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方法論記事

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるドーパミン伝達を評価するスイミング麻痺

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DOI:

10.3791/59243

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2019年4月3日

 ,  , 
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

この記事について

サマリー

スイミングによる麻痺 (SWIP) は確立された行動アッセイ ドーパミン線虫(C. elegans) におけるシグナル伝達の基本的なメカニズムを研究するために使用します。しかし、分析を実行する詳細な方法が欠けています。ここでは、SWIP のステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。

要約

このプロトコルで記述されているスイミング アッセイは、シナプスのドーパミンを調整する蛋白質を識別するために有効なツールです。哺乳類と同様に、ドーパミン (DA) はc. の elegans学習や運動の活動を含むいくつかの機能を制御します。DA リリース (アンフェタミン (AMPH) 治療など) を刺激するまたは DA クリアランスを防止する条件 (DA トランスポータを欠けている動物など (dat 1)をニューロンに DA を reaccumulating ことができません) 細胞外 DA の過剰生成最終的に抑制した歩行運動の結果。この動作は、動物は、水中で泳ぐときに特に顕著です。実際には、野生の種類の動物は、長時間泳ぎ続ける、 dat 1 null 変異体と野生型 AMPH で扱われてまたは DA トランスポーターの阻害剤は井戸の底に沈むし、移動しないでください。この現象は、「スイミングによる麻痺」(SWIP) と呼ばれます。SWIP アッセイは十分に確立されたが、法の詳細な説明が欠けています。ここでは、我々 は SWIP を実行するステップバイ ステップ ガイドをについて説明します。アッセイを行う後期幼生段階 4 動物はコントロール ショ糖液 AMPH の有無を含むガラス スポットに配置されます。動物は、株分け業の堅実で可視化によって手動でまたは自動的にカメラで記録することによってマウントの遊泳行動を獲得しています。動画では、スラッシング周波数とヒート マップの形で麻痺の視覚的表現を生成の追跡ソフトウェアを使用しては分析しています。手動および自動の両方のシステムは動物の遊泳能力の簡単に定量化可能な読み出しを保証し、したがってベアリング ドパミン神経系内の変異動物または補助遺伝子スクリーニングを促進します。また、SWIP は AMPH など乱用薬物の作用の機構を解明する使用ことができます。

概要

動物は、さまざまな複雑なシグナリング プロセスによって調整される別の神経伝達物質によって仲介される生得的で複雑な動作を実行します。神経伝達物質ドーパミン (DA) は、学習、運動機能と報酬の処理を含む種を渡って非常に節約された行動を仲介します。

交尾、学習、採餌、運動、産卵など DA によって規制されている多くを含む著しく複雑な動作を示しますのみ 302 ニューロンから成る比較的シンプルでもマップされた神経系と土壌線虫C. elegans、1。 その他の機能、短いライフ サイクルと扱いやすさ、シグナル分子の保全、の中で保存された行動の神経基盤を研究するためのモデルとして線虫を使用する利点を強調表示します。

両性具有者c. の elegansを含む 8 つのドーパミン作動性ニューロン。これらに加えて、雄には交尾目的の六つの追加のペアが含まれます。これらのニューロンは、哺乳類のように DA を合成し、DA トランスポーター (DAT 1)、DA ドーパミン作動性ニューロンにシナプス間隙で解放を輸送するドーパミン作動性ニューロン、排他的に見られる膜蛋白質を表現します。また、合成、包装と DA のリリースの各ステップに関与するタンパク質のほとんどはワームと人間の非常に節約されるのような哺乳類で、DA を調節する給餌行動と線虫2歩行。

線虫は、固体表面上をクロールし、水中における特徴的なスラッシング挙動で泳ぐ。興味深いことに、DAT 1 (dat 1) の表現に欠けている突然変異体は通常固体表面上のクロールが水に漬してスイミングを維持するために失敗します。この現象は、スイミングによる麻痺、あるいは SWIP に名付けられました。前の実験は SWIP が一部では、最終的に overstimulates D2 のようなシナプス後受容体 (DOP 3) シナプス間隙に DA の過剰によって引き起こされることを示した。もともと、 dat 1ノックアウト動物3で同定されたが SWIP で DAT (例えば、イミプラミン4) の妨害活動する薬と扱われる野生型動物観察もや DA リリース (例えば、アンフェタミン5) を誘発します。その一方で、薬理学的または遺伝的操作ダの合成と放出を回避と DOP 3 受容体機能のブロックは SWIP6を防止します。一緒に取られて、これらの既にパブリッシュされたデータがドーパミン作動性シナプス3,4,7内変異蛋白質によって引き起こされる行動への影響を検討し、採用の信頼性の高いツールとして SWIP を確立しています。DA7,8,9,10、11,12をシグナル伝達に関与する新規規制経路を識別するための遺伝的画面に転送します。さらに、生きている動物の行動の薬剤誘発性の容易に定量化可能な読み出しを提供することにより SWIP アンフェタミン (AMPH) のような薬剤の作用機序の解明できアザペロン、ドーパミン作動性のシナプス5,6,13,14,15。

SWIP の試金を実行するプロトコルは、16の前に記載されています。ここでは、方法論と SWIP を効果的に実行するc. の elegansのコミュニティのための視覚的なガイドを提供することを目標に分析を実行するセットアップ詳細に述べる。

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プロトコル

1. ソリューションとメディアの準備

  1. KH2PO4 3.0 g (22.05 mM)、Na2HPO4 6.0 g (42.2 mM) を溶解することにより M9 バッファーを準備と 1 l の脱イオン水をオートクレーブ塩化ナトリウム 5.0 g (85.5 mM)。オートクレーブ滅菌後 1 M MgSO4 (オートクレーブ脱イオン水 100 mL の最終巻で 12 g) の 1.0 mL を追加します。結果 10 x のミックス 100 mL 900 ml のオートクレーブの M9 は 1 x の解決をするため、純水。
  2. 卵バッファーをするためには、1 l の脱イオン水をオートクレーブ HEPES 6.896 g 塩化ナトリウム (118 mM)、KCl (48 mM)、CaCl2-2 H2O (2 mM)、MgCl2-6 H2O (2 mM) の 0.406 g 0.294 g の 3.578 g と 5.958 g (25 mM) の解散します。7.3 NaOH を使用して pH を調整します。
  3. 3.8 mL の脱イオン水に 1 mL の 5-6% 亜塩素酸ナトリウム (漂白剤)、10 N NaOH の 180 μ L を追加することによって新鮮な次亜塩素酸ナトリウム/NaOH 溶液を準備します。
  4. 重さ 60 g ショ糖と 60% ショ糖溶液を作るために 100 mL の最終巻にオートクレーブの脱イオン水に溶解します。
  5. 200 mM ショ糖を作るためにオートクレーブ脱イオン水 10 mL 中のスクロースの 0.684 g を溶解します。確認し、同じ osmometer を使用して、浸透圧を調整します。遠心チューブ 1.5 mL に 1 ml を作るし、-20 ° C で凍結
  6. AMPH (分子量 184.75 g/mol) の 0.184 グラムの重量を量るし、100 mM の原液を作るために脱イオン水 10 mL に溶かします。0.5 mM 実用的なソリューションを作るために水の 400 μ L で原液のミックス 2 μ L。
  7. 栄養成長メディア (NGM) プレートを準備します。
    1. 塩化ナトリウム (52.65 mM)、ペプトン、バクト寒天、脱イオン水 2 L の三角フラスコに 975 mL 25 g の 20 g のミックス 3 g。液体のサイクルを使用して 1 時間電磁攪拌棒及びオートクレーブ (121 ° C、15 PSI) が含まれます。
    2. 冷却し、攪拌しながらヒーターにフラスコを置くことによって約 50 ° C に温度を維持します。コレステロール (5 mg/mL のエタノール)、0.5 mL 1 M MgSO4、1 M CaCl2と 1 M カリウム リン酸バッファー、pH 7.4 (KH2PO4108.3 g、K2HPO4 35.6 g 25 mL に 1 mL の 1 mL を追加します。、脱イオン水を 1 L)。
    3. 100 x 15 mm ペトリ板に 25 mL のピペットし、固めるためメディアを許可します。ボックスに最大 4 週間の 4 ° C で逆さまプレートを格納します。
  8. ホストゲノム スープ (LB) スープの準備
    1. 200 mL 三角フラスコに脱イオン水に LB 粉ミックスの 5 g を溶かします。液体の滅菌を利用した 30 分間オートクレーブ サイクルします。クールダウンにスープを許可します。1-2 週間常温で保存します。
  9. NA22 細菌プレートの準備
    1. グリセロール ストックから NA22エシェリヒア属大腸菌細菌の体積が小さく、LB プレートを連勝し、インキュベート プレート逆さま 37 ° C のインキュベーターで一晩隔離されたコロニーを成長する滅菌ピペット チップまたは滅菌細菌ループを使用します。ピックアップ流体培養基 LB の 1.8 の手順で準備の 200 mL に単一コロニーを紹介し、37 ° C で動揺のプラットホームの一晩成長しましょう。
    2. プレートをシードするには、ステップ 1.7 前の準備、滅菌ガラス アイス ホッケー用スティックによって広げ NGM プレートの上に細菌培養の 200 μ L を分配します。フードの下で一晩以上を乾燥し、逆さまに 4 ° C で、気密ボックス格納プレートを聞かせてください。
  10. まつげ/プラチナ ツール ワームをピックアップするために、パスツール ピペットのスーパー接着剤を使用してガラスに厚いまつげやプラチナ フィラメントを接着します。かみそりの刃を使用して角度でまつげの先端をカットします。また、白金フィラメント周りガラス ピペットの先端を溶融するブンゼン バーナーを使用できます。

2. c. の elegansの飼育

注:文化N2C。 線虫の野生型大腸菌NA22 プレートのひずみ。詳細な培養方法は次のとおりです。

  1. ワーム文化の準備
    1. ワームのスターター培養をするためには、栄養の十分な動物を含むプレートから寒天の小片をカットし、1.9 滅菌へらを使用して準備した NA22エシェリヒア属大腸菌細菌プレートに転送。20 ° c のプレートを 3-4 日にインキュベートします。ステレオの顕微鏡の下で視覚的に妊娠の大人の存在を確認します。
  2. ワームの同期された人口の準備
    1. ホヤの瓶を用いた平板周りすべて脱イオン水をオートクレーブに入れることによって、少なくとも 2 プレートから妊娠大人を収集します。そっとワームを取り除くし、使い捨てプラスチック ピペットを使用して 15 mL スチロール円錐管にワームを収集するプレートを旋回します。
    2. ペレットのワームは、真空ポンプを使用して上清を吸引して 2 分 140 × gで遠心分離の管でスピンダウンまたは実験室の真空を内蔵します。
    3. 再懸濁します、洗ってオートクレーブ脱イオン水とミックス 140 x gで 2 分間遠心管を記入することによってワーム、上清を吸引、この最後を繰り返すステップ 2 回以上または細菌 (水は、混合すると明確な表示されますからワームがクリアになるまでワーム)。
    4. ワームのペレットにたてナトリウム次亜塩素酸/水酸化ナトリウム溶液 (手順 1.3) 5 mL を追加し、急速に渦を使用してミックスします。約 4-8 分のロッカーにチューブを孵化させなさい。次亜塩素酸ナトリウム ・水酸化ナトリウム溶液で培養時間ストック ナトリウム次亜塩素酸溶液 (漂白剤) の品質に基づく 4-8 分の間で変動します。
    5. ガラス顕微鏡スライド上でワームを含む溶液のドロップ (2-50 μ L) を入れて、ワームの換散のための顕微鏡下で 2 分ごとにチェックします。ワームの約 70% が分離すると卵子が放出される、塗り卵バッファー管はステップ 1.2 に用意され、すぐに胚をペレットとワームの死骸 140 × gで 1 分間遠心します。
    6. 上清を吸引し、チューブを卵のバッファーを持つたびに記入ペレット 3 回以上を洗ってください。1 分 140 x gでスピン ・ ダウンとたびに上澄みを除去します。洗浄の最後には、ペレットが白くなります。
    7. 最終的な洗浄の後に、30% ショ糖液で死んだ死体から胚を区切ります。ペレットに 5 mL の脱イオン水をオートクレーブ、再懸濁します、1.4 の手順で準備 60% ショ糖 5 mL を追加します。徹底的にミックスし、6 分間 160 × gで遠心分離機します。
    8. 新鮮な 15 mL の円錐管に上部のメニスカスに浮いている胚を転送するのにガラス パスツール ピペットを使用します。3-4 mL 以上になりません。任意の残りのショ糖を取り外すには、胚を洗って 3 回 3 分間 140 × gで遠心分離によってオートクレーブ水で清とペレットを再 (取り外してチューブを充填) たびに。
    9. 1 x M9 バッファーで洗浄を繰り返します。最終的な洗浄の後に、M9 の 10 mL にペレットを再懸濁します。L1 幼虫に孵化する卵シェーカー一晩 (以上 14 h) にチューブを残します。ワームは食糧不足するため L1 幼虫に残ります。
    10. 2 分の 140 × gで遠心分離によっての幼虫によってリリースされた任意のフェロモンを削除するオートクレーブ水で 3 回洗浄 L1 幼虫は、水 1 mL で幼虫を再懸濁します。1:10 を作る水にワームの希釈ピペットのスライド ガラスに 10 μ L ドロップ、観察を履くし、堅実でワームの数をカウントします。2 回これを繰り返し、結果を平均します。
    11. ピペットは、プレート上の小さなを置くことによって (つまり、以前部屋の温度に持って来られた) NA22 プレート約 1,000 のワームに対応するワームのボリュームを削除します。ドロップが乾くまでハーフ オープン プレートを残してください。プレートをカバーし、上下約 44 48 h またはワームが、顕微鏡下で視覚的に確認として L4 後期までの 20 ° C インキュベーターで孵化させなさい。今、ワームは SWIP をテストする準備ができています。

3. SWIP

注:AMPH と扱われる野生型ワームで SWIP を評価する手動の方法について述べる。また、簡単にワームの追跡とさらに自動化されたワーム トラッカーとハーダウェイら10によって記述されていた以前のトラッキング ソフトウェアを使用してワームの動態解析について述べる.

  1. SWIP をテストするための手動の方法
    1. 分注 40 μ L 200 mOsm/L ショ糖液 0.5 mM AMPH にスポット ガラスの有無。万国実体写真、下まつげやプラチナとワームの 8-10 後半 L4 ステージ選択を選択し、ワーム選択を移動し、解決策に泳ぐまでソリューションを含む板のピックが水没します。井戸の中に拾ったワームの数に注意してください、タイマーを開始、観察、ワーム各分マークの SWIP の出展数を記録します。
    2. Raw データをスプレッドシートにコピーし、ワーム ワーム試金テストの合計数によって各分で麻痺ワームの数を割ることによって麻痺のパーセントを計算 100 を掛けます。任意のグラフにパーセントの値をコピーし、統計ソフトウェアとプロット パーセント値を Y 軸と X 軸の XY グラフを用いた時間データ フォーマットします。
    3. 二元続いてコントロール、AMPH グループおよび治療の時間の間で統計的な有意性テストへの事後分析 (例えば、ボンフェローニ事後テスト) を実行します。
  2. SWIP の自動分析
    1. 一度に 1 つのワームの自動解析を実行します。プロトコルを設定するカメラ、ワーム トラッカー ソフトウェアおよび追跡ソフトウェアを実行するためのスクリプトを解析・ ハーダウェイら16の詳細については。
    2. 簡単に言えば、セクション 3.1.2 で手動の方法で説明したようにまつげを選ぶを利用したガラス スポットに単一後半 L4 段階の両性具有を配置します。時 1 つのワームのスイミング動画を記録し、体曲がりの周波数を計算するワームの追跡ソフトウェアを使用します。
    3. ワーム スラッシング周波数を取得し、ワーム スラッシング データからヒート マップを生成するトラッキング ソフトウェアで提供されるスクリプトに従います。

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結果

AMPH 処理による SWIP アッセイの例を提示します。図 1は、前述のアッセイ セットアップの概略図を示します。マニュアル測定、同期遅延 L4 虫がまつげやプラチナで収集した約 8-10 年齢を選ぶし、ガラス スポット プレート 200 mOsm/L ショ糖 (コントロール ソリューション) の 0.5 mm AMPH ショ糖 40 μ L でいっぱい、SWIP のテストに配置されます。

動物が水泳を停止するとき (すなわち、SWIP を展示)、彼らはすぐに井戸の底に沈むし、移動しないでください。したがって、まだ井戸の底で安定したものと水の水面を泳ぐ動物との間の差別は非常に簡単です。AMPH 治療中 SWIP を徐々 に展示動物数を増加させる一方、ワームのほとんどは少なくとも 10 分間継続的に制御ソリューション泳ぐでテスト。SWIP を展示動物の最大の割合は AMPH 使用

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ディスカッション

ここでは、線虫の行動分析、SWIP を実行するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。このプロトコルはないの主要な技術的なハードルがこの試金非常にユーザーがフレンドリーなこと、シンプルでわかりやすいです。それにもかかわらず、分析を効果的に実行するために考慮すべきいくつかの重要な側面があります。

食餌療法の制限に影響を与える SWIP17アッセイ用ワームをも供給できるように注意する必要があります。穏やかな換散の中にも、タイミングの次亜塩素酸ナトリウム ・水酸化ナトリウム治療が重要なステップとして、ピッキング (より一般的なプラチナのピックを使用する場合) またはナトリウム次亜塩素酸/水酸化ナトリウム溶液に胚の長時間露光中に外傷はできるだけピッキングしながらワームの処理ワーム18に永久的な損傷を引き起こすし、泳ぐ能力を妥協します。

生殖不能の技術は、汚染を避けるために従う必要があります。寒天版の汚染は動物の健...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、SWIP の自動分析と指導の博士ランディ ブレイクリー ラボから博士オサマ Refai を感謝したいです。この作品は、LC に NIH R01 DA042156 からの資金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルミホイレイノルズラップ1091835
アンフェタミンシグマ51-63-8  
オートクレーブ
細菌インキュベーターニューブランズウィック科学M1352-0000
細菌学グレード、寒天研究所科学株式会社 A466
バクト (TM) ペプトンBDREF 211677
塩化カルシウム (二水和物)Sigma-AldrichC3881
カメラ ThorlabsU-CMAD3
遠心分離機 エッペンドルフ 5810R 15アンペアE215059
コレステロールSigma-Aldrich57-88-5
脱イオン水ミリポアZ00QSV0WWMilli-Q
Depression ガラス スポットプレートコーニング722085
三角フラスコサーモフィッシャー4103-0250PK
アイラッシュ
スライドガラスフィッシャーブランド12-550-15
グラフ作成および統計ソフトウェアプリズムグラフパッド5
HEPESシグマアルドリッチRB = H3375&H7006
次亜塩素酸塩ホーキンス次亜塩素酸ナトリウム4-6%、USP "1ガロン
LBブロス、ミラーフィッシャーBP1426
塩化マグネシウム(六水和物)シグマアルドリッチRB = M0250500
硫酸マグネシウム(七水和物)シグマアルドリッチM1880
マグネティックスターバーフィッシャーブランド16-800-510 
マイクロ遠心チューブサーモフィッシャー69715
NA 22 バクテリアCGC
ナイスタチンシグマ1400-61-9
浸透圧計Advanced Instruments, Incモデル 3320
パスツールピペットフィッシャーブランド13-678-20A
ペトリプレートファルコン351007
pHメーターOrion VersaStar ProIS-68X591202-B 0514
ポリストリン円錐管Falcon352095
塩化カリウムSigma-Aldrich P9541
二水素カリウムSigma-Aldrich7778-77-0
カリウム-DIBASICシグマ-アルドリッチP-8281
リン酸カリウム-MONOBASICシグマ-アルドリッチP0662
血清ピペットVWR10ml = 89130-898
シェーカー信頼性の高い科学55S 12x16
塩化ナトリウムFisherRB=BP358-1
リン酸二水素ナトリウムFisherRB=S381
スプレッドシートMS officeMicrosoft Excel
実体顕微鏡ZeissModel tlb3. 1 stemi2000
滅菌ピペットチップ各種02-707-400
ショ糖シグマ-アルドリッチRB=S5016
瞬間接着剤ロックタイト1647358.14 オンス
SwimRソフトウェア10.18129 / B9.bioc.SwimR
Tracker 2Worm Tracker 2.0www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
ビデオ録画ソフトウェアVirtualdubhttp://www.virtualdub.org/
ルグラムリン酸リン酸

参考文献

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