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方法論記事

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

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DOI:

10.3791/59232

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2019年5月23日

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1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

この記事について

サマリー

ここでは、マカク脳の大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するための効率的かつ簡素化されたアプローチとして、皮質へのウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を示す。

要約

非ヒト霊長類(NHP)光遺伝学では、ウイルスベクターを持つ大きな皮質領域に感染することは、しばしば困難で時間のかかる作業です。ここでは、光遺伝学的ウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を一次体感覚(S1)および運動(M1)皮質の効率的で広範な皮質発現を得ることを実証する。光感受性イオンチャネル。黄色蛍光タンパク質(EYFP)に融合した赤色シフトオプシンC1V1をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターをMR誘導CED下のレッサスマカクザルの皮質に注入した。輸液後3ヶ月間、エピ蛍光イメージングは、M1およびS1の光遺伝学発現の大きな領域(>130 mm2)を2つのマカクで確認した。さらに、マイクロエレクトロコルチコグラフィーアレイを用いて発現領域からの信頼性の高い光誘発電気生理学応答を記録することができました。その後、レポーターに対する組織学的分析および免疫染色は、エピ蛍光イメージングによって示される分布に対応するM1およびS1における広範囲かつ緻密な光遺伝学発現を明らかにした。この技術により、従来の技術に比べて損傷を最小限に抑えながら、より短い期間で皮質の広い領域にわたって発現を得ることができ、HOPなどの大型動物における光遺伝学的ウイルス送達に最適なアプローチとなり得ます。このアプローチは、進化的に人間に近い動物モデルにおいて細胞型特異性を有する神経回路のネットワークレベル操作の大きな可能性を示す。

概要

光遺伝学は、神経活動の操作と脳内のネットワーク接続の研究を可能にする強力なツールです。この技術を非ヒト霊長類(HPS)に実装することで、霊長類の脳における大規模な神経計算、認知、行動に対する理解を深める可能性があります。光遺伝学は近年、NGPで成功裏に実施されているが、1,2,3,4,5,6,7,研究者は、これらの動物の大きな脳領域全体で高いレベルの発現を達成しています。ここでは、マカクザルの皮質の広い領域にわたって高レベルの光遺伝学的発現を達成するための効率的で簡素化されたアプローチを提供しています。この技術は、最先端の記録8、9および光学刺激10技術と組み合わせて、これらの動物の現在の光遺伝学的研究を改善する大きな可能性を秘めています。

対流増強送達(CED)は、中枢神経系11、12、13への薬理学的薬剤および他の大きな分子、ウイルスベクターを含む送達の確立された方法である。従来の送達方法は、脳の小さな領域に分散する複数の少量注入を伴うのに対し、CEDはより少ない注入でより広範で、より均一な薬剤分布を達成することができる。注入中の圧力駆動バルク流体流れ(対流)により、CEDを用いてウイルスベクターを送送る際に、標的組織のより広く均一に分散されたトランスダクションを可能にします。最近の研究では、磁気共鳴(MR)誘導CEDを用いて、一次運動(M1)および身体感覚(S1)コルチス9および視床14の大領域の経発性およびその後の光遺伝学的発現を実証した。

ここでは、皮質注射が少ない大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するためにCEDの使用を概説する。

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プロトコル

すべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ大学、サンフランシスコ機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠しています。8歳と7歳の成人男性の2匹のオスのカゲザルを用いて、それぞれ体重17.5kgと16.5kg(サルGとサルJ)を用いて以下の手順を行った。

注:すべての外科的処置のための標準的な無菌技術を使用する。

1. ベースラインイメージング

  1. 動物を鎮静し、挿管し、イソファランの下で全身麻酔を維持する(濃度は、呼吸数や心拍数などのバイタルサインに応じて、必要に応じて0〜5%の間で変化した)。動物の温度、心拍数、酸素飽和度、心電図応答、および手順全体を通してCO2の終末津波部分圧力を監視します。
  2. 動物をMR互換の立体フレーム(材料の表を参照)に入れ、手順全体を通して残ります。動物をポータブルMR互換のイソファランマシンに接続し、MRIスキャナ(3T)に輸送します。
  3. 標準T1(フリップ角度=9°、繰り返し時間/エコー時間=668.6、マトリックスサイズ=192 x 192 x 80、スライス厚さ=1mm)とT2(フリップ角度=130°、繰り返し時間/エコー時間=52.5、マトリックスサイズ=256 x 256 x 45、スライス厚=1mm)を取得 参照および外科計画のため。
  4. 麻酔から動物を回復し、動物の住宅地に輸送します。
  5. 後天したT1およびT2画像を使用して、開頭術の配置を決定します。開頭術の位置は、MRからの目的の皮質領域をマカクの脳アトラス(パキシノス、黄、ペドリド、トーガ2nd版)と一致させることによって正確に決定することができる。さらに、これらのベースライン画像は、ウイルス注入の位置の推定値を提供することができる。ここで示す目的の皮質領域は、M1 と S1 です。

2. MR互換室注入

  1. 動物を鎮静し、挿管し、1.1のように標準的な麻酔モニタリングで全身麻酔を維持します。
  2. それは部屋の注入およびウイルスベクターの配達を通して残るMR互換の立体フレームに動物を置く。ポータブルMR互換イソファルランマシンに動物を接続します。
  3. メスで約5センチの長さで中間線から約2cmの矢状切開を作成します。
  4. エレベーターを使用して頭蓋骨から下にある軟部組織を取り除きます(「材料の表」を参照)。
  5. トレフィンを使用した注射用に事前に計画された軌道をカバーする円形開頭切開術(直径2.5cm)を作成します(「材料の表」を参照)。
    1. トレフィンの中心点を下げ、トレフィンの端を越えます。計画された頭蓋の中心にインデントを作成し、トレフィンの調整可能な中心点を使用してトレフィンを固定するために、頭蓋骨の十分に深い位置にインデントを作成します。これは、基礎となる神経組織に損傷を引き起こす可能性がありますので、頭蓋骨の深さを完全に貫通しないように注意してください。
    2. 定期的に開頭術全体を通して組織の水分を維持するために必要に応じて生理生理生理生理で領域を洗い流します。
    3. 中心が作られたら、トレフィンを頭蓋骨に下げ、トレフィンを時計回りに反時計回りに回転させ、骨キャップを鉗子で取り外すまで下向きの圧力を加えます。トレフィンで下層組織を損傷しないように注意してください。
  6. 頭蓋切開の中心にある硬膜を通して細かい縫合糸(サイズ6-0)を通し、脳の表面から縫合糸をそっと引っ張って、頭蓋切開の中心にテントを作って、硬膜を持ち上げます。
  7. 次に、脳にダメージを与えないように、細かい眼用ハサミを使用してテントの中心に近いデュラを穿刺します。その後、頭蓋骨の中心から端に硬膜をカットし、細かい眼科のはさみでエッジに沿って続けます。
  8. 円筒形のカスタムメイドのCED MR互換チャンバー(図1;生産指示のセクション4を参照)を頭蓋骨に取り付け、CED注入中にカニューレサポートを提供し、チャンバーフランジの曲率が整列するようにします。頭蓋骨の曲率によく合う。
  9. プラスチックねじと歯科用アクリルまたは数本のチタンネジを使用して、頭蓋骨にインプラントを固定します。

3. ウイルスベクター配信

  1. MR互換チャンバーを埋め込み、カニューレ注入グリッド(図1A-B、補足図1)をチャンバーに挿入した直後に、MR解剖画像を介して注入位置を視覚化するための生理生理物(0.9%NaCl)でグリッドを埋め、次の点を考慮し、脳の水分を維持するために、湿った滅菌吸収性ゼラチンでチャンバーキャビティを充填する(図1F)。
  2. 輸送およびMR注入の間にシリンダーの無菌性を維持するために無菌の抗菌切開ドレープで皮およびシリンダーをカバーする。ビタミンEカプセルを置き、注射グリッドの上部に陽性の同定を行います。
  3. 動物が挿管されたままの間、麻酔回路から気管内チューブを取り外し、ポータブルMR互換イソファランマシンに再接続し、動物をMRIスキャナに輸送します。
  4. T1画像(フリップ角度=9°、繰り返し時間/エコー時間=668.6、マトリックスサイズ=192 x 192、スライス厚さ=1mm、80スライス)を取得して、射出グリッドと皮質表面の上部からの距離を計算します。ビタミンEカプセルはT1画像ではっきりと見え、注射グリッドの上部のマーカーとして使用する必要があります(図2A)。MRイメージングソフトウェアの定規ツールを使用して、射出グリッドの上部と皮質面との間の距離を測定します。
  5. T2画像(フリップ角度=130°、繰り返し時間/エコー時間=52.5、マトリックスサイズ=256 x 256、スライス厚さ=1mm、45スライス)を取得し、注入の標的部位に基づいて各部位に最適なカニューレガイドを決定します(図2B-C)。前述のように、カニューレグリッドはT2画像で最もよく見える生理生理生理物で満たされています。MRイメージングソフトウェアを使用して、冠状動脈面と矢状面をスクロールして、注入の標的位置を見つけます。
  6. 室温で数時間ウイルスベクターを解凍した後、ウイルスベクターをMR造影剤ガドテッリドール(250:1;2mM Gd-DTPAの比率、材料の表を参照)をピペットまたは渦混合で混合します。
    注:提示された技術は、EYFPに融合したC1V1のカムキアプロモーター駆動発現を用いてAAVベクターについて試験した(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP、力体:2.5 x 1012ウイルス分子/mL;材料の表を参照)。
  7. 混合ウイルスを0.2 mL高圧IVチューブにロードします(材料の表を参照)。
  8. ウイルス注入ラインを準備するためのMRスキャナの外に滅菌フィールドを確立します。
  9. 高圧IVチューブを使用して、長い延長線(MRボアに対する注入ポンプの位置に応じて約3〜5メートル)をMR互換の3 mLシリンジと生理生理物でプライムに接続します。
  10. 長い延長線の遠位端をウイルスを搭載した0.2 mL IVチューブの近位端に接続し、還流耐性カニューレを1mmのステップチップ(図2D;カニューレ生産指示のセクション5を参照)を遠位端に取り付けます。クランプスタイルのカテーテルコネクタを備えたこのアセンブリ(材料の表を参照)(図2E)。
  11. 最後に、MR互換ポンプに注射器をセットします(材料の表を参照)。ポンプコントローラはMR互換ではないため、スキャナー制御室に置きます。
  12. 前に得られたベースライン解剖学的MR画像を使用して、カニューレ注入グリッド位置と標的注入部位に到達するために必要な挿入深度を選択します。無菌テープを使用してカニューレの挿入深さをマークします。
  13. 1 μL/minの速度で注入を開始し、カニューレ先端からの流体の排出を観察することにより、注入ライン内の流体の流れを視覚的に検証します。
  14. 注入ラインの流れを維持しながら、注入グリッドを通してカニューレを手動で注入を挿入し、挿入中に浸透した組織がカニューレを詰まらせるのを防ぎます。
  15. ウイルスベクトル注入のオンライン監視のための高速(2分)フラッシュT1加重画像(フリップ角度=30°、繰り返し時間/エコー時間=3.05、マトリックスサイズ=128 x 128、スライス厚さ= 1mm、64スライス)を取得します。
  16. MRスキャナで検出するのに十分なウイルスが注入されるようなベクターを~10μL注入した後、MR画像を取得し、ウイルスの観察された広がりによって明らかなように正しいカニューレの配置を確認する。挿入されたカニューレの深さが正しくない場合は、それに応じて深さを調整するか、カニューレをゆっくりと取り外し、3.12 のように挿入を再試行します。
  17. オンラインMR画像(フラッシュT1加重)のガイダンスを介して注入を監視し、注入速度を数分ごとに1 μL/minステップで5 μL/minに増加させます(図3A)。
  18. ウイルスベクターの約40μLを注入した後、注入速度を1μL/minステップで減少させ始め、約50μLを注入した後に注入を停止し、カニューレを10分間所定の位置に残す。
  19. ゆっくりと脳からカニューレを取り除き、次の場所に移動します。場所ごとに 3.9 ~ 3.19 の手順を繰り返します。
  20. 動物輸送の前に、注射の終わりに無菌ドレープでシリンダーをカバーします。その後、手術室に動物を輸送します。
  21. MR互換室を切除し、骨フラップを交換し、筋肉を覆い、標準的な無菌技術を使用して皮膚を縫合するか、チタンシリンダーおよび人工硬膜でチャンバを交換することによって外科的切開を閉じる(参照してください(ヤズダン・シャーモラドら 20169) 神経記録と刺激のため。

4.MR互換チャンバー生産

  1. ナイロンカニューレ射出グリッド(図1A-B)を指定寸法に従って加工して製作する(補助図1)。
  2. 3Dは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS0プラスチック(図1C-E)からMR互換シリンダーをプリントします(補足ファイル1-3を参照してください;3Dプリンタおよび材料の材料の表を参照)。
    注:1 つの設計は、MR 互換シリンダ内の固定カニューレ注入グリッド (図 1C)を維持し、別の設計では、射出領域を拡張してグリッドを回転させることができます (図 1D-E)。
  3. カニューレ射出グリッドを通し、両方の部分が同じねじりを示すようなMR互換チャンバの対応する空洞をタップします。
    注:両方のコンポーネントが同じスレッドを持つ場合は、任意の種類のスレッドを使用できます。
  4. MR互換シリンダのタップ穴にねじ込んでナイロンカニューレ射出グリッドを挿入します。

5. 還流耐性カニューレ生産13

  1. カミソリの刃を使って、内側のシリカチューブ用に0.32mm IDと0.43mm ODで30cm長のシリカチューブを切断します(材料の表を参照)。
  2. 外シリカチューブ用に長さ7.5cm、長さ5cmのシリカチューブを0.45mm ID、0.76 mm ODで切断します(材料の表を参照)。
  3. 内管が外管を1mm伸ばすようなシアノアクリレートで30cmの内側チューブに7.5cmの外側チューブを付け、還流に強い工程を作ります(図2D)。シアノクリレートが内側のチューブの内側に入らないようにするには、カニューレ先端から遠く内側のチューブの外側にシアノクリレートを置きます。
  4. クランプスタイルのカテーテルコネクタに取り付ける場合は、5cm長のシリカチューブを内側チューブのもう一方の端に貼り付けます(ステップ3.10を参照)。

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結果

MRIガイダンスに下記の対流強化配信(CED)

ウイルスベクターの広がりは、オンラインMR画像の指導の下でCED注入中にモニタリングされた(図3A)。本研究では、2匹のサルのS1とM1を標的とした(図3B)。Yazdan-Shahmorad et al. 20169で説明したMR画像(図3C)のポストホック解析で3次元分布量を推定し、皮質の広い領域のカバレッジを確認した。サルGのM1注入は、時間の制約のためにMRガイダンスなしで行われました。

ウイルス発現の検...

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ディスカッション

ここでは、MR誘導CEDによるNHP原発性身体感覚および運動皮質における大規模な光遺伝学発現を達成するための実現可能かつ効率的な手法を概説する。MR誘導CEDの使用は、NHP脳におけるウイルス注入の従来の方法に対して重要な利点を提示する。そのような利点の1つは、必要な注入が少ない大きな領域に対して発現を達成する能力である。例えば、従来の方法では、2〜3mm径領域1、2、5、17におけるベクトル降伏発現の1〜2μLの複数の注射。大規模ベクタースプレッドの達成に向けたこれまでの試みは、複数の注射で約10mm3の発現量を生み出したが、ここでは、わずかな注入で200mm3以上の発現を達成する方法を提示する。. CEDによる50 μLの単一注入は皮質CED9

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開示事項

PNSは、脳刺激を用いて臨床療法を開発しているNeuralink社に金銭的な関心を持っています。

謝辞

この研究は、米国心臓協会の博士後期フェローシップ(AY)、防衛先端研究プロジェクト庁(DARPA)の再編成と傷害回復を加速する可塑性によって支えられた(REPAIR;N66001-10-C-2010)、R01。NS073940、およびUCSF神経科学イメージングセンターによって。この研究はまた、賞番号K12HD073945、ワシントン国立霊長類研究センター(WaNPCR、P51 OD010425)の下で国立衛生研究所のユーニスケネディ震え国立研究所によってサポートされました。神経技術センター(CNT、グラントEEC-1028725の下で国立科学財団工学研究センター)。カミロ・ディアス・ボティア、ティム・ハンソン、ヴィクトル・カラジア、ダニエル・シルバースミス、カレン・J・マクレオド、ジュリアナ・ミラニ、ブレイクリー・アンドリュースが実験に協力してくれたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 mL 高圧 IV チューブSmiths Medical Inc., Dublin, OH, USA533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD SilicaTubing Polymicro Technologies1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica TubingPolymicro Technologies1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFPPenn Vector Core, University of Pennsylvania
ABSプラスチックStratasys、MN、USAABSplus-P430
抗菌性切開ドレープ3M6650EZIoban ドレープ
歯科用アクリルHenry Schein, Inc.1013117アクリルボンディングエージェント
エレベーターVWRインターナショナル、LLC。10196-564ランゲンベックエレベーター、ワイドチップ
ファイン縫合McKesson Medical-Surgical Inc.
GadoteridolProhance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ0270-1111-04
光刺激用レーザーOmicron-Laserage, GermanyPhoxX 488-60
MR compatible 3 cc syringeHarvard apparatus, Holliston, MA, USA59-8377
MR イメージングソフトウェアPixmeoOsiriX MD 10.0
MR-Compatibleポンプハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン、米国ハーバードPHD 2000
MR互換定位固定フレームKOPF1430M MRI
ペリフィックスクランプスタイルカテーテルコネクタB-ブラウン、ベツレヘム、ペンシルベN / A
プラスチックネジプラスチック 10-80 x 1/8Nナイロンネジ
チタンネジCrist Instrument Co., Inc.6-YCX-0312セルフタッピング骨ネジ
TrephineGerMedUSAInc,SKU:GV70-42
uPrinter SE 3DプリンターStratasys, MN, USAN/A
Vitamin E CapsulePure Encapsulations, LLC.DE1
湿式滅菌吸収性ゼラチンファイザー社AZL0009034201ジェルフォーム
糸 1034505ニア州、米国

参考文献

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