コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

サマリー

コアラ毛からコルチゾールを測定する最適な抽出溶媒を決定するプロトコルを提示する.このプロトコルで使用される溶媒は、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールである。最適な抽出溶媒を決定することは、コアラに対する慢性ストレスの影響を決定するために毛皮を確実に測定するのに役立ちます。

要約

サンプルタイプ全体の動物のストレスを測定するために使用されるホルモン抽出の最適な方法は、常に同じではありません。オーストラリアの象徴的なマルシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、人為的に誘発されたストレスに長時間さらされ、野生集団における慢性ストレスの評価が緊急に保証されている。慢性ストレスを測定する最も効果的な方法の一つは、生理的および行動的応答をサポートするように、髪や毛皮のグルココルチコイドホルモンコルチゾールを分析することです。本研究室の検証研究は、コアラ毛皮におけるコルチゾールの非侵襲的尺度として使用される最適なホルモン抽出方法を検証するための現在の技術をテストすることを目的としています。ストレスホルモンを測定するために非侵襲的な技術を使用することは、彼らの理想的な実用的かつ倫理的な観点による伝統的な侵襲的な技術よりも好ましいことが認識されています。さらに、コアラから毛皮を採取する方が、血液のサンプルを採取するよりも比較的簡単です。本研究では、アデレードコアラと野生動物病院から取得したコアラ毛皮のサンプルを用いて、最適なコルチゾール抽出法を検証するために、多くのホルモン抽出技術を実行した。結果は、100%メタノールが並列性結果に基づいて100%エタノールまたは100%イソプロパノールと比較して最も最適な溶媒抽出を提供することを示した。結論として、コアラファーからのコルチゾール抽出のこの方法は、コアラの慢性ストレスを研究するために使用することができる信頼性の高い非侵襲的アッセイを提供しました。

概要

オーストラリアの生態系は、他の多くの動的相互作用の中で食物や繊維を含むサービスの提供を通じて人間の生活を維持^{します 1}.皮肉なことに、生物多様性の変化を通じた生態系破壊の主な原動力として機能しているのは人間の活動^です2。生息地の断片化は、大きな連続的な生息地を互いに隔離された小さな土地のパッチに分割するプロセスとして知られており、オーストラリアの生態系を脅かす大きな人為的生物多様性^変化2である。生息地の断片化は、任意の領域における種組成の構造と多様性を変更し、したがって、これらの種が生存可能な集団^を維持するために必要な生息地の面積を減少させる2.この結果、食料、燃料、繊維、水3を含む資源の種間の競争が激化しています。生物多様性の変化によるオーストラリアの生態系の破壊は、多くのオーストラリアの在来種1に壊滅的な影響を及ぼしている。

オーストラリアで最も象徴的なマーシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、オーストラリアの生態系が生存のために健全なままに^{している4}に依存している。ヨーロッパの入植地の導入は、彼らが大規....

プロトコル

このプロジェクトは、厳格な動物と人間のケアガイドラインの下で行われました。動物倫理は、西シドニー大学(A12373)によって付与されました。さらに、この研究を安全に行うために、ウェスタンシドニー大学によってラボリスク評価とバイオセーフティおよび放射線フォームが提出され、受け入れられました(B12366)。

注:このプロジェクトのコアラ毛皮サンプルは、282アンザックハイウェイ、リンプトン南オーストラリアに位置するアデレードコアラと野生動物病院から得られました。毛皮は病院に入院したコアラから採取され、重傷のため安楽死させた。死亡したコアラは死後まもなく遺体袋の中の冷凍庫に保管されていた。死体袋から死んだコアラを取り除いた後、標準的な動物バリカンを使用して首のうなじから1.2gの毛皮を剃りました。毛皮は、皮膚が切断されていないことを確認するために、皮膚にできるだけ近くに剃りました。一度剃ると、死んだコアラはボディバッグに戻され、冷凍庫に入れられました。その後、毛皮をアルミ箔製のパウチに入れ、-20°C以下に保存した。輸送中、毛皮は周囲温度に保たれ、実験室に到着すると、毛皮は-80°Cで貯蔵された。

1. コアラファーコルチゾール抽出

1. -80 °Cで貯蔵から毛皮を取り除き、解凍する時間を確保してください。
2. 実験室の分析精密バランスの毛皮の重量を量る。
3. 毛皮の60mgを....

結果

目的のホルモン代謝産物のアッセイ検出は並列処理を用いて決定される。並列化曲線を使用して、50% 結合点は、標準曲線上のサンプル希釈係数も決定します (図1)。並列化グラフ(図1)に示すように、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物は、コルチゾール標準に対する並列変位を提供しなかった。しかしながら、100%メタノール抽出物は、コルチゾール標準に対して並列変位を提供した。乾燥抽出物は、アッセイバッファー(100%エタノールの100μLおよびアッセイバッファーの400μL)で希釈を通してきちんと実行した。

変動のイントラ(内)および間(間)アッセイ係数(CV)は、高(約70%)から決定された低い(約30%)結合サンプル抽出物は、すべてのアッセイで実行されます。並列性グラフ(図1)に基づき、30%(低)結合内部制御はきちんとしたコアラ抽出プールであり、70%(高)結合内部制御は1:2希釈コアラ抽出プールであった。内部の高低の内部統制のCV%は<15%であった。

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ディスカッション

哺乳類の毛皮でコルチゾールを検出する技術の範囲を使用する研究の数があります。.本研究は、現在の人為的ストレスにさらされた野生のコアラから採取した毛皮中のコルチゾールの検出に関する結果を提示する。この画期的な研究では、一般的に使用される3つの溶媒のうち、コアラの毛皮から慢性ストレスの尺度であるコルチゾールを抽出するのに最適な方法をテストするために毛皮を使用しました。結果は、100%メタノールがこのタイプの哺乳類毛皮におけるコルチゾール抽出の推奨溶媒であることを示した。

エタノール、メタノールおよびイソプロパノールは、水素分子によって結合され、ホルモン抽出^実験28で溶媒として一般的に使用されるすべての一次アルコールである。一般に、極性物質は他の極性物質で最もよく溶解しますが、非極性物質は他の非極性物質で最もよく溶解します。メタノールを含むアルコール群は非常に極性であり、イソプロパノールを含むアルコール群は非常に非極性である。その分子構築のために、エタノールを含むアルコール基は、極性および非極性溶媒の両方であるという利点を有する。コルチゾー.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
遠心分離機の管	n/a	n/a	1.5 mL
クロム鋼のビーズ	n/a	/a	3.2 mm x 3
コルチゾールのキット	アーバー アッセイ	K003-H1W	米国ミシガン州で製造
DetectX コルチゾール酵素免疫測定キット	アーバー アッセイ	K003-H5	コアラの毛皮のコルチゾール試験に初めて使用
エタノール	n/a	n/a	HPLCグレード
イソプロパノール	該当	なし 該当なし	HPLCグレード
メタノール	該当なし	なし	HPLCグレードの
マイクロピペット	該当なし
マイクロ精密ふるい	該当なし	/ 0.5 mm
マイクロプレートリーダー	Bio Radi	該当なし	/ A 該当なし / マイクロ
プレートウォッシャー	Bio Radi	該当なし / A	該当なし / A
オービタルシェーカー	バイオライン	n/a	n/a
プラスチック計量ボート	n/a	n/	a n/a
プレートシーラー	n/a	n	/a n/a
精密バランス	n/a	/	a n/a
ボルテックスミキサー	エッペンドルフ	n/a	n/a

n 該当 該当なし / A n