マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
消化された組織に由来するオルガノイドは、多細胞三次元 (3D) 構成要素であり、細胞単層よりもインビボ条件においてより良い不在を有する。これらは、生体内の複雑さを完全にモデル化できませんが、元の臓器のいくつかの機能を保持します。がんモデルでは、オルガノイドは、腫瘍細胞の浸潤を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは正常な、照射されたマウス乳腺組織からのオルガノイドを発達させることを特徴とし、正常組織における放射線応答を評価することを目的とする。これらのオルガノイドは、放射線照射されたオルガノイドとの腫瘍細胞相互作用を評価するために将来のインビトロ癌研究に適用することができる。乳腺を切除し、20 Gy に照射し、コラゲナーゼ VIII 溶液で消化した。上皮のオルガノイドは遠心分化によって分離され、3D オルガノイドは96の低付着性マイクロプレートで開発しました。オルガノイドは、特徴的な上皮マーカーサイトケラチン14を発現した。オルガノイドとのマクロファージ相互作用は、共培養実験で観察された。このモデルは、腫瘍間質相互作用、免疫細胞の浸潤、および照射された微小環境内のマクロファージ偏波を研究するのに有用である可能性がある。
概要
3つの否定的な乳癌 (TNBC) の患者のおよそ 60% は処置1の形態として乳房温存療法 (BCT) を選ぶ。この治療モダリティでは、乳房組織の一部を含む腫瘍を除去し、周囲の正常組織を電離放射線に曝露して、任意の残留腫瘍細胞を死滅させる。治療は、乳癌集団の多くで再発を減少させます;しかし、TNBC 経験を持つ治療された患者の約 13.5% が2を再発局所領域的。したがって、放射線がどのように循環腫瘍細胞 (CTCs) を募集するかを研究することは、局所再発3,4における重要な洞察につながります。
従来の研究は、正常組織の放射線が様々な細胞型5の動員を増加させることを示している。TNBC の前臨床モデルにおいて、正常組織の照射はマクロファージを増加させ、続いて正常組織5に腫瘍細胞を動員する。免疫状態は、照射部位への腫瘍細胞の動員に影響を与え、腫瘍細胞の遊走は免疫不全の被験者で観察された。乳腺に由来するオルガノイドを用いてこれらの相互作用を概説することで、細胞遊走と細胞間相互作用を顕微鏡検査と生細胞イメージングでリアルタイムに観察し、変化による放射線損傷の役割を決定すること....
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プロトコル
動物実験は、ヴァンダービルト大学組織動物ケア・ユース委員会によって承認された制度的ガイドラインとプロトコルに従って実施した。
1. マウスおよび細胞の獲得の準備 (グエン・ゴック et al.11から適応)
- 犠牲無胸腺 Nu/Nu マウス (8-10 週齢) を使用して、co2 窒息の後に頚部脱臼が続きます。70% エタノールを使用して皮膚をきれいにします。
- 切除は、滅菌済みのはさみおよび鉗子を使用して、マウスから腹部および鼠径乳腺を採取します。切除前にリンパ節を除去する。滅菌1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ですすいでください (図 1a)。
- 輸送用のダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F12 (DMEM/F12) 10 mL の 15 mL チューブに入れてください。サンプルは4° c で一晩保存するか、すぐに処理することができます。氷の上に保管してください。
- セシウム源を用いて 20 Gy で試料を照射する (図 1b)。
- 45分照射後、乳腺を 35 mm の無菌細胞プレートに入れ、メスでミンチする (図1c、D)。約40のストロークでミンチ....
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結果
照射した上皮乳腺オルガノイドをマウス乳腺から正常に取得し、処理し、低付着性プレート上で培養した (図 1)。オルガノイド収率は、異なる増殖環境で播種することによって試験された (図2a − G)。組織培養に直接播種された細胞は 10 cm の細胞版を処理し、線維芽細胞の増殖を引き起こした。線維芽細胞は、オルガノイドと同じ焦点のまたはその近くの位相コントラスト顕微鏡下で同定され、そして彼らはすぐに数日以内にめっきオルガノイドから成長した。オルガノイドが基底膜とコラーゲンタンパク質マトリックスに播種されたとき、線維芽細胞の伸長も観察されました (図 2e, F)。
照射されたオルガノイド成長の最適化において様々な条件を試験した (図 2h)。コラゲナーゼのhistolyticum由来の I および VIII は、オルガノイド消化ステップ12
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ディスカッション
このプロトコルでは、照射された乳腺オルガノイドの再生可能な成長と特性評価のための方法を開発しました (図 1)。20 Gy の照射用量を、腫瘍細胞リクルート5の前インビボモデルを鏡映するために適用した。オルガノイド形成の前にインビボの乳腺の照射は、免疫細胞の対応する浸潤を伴わずに放射線損傷の影響を単離することを可能にした。インビトロ照射正常組織モデルの開発により、放射線誘発 CTC 動員11,12に寄与し得る細胞相互作用のリアルタイム表示が可能になる。
1.5 ~ 1.18 のステップに密接に従うことは、オルガノイドの収量を最大化するために重要でした。私たちは、消化液に濃縮コラゲナーゼの、融解したアリコートを加えた。濃縮されたコラゲナーゼアリコートの非常に粘性の高い性質のために、量にいくつかの変化があり、したがって酵素活性である可能性があるので、過剰消化を避け.......
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開示事項
作者は何も開示することはありません。
謝辞
私たちは、GFP と dTomato 標識の生264.7 マクロファージを提供するために、Dr. ローラ l. Bronsart に感謝します。本研究は、NIH 助成 #R00CA201304 による財政的支援であった。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10% 中性緩衝ホルマリン | VWR | 16004-128 | |
| 抗サイトケラチン 14 | abcam | ab181595 | ロット: GR3200524-3 |
| ウシ血清アルブミン | Σ | A1933-25G | |
| コラーゲン I 型 | Corning | 354236 | |
| Clostridium Histolyticum、タイプ VIII | シグマ | C2139 | |
| からのコラゲナーゼコラゲナーゼ I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | サーモフィッシャー | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-カドヘリン | 細胞シグナル伝達 | 24E10 | ロット: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| ゲンタマイシン | Gibco | 15750 | |
| ヤギ抗ウサギ二次 | abcam | ab150077 | green ロット: GR3203000-1 |
| ヤギ抗ウサギ二次 | abcam ab150080 | red ロット: GR3192711-1 | |
| Hoechst 33342 | フィッシャー | 62249 | ロット: TG2611041 |
| インスリン (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| インスリン-トランスフェリン-セレン, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| マトリゲル基底膜 (Engelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫から抽出した基底膜) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | ||
| Phalloidin | abcam | ab176757 | ロット: GR3214582-16 |
| タイトジャンクションタンパク質 1 | Novus | NBP1-85047 | ロット: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート) | シグマ | P1379-100ML |
参考文献
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K.
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