別するためにスループットを向上します。アッセイは、TF ごとにテストしたすべての 4 つの植民地のために積極的、相互作用の 90% は同じ酵母 DNA 餌ひずみ10の独立した画面で再テストの相互作用の 90% が検出された再現性の高い eY1H によって検出された TF DNA 相互作用さらに、,12,19しますさらに重要なのは、eY1H によって検出された TF DNA の相互作用は人間レポーターの試金12,20、ひと初代細胞 (未発表結果)、およびc. の elegansノックアウト動物をテストしたときの 40.......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
この作品は、健康の国民の協会 [J.I.F.B. に R35-GM128625] によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3AT) ~95% TLC | シグマ | A8056-100G | HIS3遺伝子の製品のための競合阻害剤 |
| アデニン硫酸塩(半硫酸塩)、二水和物 | 米国生物製剤 | A0865 | 適切な酵母成長に必要 |
| 寒天高ゲル強度-細菌学グレード | 米国国際化学 | AGHGUP | 酵母成長のための栄養培地 |
| 硫酸アンモニウム | US Biologicals | A1450 | 合成酵母培地中の窒素源 |
| D+ グルコース 無水 | US Biologicals | G3050 | 酵母の成長に必要 |
| ドロップアウトミックス マイナス His、Leu、Tryp、Uracil、アデニンリッチ w/o 酵母窒素ベース | US Biologicals | D9540-02 | 酵母成長エッジに必要な合成完全培地 |
| マルチパラメータpHメーター | Hanna Instruments | HI2020-01 | 選択的な媒体のpHを測定するには |
| フラットつまようじ 750カラット | ダイヤモンド | ペトリディッシュに酵母を縞 | |
| ガラスビーズ | ウォルター・スターン | 100C | 芝生を作るときに酵母をスプリークするには |
| グリセロール≥99% | ミリポアシグマ | G9012-1L | 冷凍酵母ストックを作るために必要ですL |
| -ヒスチジン | 米国生物製剤 | H5100 | 選択培地での酵母成長選択用 |
| L-ロイシン | 米国生物製剤 | L2020-05 | 選択培地での酵母成長選択用 |
| L-トリプトファン | シグマ | T-0254 | 選択培地Nでの酵母成長選択用 |
| 、N-ジメチルホルムアミド | シグマ | 319937-1L | X-gal溶液を作るために |
| オムニペンスエリート | ウィートン | W375030-A | シンガープレートにメディアの正確な量を分配するため |
| ペプトン、細菌学 | アメリカ国際化学 | PEBAUP | 酵母の成長に必要なタンパク質源 |
| シャーレ、150 mm x15 mm | VWR | 10753-950 | 酵母の餌を成長させるためスクリーニング |
| PlusPlates | シンガーインスツルメンツ | PLU-003 | シンガーロボットで使用する長方形の寒天プレートを作るには |
| 精密低温BOD冷蔵インキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PR205745R | 酵母プレートを恒温でインキュベートするには |
| RePads 1,536 ショート | シンガーインスツルメンツ | REP-005 | TF-preyアレイを移し替え、酵母を交配し、酵母を二倍体選択および読み出しプレートに移すには |
| RePads 384 short | Singer | Instruments REP-004 | TF-preyアレイを384から1,536コロニーフォーマットに移すには |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | TF-preyアレイをグリセロールストックから寒天プレートに移すには |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | TF-preyアレイを96から384コロニーフォーマットに転送するには |
| Singer HDA RoToRロボット | Singer Instruments | 酵母をハイスループットで転送するため | |
| 水酸化ナトリウム(ペレット/認定ACS) | フィッシャーS318-1 | 選択的な培地のpHを調整するため | |
| リン酸ナトリウム二塩基性七水和物 | サンタクルーズバイオテクノロジー | sc-203402C | X-gal のLacZレポーター活性に必要; |
| リン酸ナトリウム一塩基性一水和物 | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | X-gal |
| ウラシル | シグマ | U0750-100G | 選択的な媒体 |
| X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-ベータ-Dgalactopyranoside) | の酵母 | X4281C100 | β-ガラクトシダーゼはタンパク質とDNAの相互作用を検出するために無色のX-galブルーに変わります |
| 酵母抽出 | 米国生物製剤Y2010 | の成長 | |
| と繁殖のための栄養培地酵母窒素ベース(粉末)w / o AA、炭水化物、w / o AS | 米国の生物製剤 | Y2030 | 、活発な酵母の成長に必要 |
参考文献
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (....
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