方法論記事

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

DOI：

10.3791/59290

⸱

2019年4月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、脂質液滴分離と老舗の小胞体分離キットを使用して、マウス肝臓から精製法を確立します。

要約

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脂肪滴 (LDs) が最も真核生物と原核細胞の細胞質内にある生理活性細胞小器官です。LDs は、中性脂質はリン脂質とタンパク質の膜によって包まれて構成されます。肝の LD 脂質、セラミド、タンパク質などは、脂肪肝を引き起こすいくつかの病気に関与しています。以前の方法は LD の分離のために設けられて、彼ら試薬の時間のかかる準備を必要とする、複数の細胞内コンパートメントの分離のために設計されていません。我々 は単一のマウス肝リソソーム、小胞体 (ER)、LDs の分離を有効にする新しいプロトコルを確立しようとしました。

さらに、ここで提示されたプロトコルで使用されるすべての試薬は市販、LD の純度を損なうことがなく最小限の試薬の準備を必要とします。ご紹介ショ糖勾配プロトコルでは、この新しいプロトコルの比較データと同等の純度や形態、収量を示します。さらに、私たちを分離できます ER と同じサンプルを使用して形成と脂質との関連タンパク質の細胞内のフラックスに詳細な洞察力を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs は、真核生物細胞の細胞質およびいくつかの原核細胞1,2,3生理活性細胞小器官。LD コアは、中性脂質はトリグリセリド (TG) とコレステロールのエステルなどから構成されています。それらはまた細胞シグナリング経路4,5に関与する生理活性脂質セラミドを含んでいます。LDs はリン脂質の膜に囲まれた、perilipin 蛋白質 perilipin 2 (PLIN2) と 3 (PLIN3)1,5,6を含むタンパク質でコーティングします。また現在は脂肪酸合成系酵素、リパーゼと非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性肝疾患と C 型肝炎3,5 を含むいくつかの肝 steatotic の病気にリンクされている膜輸送タンパク質 ,6,7,8,9,10。

LDs は、小胞体の外側の膜から形成し、小胞体由来の遊離脂肪酸11から新たに合成された TG を含むと考えられています。しかし、それは不明のままプールされた脂質が芽かどうか接続したまままたは、ER6,11, LDs の技術的に挑戦的な小胞体からの分離を行うから摘出しました。遊離脂肪酸は、エネルギー生産や膜の合成を提供する表面リパーゼの作用によって LDs から解放することができます。また、LDs は、調節機構と遊離脂肪酸12を生成する lipophagy を介して低下する可能性が。

小胞体、リソソームのほかは、他の細胞器官-ミトコンドリア、エンドソーム、ペルオキシソーム、原形質膜など-LDs11の密接な関係内に発見されています。このタイトな一夫多妻制では、純粋な LD 抽出を実行する困難になります。しかし、中性脂質の生得的な低密度活用できますの遠心分離5を介して。

伝統的に、LDs はショ糖密度勾配1,5,13を使用して分離されています。ただし、これらのメソッドは、他の細胞器官の分離にない設計されています。また、試薬の時間のかかる準備が必要です。このプロトコルの適応市販小胞体分離 (材料の表を参照) をキット LD 分離を可能にします。我々 は、LD 分離ステップを追加するキットによって提供される抽出バッファーを使用します。さらに、プロトコルは、小胞体、リソソームの分離が LDs のライフ サイクルのより包括的なイメージを可能にする、同じサンプルを使用しての使用もできます。この新しい方法を検証するため、我々 の LD 収量、形態、サイズ、および純度試金します。LD 分離のショ糖密度勾配を利用した広く使用されているプロトコルで得られたものにここで提示される結果を比較する.

20 g 女性 c57bl/6 マウス断食 16 h (9 LD 分離時間の 17 時の食品除去) 水への無料アクセスと、我々 は、10-12 週-旧を使用します。TG の典型的な利回りは 0.6 mg/g 肝臓と LD 蛋白質それは 0.25 mg/g の肝。これは SDS のページで 10 ~ immunoblots の十分な材料を提供します。以下のプロトコルは、使用される試薬および単一 1 g 肝臓に適したプロトコルについて説明します。サッカロースの勾配の隔離のプロトコルは、佐藤14武15から適応されます。

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プロトコル

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バイオ セーフティ レベル 1、白衣、手袋、安全ゴーグルなど適切な保護具の実験室ベンチにすべての実験を行った。実験は機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルバニア大学によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物の不快感を最小限に抑えるために行われたすべての努力と、動物が人道的なケアと扱われました。

1. LD 分離 ER 分離キットを使用

  1. 準備
    注: 記載されている金額は単一 1 g マウス肝に適しています。
    1. 5 x IE バッファー 8 ml の超純水水 2 mL を希釈して 10 mL の 1 x アイソトニック抽出バッファー (小胞体分離キットから IE バッファー) を準備します。氷の上に置くことでバッファーをクールします。
    2. 超純水水 90 mL に 10 x PBS の 10 mL を希釈して 100 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 を準備します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    3. PGPE 9.5 mL の純水で希釈 500 μ 5% ポリエチレング リコールp-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) フェニル エーテル (PGPE) の 10 mL を準備します。1 mL の注射器を使用すると、粘性である PGPE を測定します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    4. 氷の上にそれらを置くことによってすべてのチューブを冷却: 13 mL 遠心チューブ 50 mL 高速遠心チューブ、15 mL 遠沈管 1.7 mL 遠心チューブ。
    5. 4 すべての必要なの遠心分離機をクールな ° c: 遠心機、15 mL の大容量遠心チューブ、50 mL のチューブと、超遠心機、高速遠心分離。
    6. 鉗子と解剖はさみをオートクレーブで滅菌します。
  2. ティッシュの準備
    1. 頚部転位を実行することによって 100% CO2で 10 分間確認安楽死で満ちていた区域で配置することによって、マウスを安楽死させます。
    2. 滅菌鉗子と肝臓を公開する後方/前方軸上腹部の皮膚と筋肉層をカット、解剖はさみを使用してください。
    3. 横隔膜と腸に肝臓を接続する靭帯をカットします。靭帯を公開するのに、後方に向かって、肝臓から腸を引き抜いてに鉗子を使用します。
    4. 肝臓や肝臓を解放するまで後方前方から移動、背胸部間カットします。
    5. 肝を冷 5 cm 10 mL の冷 1x PBS でシャーレに転送します。
    6. 2 肝臓を洗って 5 cm シャーレで 4 ° C で 5 分間冷 1x PBS の 10 mL のロッキングのプラットフォーム上の x。最終的な洗浄後 1 × PBS を注ぐ。
    7. サイズ 10 滅菌外科ブレードを使用 (材料表を参照) を 5 cm シャーレ (図 1 a) で 3-5 mm の部分に肝臓をサイコロします。
    8. さいの目に切った肝臓 2 を洗って 5 cm シャーレで 4 ° C で 5 分間冷 1x PBS の 10 ml x。
      注: リソソームの分離、0.5 g の肝臓をきれいな 45 mL ホモジナイザーに転送し、リソソームの抽出によって提供される指示に従ってくださいキット (材料の表を参照してください)。
    9. 1x PBS をデカントし、さいの目に切った肝部分を冷たい 45 mL Dounce ホモジナイザーに転送します。すべての作品は、ホモジナイザーの下に行くを確認します。
    10. 7 mL の小胞体分離キット) (からの冷たい 1 x IE バッファーを追加し、氷の上を 20 倍上下杵を動かすことによって均質化します。杵が各ストローク中に、ホモジナイザーの下に行くを確認します。
    11. 冷たい 15 mL 遠心管に磨砕液 (図 1 b) を転送します。
    12. 1 ml の冷たい 1 x (小胞体分離キット) から IE バッファーのホモジナイザーをすすぎ、これを磨砕液の残りの部分に追加します。
  3. LD 分離
    1. 4 ° C (図 1) で 10 分、1,000 x gで大容量遠心分離でホモジネートを遠心分離によって核を削除します。
    2. 新しい、冷たい 50 mL の遠心管に postnuclear 上清 (PNS) を転送します。LD の損失を防ぐため、15 mL チューブの上部に集め、脂質は PNS を転送する前に再停止されることを確認します。
    3. 100 μ L の純度分析 PNS の因数と冷たい 1.7 mL 遠心チューブに場所ください。それは氷の上の脇を設定します。
    4. 遠心分離機の PNS のサンプル、ない因数、4 ° C で 15 分間、12,000 × gで冷蔵高速遠心分離機で、ミトコンドリアを削除するには
      1. オプション:原油 LD (CLD) 分離 (細胞質、細胞膜汚染と)、ガラス ピペットを使用してトップの脂質層を収集し、1.7 mL 遠心チューブにそれを転送します。セクション 1.4 を続けます。
    5. 超遠心機チューブにポストミトコンドリア上清 (PMS) を転送します。LD の損失を防ぐため、屋上に集まったすべての脂質は、PMS を転送する前に再停止されることを確認します。
    6. 100 μ L の純度分析における PMS の因数を取るし、冷たい 1.7 mL 遠心チューブに配置。それは氷の上の脇を設定します。
    7. X チューブ遠心中崩壊を防ぐために IE バッファー冷たい 1 であふれんばかりに遠心管を埋めます。
    8. サンプルのバランスし、4 ° C (図 1) で 60 分 100,000 × gで超遠心機で遠心分離機のそれら。
    9. LD のレイヤーを削除するには、傾斜 45 ° の角度で管とガラス ピペットを使用して吸引します。冷たい 1.7 mL 遠心チューブにペレットを転送します。
      注: ペレットには、孤立した小胞体が含まれています。小胞体分離のため下流分数を使用します。
    10. 100 μ L の純度分析における脂質層の下のポスト ER 上清 (PER) を収集します。
  4. LD の洗濯
    1. 1.3 mL の容量に、1.7 微量遠心チューブに %LD 分画に 1x PBS を追加します。
    2. 渦サンプル。
    3. 任意の細胞の残骸をペレットへの 4 ° C で 5 分間全速力で遠心機で遠心分離機します。LD レイヤーを再懸濁しますを助けるために手で軽くチューブを暖かきます。新しい 1.7 mL の遠心管に、脂質層を含む上清を転送します。
    4. 1.4.1–1.4.3 の手順を繰り返します 2 x-3 x、ペレットが表示されなくなるまでです。
    5. 1x PBS を 1.5 mL の最終巻に培養上清中のペレット無料 LD に追加します。4 ° C で 5 分間全速力で遠心機で遠心分離によって脂質画分を洗う
    6. 脂質層を乱すことがなく、ガラス ピペットで 1 mL の 1x PBS (脂質層) の下にあるを削除します。
    7. 1.4.5 と 1.4.6、手順 4 の x-5 x、1 × PBS が濁りのない視覚的に透明になるまで。
    8. すべて削除 (図 1E) ガラス ピペットを使用して 1 × PBS 脂質層の下。
    9. 下流の分析の結果、純粋な LD 分数を使用します。
  5. ビシンコニン酸法による LD タンパク質定量
    注: は、LD の形態が評価する場合ビシンコニン酸アッセイ (BCA) を使用しないでください。
    1. 500 μ L の 5 %pgpe で LD を再懸濁します。
    2. 95 ° C で 5 分間試料を沸騰渦、クールに 5 分間、室温でサンプルをインキュベートし、。
    3. 手順 1.5.2 追加 2 倍。
    4. 30 5 分サンプルを超音波 s オン/オフでは中程度の強度、サイクル。
    5. BCA アッセイによってすべての純度分析サンプル、LD の一部の蛋白濃度を測定することにより試料を正規化します。

2. LD 分離ショ糖密度勾配を使用

  1. 準備
    1. 200 mL の TE バッファー (10 mM トリス-HCl 【 ペーハー 7.4、1 mM EDTA [pH 8.0]) を確認します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    2. TE バッファーで 100 mL に最終巻をもたらす TE バッファー中のスクロースの 60 g を溶解することにより 60% (w/v) ショ糖溶液 100 mL を作る。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    3. 60% ショ糖の 4 mL を 2 mL の TE バッファーに追加することによって 40% (w/v) ショ糖溶液 6 mL を作る。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    4. 60% ショ糖の 2.5 mL を 3.5 mL の TE バッファーに追加することによって 25% (w/v) ショ糖溶液 6 mL を作る。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    5. 60% ショ糖の 0.7 mL を 3.3 mL の TE バッファーに追加することによって 10% (w/v) ショ糖溶液 4 mL を作る。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    6. ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を 1 錠を 10 mL の TE バッファーに追加することでプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤溶液 10 mL を作る。
    7. 組織ホモジネート バッファーを準備するには、60% ショ糖原液 50 mL にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤ソリューションの 4 つの mL を追加します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    8. プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤溶液 2 mL を 50 mL の TE バッファーに追加することで、オーバーレイのバッファーを準備します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    9. 90 ml の超純水の 10 の x PBS の 10 mL を希釈して 100 mL の 1x PBS を準備します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    10. 10 ml 5% の純水の 9.5 mL で PGPE の希釈 500 μ L で PGPE。1 mL の注射器を使用すると、粘性である PGPE を測定します。氷の上に置くことでそれを冷やします。
    11. 氷の上にそれらを配置することによって次の遠沈管を冷却: 13 mL 遠心チューブ 50 mL 高速遠心チューブ、15 mL 遠沈管 1.7 mL 遠心チューブ。
    12. 4 必要なの遠心分離機をクールな超遠心機、(50 mL 用)、高速遠心分離機 (15 mL チューブ) の大容量遠心遠心、° c: です。
  2. ティッシュの準備
    1. 手順 1.2.1–1.2.9 を使用して、均質化のために組織を準備します。
    2. 7 mL の冷たい組織ホモジネート バッファーを追加し、20 倍上下杵を動かすことによって氷の上それを均質化します。最初の 5 つのストローク中に、杵は、ホモジナイザーの下に行くを確認します。
    3. 冷たい 15 mL 遠心管に磨砕液を転送します。
    4. 1 ml の冷たい組織ホモジネート バッファーのホモジナイザーを洗い、以前使用していた 15 mL 遠心管にそれを転送します。
    5. 磨砕液のボリュームをもたらす組織ホモジネート バッファーを 10 mL まで。
    6. 4 ° C で 10 分間 1,000 x gで大容量遠心分離機のサンプルを遠心分離します。
    7. 上清の 8 mL を 50 mL の遠心管に転送します。
    8. PNS 純度分析サンプルとして残りの上清の 100 μ L を転送します。
  3. ショ糖密度勾配
    1. 45 ° の角度で PNS の 8 mL を含む 50 mL の遠心管に傾斜します。6 mL 40% ショ糖液、2 つのフェーズ別々 のご滞在を確保するを慎重に追加します。
    2. 同様の方法で徐々 に 25% ショ糖溶液 6 mL を追加します。その後、10% ショ糖溶液 4 mL を追加します。最後に、8 mL のオーバーレイ バッファーを追加します。
    3. 30 分間、4 ° C で 30,000 × gで高速遠心分離機のサンプルを遠心します。
    4. 1.7 mL 遠心チューブに LDs を含む最上位のレイヤーに転送します。
    5. LD 洗濯セクション 1.4 で手順に従います。

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結果

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約 30 マウスに ER キットと LD 分離を行い約 40 マウスに対するショ糖の隔離のプロトコルを次のものと結果を比較しています。報告の内容は、両方のプロトコルのために典型的。マウスが LD の収率を高めるために、水への無料アクセスを一晩絶食。ショ糖密度勾配を用いた LD 分離は、ER キット LD の隔離のプロトコルと並行して実行されました。Pns、PMS、サンプルあたり、CLDs、および LDs ER キット LD の隔離のプロトコルを通して収集されました。ショ糖の隔離のプロトコルのワークフロー制約のため PNS と LD 分離のみを集めました。

蛍光顕微鏡用分離 LDs の 50 μ L と 100 μ M 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI) の等量混合。サンプルはライトから保護され、30 分間室温でインキュベートします。サンプルは、...

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ディスカッション

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肝の LD の生物学はますます健康と病気で肝細胞生理学の重要な調節因子として認識されています。真正な細胞小器官として LDs は動的な他の細胞構造と対話し、中糖・脂質のホメオスタシスに関与するそれらの生理活性成分が含まれて。ショ糖密度勾配 LD 分離に日常的に使用でき、LD の構造を研究する研究者が、それの多数のバッファーを作成する必要があります。我々 は変動への応答における細胞動態のより包括的なビューを可能にする市販の小胞体分離キットの利用は LD 分離だけでなく、小胞体、リソソームのタンデムの分離のために使用できる別のツールを示しています。実験条件は、ワークフローの大幅な増加なし。

この新しいプロトコルの強さは市販を使用してセットアップまたは容易に入手できる試薬と複数細胞小器官を同時に分離する能力の使いやすさです。しかし、心に留めてこの新しいメソッドの潜在的な欠点があります。このプロトコルのいくつかのステップ肝臓から超大型の LDs の分離に不利益を与える可能性があります。Dounce 均質化せん断応力による大規模な LDs を混乱させる可能性があります。ゆったりした Doun...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

博士カーは、医薬品のインターセプトから研究サポートを受け取ります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アブラムソン家族がん研究所に感謝いたします。この作業は次の補助金によってサポートされて: ハロルド ・ アモス医学部開発賞、ロバート ・ ウッド ・ ジョンソン財団、NIH/NIAAA K08 AA021424 NIH/NIAAA R01 AA026302-01 7158、IDOM コンゴ民主共和国パイロット賞 P30 DK019525 (R.M.C.);NIH/NIAAA F32 AA024347 (J. C.)。この作品は NIH P30-DK050306 によって部分で支えられましたし、(分子病理学とコアのイメージング、分子生物学・遺伝子発現コア細胞文化の中心) の中核施設とそのパイロット プログラムを与えます。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BioExpress ボルテックスミキサーGeneMateS-3200-1ボルテックスミキサー
遠心分離機 54242 Rエッペンドルフ54242 R冷蔵カウンターマイクロ遠心分離機
ローター:FA-45-24-11
遠心分離機 Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+冷蔵高速遠心分離機
ローター:F21S-8x50y
遠心分離機 Sorvall Legend RT+Thermo ScientificレジェンドRT +冷蔵大容量遠心分離機
ローター:75006445 バケツ:75006441
cOmplete プロテアーゼ阻害剤シグマ アルドリッチ04 693 116 001プロテアーゼ阻害剤錠剤
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200超音波処理システム
ダウンス ティッシュグラインダー (45 mL)ウィートン357546ルーズ ペトルを使用
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)Corning21-031-CM
小胞体単離キットSigma AldrichER0100ERキット用 抽出:
内容:
等張抽出バッファー 5X 100 mL
低張抽出バッファー 10 mL
塩化カルシウム、2.5 M 溶液 5 mL
OptiPrep 密度勾配中 100 mL
鈍い鼻の針 1 個。
蛍光励起用外部光源ライカ EL6000
塩酸Sigma AldrichH1758塩酸
ImageJ画像解析ソフトウェア
倒立コントラスト顕微鏡ライカDM IRB
組織・培養細胞用リソソーム濃縮キットサーモフィッシャー科学89839リソソーム分離
顕微鏡カメラ用 QimagingQICAM 高速 1394
オプティマ XL-100K 超遠心分離機ベックマン・コールターXL-100K超遠心
ローター: SW41Ti
パスツールピペットフィッシャー・サイエンティフィック22-042817
ペトリ皿 5 cmフィッシャー・サイエンティフィックFB0875713A
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001ホスファターゼ阻害錠
滅菌外科用ブレード #10PioneerS2646
スクローFisher ScientificS5-500結晶性/認定 ACS
トリグリセリド リキカラー キットStanbio 2200-225比色トリグリセリドキット
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP152-1TEバッファー用
トリトンX-100ッシャーバイオ試薬BP151-1005%、ポリエチレングリコールp-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル、タンパク質溶解試薬
UltraPure EDTA(0.5M、pH 8.0)サーモフィッシャーサイエンティフィック15575-038TEバッファー用
カクテル ス フィ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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