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方法論記事

遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコード バイオ センサー

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DOI:

10.3791/59253

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2019年4月13日

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

この記事について

サマリー

ハイスループット検出と細胞バイオ センサーを用いた次母乳オリゴ糖 (Hmo) の定量化ここで述べる。また示すここでは、このプラットフォーム HMO 生産菌株の解析に向けての適応信号対雑音比を改善に焦点を当てします。

要約

母乳オリゴ糖 (Hmo) は、乳児の健康に豊富な利点を示す人間の母乳の複雑な炭水化物コンポーネントです。しかし、彼らのバイオ合成の最適化は、検出のスループットが比較的低くて、単糖類とリンケージの定量化によって制限されます。糖鎖解析技術には、オートメーションを使用せず一日あたりのサンプルの数百のスループットとガスクロマト グラフ/質量分析メソッドがあります。ここでは、高スループット、リンケージ固有の検出と定量化の次 HMO 構造, 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose、異種を介して実現遺伝的コード化細菌バイオ センサーを紹介します。fucosidases の式。乳糖牛乳またはバイオ プロセスの存在は、偽陽性につながるとまた異なる戦略を使用して乳糖から信号の減少を示します。この手法の高スループットによる HMO 製造の最適化を可能にする時間の問題で並列に多くの反応条件やバイオリアクター パラメーターを試金する可能性があります。

概要

母乳オリゴ糖 (Hmo) は通常 3 ~ 8 糖モノマーを含む乳糖由来のオリゴ糖です。彼らは乳糖 (Gal β 1, 4 Glc) の削減を終了し、グリコシド リンクによってさらに長くている (β-1, 3、β 1, 6-) n-アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース (Gal)、グルコース (Glc) します。また、フコース (α 1, 2 または α 1, 3 フコース-) やシアル酸 (Sia または示さ、α 2, 3 または α 2, 6-) 残基はしばしば1を追加しました。

オリゴ糖や他の炭水化物の現在の分析、ガスクロマト グラフ/質量分析 (MS) 技術2,3,4,5,の必要性によってスループットとスコープの制限します。6,7、ほぼ取ることができるこの装置8の操作に高価な機器、特殊な列と誘導体化剤および専門知識の必要性を述べないために、サンプルあたり 1 時間。オリゴ糖の連携は特に判断が難しい高度な MS9,10または核磁気共鳴 (NMR) 法11を必要とします。これらのオリゴ糖の合成の迅速な最適化従って、この遅い分析ステップのスループットによって制限されます。

本研究でリンケージ固有次三糖類の検出を示す乳糖ベース Hmo は、2'-fucosyllactose (2' FL) ヒトの乳汁中最も豊富な HMO にあるに焦点を当てて、遺伝的コード化を使用してエシェリヒア属大腸菌のセル全体4 mg/l. の検出限界を用いるバイオ センサーこのバイオ センサーの重要な特徴は、三糖類の異性体を区別する能力です。設計の原則は存在が順番蛍光信号を生成するlacオペロンによって検出された Hmo から乳糖を解放するエシェリヒア属大腸菌の特定の fucosidases の式に基づいています。我々 はリンケージ固有の fucosidase およびその他の蛍光レポーター蛋白質をかくまっている 1 つ 2 プラスミド システムを構築することによってこれを達成します。このバイオ センサー プラットフォームは、フローサイトメトリーやマイクロ プレート リーダーによる高スループット スクリーニングに適しています。また 2 階設計ひずみ12プロデュースの定量化におけるバイオ センサーの使用率を示します。本研究でまた提案する 3 つの戦略、バイオ センサーから偽の肯定的な信号につながる乳糖の選択的除去に関する設計プロデューサーひずみが乳糖で栽培されていることを考える。

一緒に取られて、遺伝的コード化バイオ センサー検出し、Hmo を定量化は困難もリンケージに固有の方法でことができるクロマトグラフィー、MS、または NMR テクニック。高スループットを実現、使いやすさのためこのメソッドは Hmo の合成と代謝工学の広範なアプリケーションに必要です。

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プロトコル

1. 細胞文化誘導条件

注: 次の実験では、3 系統が使用:エシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 空のベクターは、大腸菌BL21 と (DE3) プラスミド pAfcA14と pET28:green 蛍光蛋白質 (GFP) と大腸菌BL21 (DE3) プラスミドをpAfcB14と pET28:GFP。すべての菌株はルリア ベルターニカミラ スープ (LB) または適切な抗生物質で最小媒体で育ちます。水、脱イオン (DI) で 1,000 x カナマイシン (50 mg/mL) と carbenicillin (100 mg/mL) の貯蔵液を準備します。

  1. メディアの準備
    1. LB メディアを準備するには、DI 水 1 リットルに LB 粉株式の 25 g を追加します。オートクレーブ滅菌に 20 分間、121 ° C でソリューション。滅菌の LB 媒体温度が 1 mL の LB 培地すべての抗生物質の在庫の 1 μ L 添加前に 60 ° C 以下まで待ちます。
    2. LB の版を準備するには、滅菌前に LB 媒体に 15 g の寒天を追加します。滅菌の LB 寒天培地の温度が抗生物質の添加前に 60 ° C 以下まで待ちます。
    3. 1.1.3 バイオセンシング セルのメディアまたはデュアル抗生物質カナマイシン、carbenicillin プレートを準備します。
  2. 炭水化物誘導
    1. 乳糖の 20 g/L に対応するモルの誘導剤である炭水化物の貯蔵液の準備: 29 g/L の 2 階と 3 階
      注: 各 200 μ L 細胞の 2'-FL または 3 階の 20 μ L が必要になります
    2. 連続振動で 37 ° C で 2'-フロリダ/3-階加温の乳糖または 2.9 g/L の最終的な集中の最終濃度が 2.0 g/L 細胞の 200 μ L を誘導し、一晩成長文化。
  3. 細胞培養
    1. 実験前日はカナマイシンと新鮮な細菌のコロニーは、生殖不能の技術を使用してから carbenicillin を添加した LB 培地 5 mL をシードします。
    2. インキュベート撹拌で 37 ° C ですべての文化と文化を一晩成長します。
    3. カナマイシンと carbenicillin と新鮮な LB/M9 メディアの 5 mL に一晩かけて培養の 50 μ L を転送します。連続的な揺れで 37 ° C で、文化は 600 の光学濃度に達するまでに成長の 0.5 〜 0.7 nm (外径600)。この中間ログ段階でセルを誘起することができます。

2. 蛍光および検出限界の測定

  1. フローサイトメトリー用セルの準備
    1. 1.5 mL チューブ、12,500 × gで 1 分間遠心に一晩文化を転送します。
    2. 上澄みを廃棄し、再単一細胞懸濁液を用意し、1 つのセルを転送 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 6 mM Na2HPO4、1.8 mM NaH2PO4, 145 mM DI 水で pH 7.2 NaCl) を 500 μ l 添加の餌を中断懸濁液 5 mL 流れ cytometry 管します。
    3. 流れの cytometer でサンプルを実行まで 4 ° C で暗闇の中の細胞を維持します。最高の結果を得るには、できるだけ早く、細胞を分析します。
    4. GFP を励起する 488 nm レーザーを選択します。525/50 nm バンドパス フィルターとフルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 蛍光レベル (20,000-40,000 イベント、集計されたセルや破片を避けるために前方および側面の散布のゲート) を収集します。
  2. バイオ センサーのキャリブレーション
    1. 標準 2'-フロリダ州の 8-10 希釈し、検量線範囲 0-2,500 mg/l.
    2. (PAfcA と pET28:GFP を含む) 2'-FL バイオセンシング細胞の培養し、セクション 1.3 で前述した標準希釈でそれらを誘発します。3 生物学的複製し各希釈を行います。

3. 検出および 2' - プロデューサーの緊張で FL の定量

  1. プロデューサーひずみの栽培
    1. 最小媒体を作るため 1 M K2HPO4FeSO4·7H2O、クエン酸ナトリウム、1 M チアミンの個別のソリューションを準備-塩酸 0.22 μ m のフィルターを使用してソリューションを滅菌します。・ ディ ・水 1 リットルと M9 媒体ブイヨン パウダーを混ぜます。オートクレーブ 121 ° C、15 分で M9 ソリューション クール 50 ° C までソリューションMgSO4CaCl2K2HPO4FeSO4·7H2O、クエン酸ナトリウムと 2 mM、0.1 mM、12 g/L、11 mg/L、75 mg/L の最終濃度にチアミン、7.5 μ g/L をそれぞれ追加します。
    2. 2'-フロリダひずみ、例えば、JM109 gwBC-f2 キー、5 mL の LB 培地での生産、バウムガルトナーら12で説明したよう、37 ° C で一晩成長の培養を開始します。
    3. 1% ステップ 1.3.3 で 250 mL 最小媒体を準備した 3.1.1 の前述のようにサブカルチャー。10 g/L の最終的な集中にグリセリンを追加し、37 ° C で文化を孵化させなさい
    4. 文化では、0.5 〜 0.7 の OD600に達すると、0.5 mM と 2 g/l. の最終的な集中に乳糖の最終的な集中にイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加します。
    5. 連続的な揺れで 37 ° C で、24 h の成長文化。
  2. 2'-FL の抽出
    1. 一晩文化を転送すると、50 mL の滅菌チューブと 900 × gで 15 分間遠心します。
    2. 3.2.2 上澄みを廃棄し、DI 水で餌を再停止します。洗浄ステップを 3 回繰り返します残留乳糖を削除し、最後に再・ ディ ・水 5 mL で中断します。
    3. 細胞懸濁液を溶解するには、30 秒のパルスで、30% の電力で、超音波発生装置を使用します。すべての回で氷の上細胞を保ちます。
    4. 2,000 x gで 25 分の分離細胞を遠心します。上澄みを除去、生殖を通じて渡すこと (例えば、0.22 μ m) フィルター、分析まで 4 ° C で保存します。
  3. バイオ センサーと定量化
    1. 2'-FL バイオセンシング細胞と中間ログ段階で文化を接種する、2'-FL セクション 2.2 で説明されているように検量線を作るための推定濃度に相当する細胞ライセートを誘発します。分析するサンプルとして同じ環境でキャリブレーションを実行 (例えば、細胞ライセート) 2'-FL の希釈液をコントロールに追加することによって (すなわち、非生産) フィルター処理された細胞ライセート バイオ センサー細胞を誘導する前に。
    2. 流れの cytometer でサンプルを実行します。オリゴ糖濃度に対する蛍光出力をプロットすることによって用量反応曲線を生成します。細胞ライセートに標準の応答と比較します。

4 乳糖の選択的除去

注: バイオセンシング細胞が乳糖に敏感、選択的に乳糖を Hmo を検出するバイオ センサーが望ましい。1 つの戦略には、セクション 3.2 で説明したセルの洗浄が含まれます。他の 3 つの戦略は次のとおりです。

  1. 商業精製した β-ガラクトシダーゼと治療
    1. 1,000 (FCC ラクターゼ) 単位/ml、1 mM MgCl2に凍結乾燥の β-ガラクトシダーゼを溶解またはソリューションで商業の β-ガラクトシダーゼを使用します。
    2. ために必要な酵素の最適濃度を決定する 2'-FL バイオセンシング細胞の接種材料の成長し、2 グラム/L の乳糖と 2.9 g/L 2' を誘導する-中旬ログ段階でフロリダ。
    3. 100 μ L 文化に、β-ガラクトシダーゼ、最大 12 単位の変数量を追加し、継続的な揺れで 37 ° C で一晩成長文化。
    4. セクション 2.1 で説明されているように、蛍光を測定し、最低限酵素濃度を決定する信号の減衰を目的を達成するために必要な酵素の最適なユニットを計算します。
    5. 24 h の 2'-FL 生産細胞、β-ガラクトシダーゼの最適なユニットを追加し、37 ° C で一晩インキュベートセクション 3.3 で説明したように 2'-FL 価を決定するためのプロトコルを続行します。
  2. LacZ + ひずみによる前処理
    1. 25 mL 文化 2'-FL 生産ひずみと中間ログ段階で誘発を開始、24 h の 37 ° C で文化を孵化させなさい。
    2. 大腸菌BL21 を接種する (DE3) 文化 LB、37 ° C で中間ログ段階に成長し、24 h 文化文化 (2:1) 50 mL を追加。
    3. セクション 3.3 で説明したように 2'-FL 価を決定するためのプロトコルで 3 h 続行 37 ° C で孵化させなさい。
  3. エタノールと乳糖の沈殿物
    注: このセクションは、松木ら12から適応されます。
    1. 25 mL 文化 2'-FL 生産ひずみと中間ログ段階で誘発を開始、37 ° C 24 時間インキュベートします。
    2. 文化に 100% エタノールの 2 つのボリュームも、振るし、, 4 h の 37 ° C で追加します。
    3. 遠心分離機の 900 x gで 15 分間収集の懸濁液上清と 4 ° c で、乳糖を沈殿させる一晩インキュベートします。
    4. フィルター紙 (11 μ m) を使用してソリューションを渡すことによって沈殿した乳糖を削除します。ライセート 2'-フロリダの次のセクション 3.3 で定量化することができますが含まれているセルは、ろ液を集めます。

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結果

2'-FL のオリゴ糖バイオ生産と組み合わせて使用できる固有セル全体バイオ センサーを考案しました。これは乳糖を生成するターミナルの糖を変更する特定の酵素胸の谷間に依存とそれにより比例する乳糖誘導性プロモーター レポーター蛍光タンパク質の発現につながるlacオペロンの活性化、2'-フロリダ州の量そのリンケージの特異性, 3-fucosyllactose (3 FL), を異性体を示すテストされています。遺伝の回路に 2 つの部分が含まれています: fucosidase 遺伝子、 afcAまたはafcB、構成プロモーター発現の結果によって駆動されるエンコードされた pelB の信号系列を持つベクターにクローンを作成する fucosidase 遺伝子の上流GFP 発現を運転 T7 プロモーターを含む蛍光レポーター システムと同様、ペリプラズム エクスポートを容易にします。最初の部分は、プラスミド pAfcA とプラスミド pET28:GFP の 2 番目のレポーター システムに表現されます。最終的な構造はエシェリヒ...

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ディスカッション

母乳オリゴ糖次のリンケージ固有の検出のための高スループット戦略を提案します。これは、大腸菌その特定の糖鎖を持つ誘導蛍光信号で応答を遺伝子工学で全細胞バイオ センサーを構築することにより達成されました。プロトコルは、バイオ センサーを使用して検出し、菌株の代謝改変で Hmo を定量化する方法についても詳しく説明します。

提案プロトコルでは、ガスクロマト グラフ/質量方法と比較してそのリンケージ特異性に加えて高スループットのための代替の方法上の利点を提供しています。検出と広いダイナミック レンジの下限は、Hmo の直接測定が可能です。

このプロトコルの重要なステップは、セル生産菌株のライセートの調製で発生します。2'-フロリダ州の最大の力価を確保するため、最適な条件を提供するために重要です。バッチ処理で変動超音波の照射パラメーターまたは誘導のため発生します。バイオ センサーの解析時に注意が必要があります。また、実験結果の一貫性を確保するために適切なコントロールのすべてのステップを実行することをお勧めします。

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、アイオワ州立大学スタートアップ資金によって支えられました。F. e. は NSF Trinect 親睦とマンリー ホッピ教授によって部分的に資金を供給されました。T.J.M. は、カレンとデニー ・ ヴォーン教員フェローシップによって部分的に支えられました。著者らは、蛍光と LC MS 研究アイオワ州立大学流れ Cytometry 施設と支援のため W.m.keck メタボロミクス研究所をありがとうございます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2'-フコシルラクトース カーボシンセス 41263-94-9
3-フコシルラクトース カーボシンセス 41312-47-4
天フィッシャーサイエンティフィ
塩化カルシウム、二水和物フィッシャーサイエンティフィC79-500
カルベニシリン フィッシャーサイエンティフィBP26481
デキストロース(D-グルコース)、無水フィッシャーサイエンティフィックD16-1
フローサイトメーターBDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100シリーズ HPLCシステム
HPLCカラムLunaC18 逆相カラム
カナマイシンフィッシャーサイエンティフィック
LBブロス、ミラー フィッシャーサイエンティフィック12-795-027
ラクトースフィッシャーサイエンティフィック64044-51-5
M9、最小塩、5xSigma-AldrichM6030
硫酸マグネシウム、無水フィッシャーサイエンティフィックM65-500
MSAgilent Technologies質量選択トラップ SL 検出器
塩化ナトリウムSigma-Aldrich7647-14-5
ナトリウム二塩基性Sigma-Aldrich7558-79-4
ナトリウム一塩基性Sigma-Aldrich13472-35-0
寒ックBP9744500ックック 11815024リン酸リン酸

参考文献

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