免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.
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この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエ蛹網膜は、開発中に地形形成過程の研究のためのエクセレント モデル システムを提供します。繊細なショウジョウバエ蛹網膜の解剖のための信頼性の高いプロトコルを提案します。私たちの外科的アプローチは、蛹を開き目脳錯体を正確に抽出するすぐに利用できるレーザーマイクロダイ セクション ツールを利用しています。これら固定、免疫組織化学と網膜を受けるし、顕微鏡スライド上にマウントでき、目標は細胞または細胞レベル下の構造を検出する場合をイメージします。また、固定されていない網膜脳組織から分離された、適切なバッファーで分離でき (それぞれ、タンパク質や遺伝子の発現を評価する) の蛋白質のゲル電気泳動や mRNA の抽出のために利用します。重要な練習と忍耐、レーザーマイクロダイ セクション プロトコルを習得する必要がありますが、プロトコルにより主に破損していない網膜の比較的簡単な分離、一度マスター。
概要
ショウジョウバエ網膜は、ハニカム格子1,2,3,4に配置された色素細胞に囲まれた約 750 個ので構成されます。各 ommatidium には、8 つの光受容器ニューロン、レンズ分泌 4 つの錐体細胞、2 つの主な色素細胞が含まれています。各 ommatidium の周辺には、格子の色素生産細胞、感覚毛のグループ。分裂の性質などステレオタイプの六角形配置によりショウジョウバエ蛹網膜は細胞接着5,6を含む地形形成過程の研究のためエクセレント モデル システムを提供します。 7,8,9,10とアポトーシス11,12,13,14,15。
いくつかの公開されているプロトコルはショウジョウバエ蛹16,17,18から目脳錯体を抽出する空気の圧力を利用します。説明されたプロトコルはここで代わりに慎重にレーザーマイクロダイ セクション ツールを利用し、破損していない網膜組織を得ることが目標と目脳錯体を正確に分離します。これは重要なために利用する場合は網膜形態、タンパク質や遺伝子発現解析網膜への損傷は、細胞ストレスまたは死は、細胞の表現型および遺伝子発現を変更で起因できるので。さらに、10 〜 15 分、年齢と切り裂かれた眼組織の発達段階の変動を最小限に抑えるという目標を促進することで、練習後、6 に 10 目脳錯体を分離できます。
固定、染色、および下記全体マウント プロトコル、ショウジョウバエの目の蛍光顕微鏡検査のための準備に適しています。網膜は、抗体は興味の蛋白質をターゲットに培養することができます。たとえば、単接合部品に抗体を活用して、細胞の頂端の外周を可視化できるようにセルの種類を含む特性、形状と配置評価19ことできます。、固定する前に目は西部の分析のための蛋白質または qRT PCR 用 RNA、RNA シーケンスを抽出するための脳から代わりに切断することができます。
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プロトコル
1. ティッシュの準備
- ショウジョウバエを設定 (前述20) を越える目的の遺伝子型の蛹を取得する特定のショウジョウバエ系統の文化や。確保するため、多数の蛹が偶然出てくる、栄養豊富な食品メディアまたは寛大酵母ペーストを添加した標準的な食品メディア複製でこれらのフライの文化を確立します。
- 25 ° C でのショウジョウバエの文化を維持します。UA GAL4 システム利用の十字、 GMR GAL4は幼虫目ディスク細胞形成の溝と蛹の発育21,22,23,後部で理想的なドライバー24. クロスUAS lacZ X GMR GAL4理想的なコントロールとしてクロスそれドライブ非内因性と不活性の β-ガラクトシダーゼ蛋白質の表現として。
- ウェット蒸留水優しく健全な文化バイアル (図 1 a) の側から白い前蛹 (図 1 b) を持ち上げ、1.5 mL 容マイクロ チューブ (図 1) に配置されている 6"竹スプリントのヒントを使用します。
- 室に乾燥 (図 1) から蛹を保護するために十分な湿度を維持するために蒸留水に浸したティッシュの小さい部分と共にプラスチック ピペット チップ ボックスにチューブを配置します。25 ° C で蛹を解剖までインキュベートします。
- 遠心チューブからと解剖皿黒に蛹を優しくプッシュするのに乾燥 6"竹の添え木を使用します。蛹から解剖皿の上に両面テープの新鮮な作品を置きます。
- テープ (図 2 a) の上に (すなわち、operculums 上向き、図 1 b) を蛹の背側を置く慎重にピンセットのペアを使用して。蛹がテープによく付着することを確認します。
注: 蛹の場合水分がテープを安全な接着を阻害する場合、両面テープの上に置く前に空気乾燥に蛹を許可します。
2. 目脳錯体の解離
- 鉗子を使って、各の蛹 (図 2) の蓋を外します。
- 顕微解剖はさみを使用して、スライスまたは各蛹の蛹のケースを開いてカットします。フラップは、頭、胸部、両面テープ (図 2) に蛹のケースの縁を保護前方の腹部のセグメントを明らかに蛹のケースを開けます。
注: 完全蛹を明らかにする必要はありません。 - 動物を把握するための鋭い鉗子で各蛹の腹部を刺し、その蛹の場合 (図 2) から取り外します。
- テープからの黒い解剖皿の上に蛹を置くし、冷たいリン酸バッファー-ソリューション (PBS、pH 7.4) の約 400 μ L でカバーします。
- 鉗子と顕微解剖はさみ腹部つかんで各蛹、蛹を半分に切断、胸部を切り取り、きれいな断面を作る (図 2 D)。
- PBS から各枝肉の後部の残骸を削除し、解剖皿の上の 1 つの側面に置く (3.2.1 の手順を参照してください、破棄しないでください)。
- 微細鉗子の 2 つのペアを使用して、胸郭と目脳複合体 (図 2 e) を明らかにするそれぞれの蛹の頭を開きます。これを行うには、胸郭の上皮のカット面をつかみ、徐々 に胸部を開き、目脳の複雑な周囲の脂肪組織を公開するカプセルを頭に涙します。
- 組織を把握せずヘッド カプセルの残党から目脳コンプレックスを案内したり、破れたオープン ヘッド カプセルから目脳コンプレックスをスクープ鉗子を使用します。
注: 目脳コンプレックスはダンベル形、オフホワイト、および周囲のクリーム色の脂肪 (図 2 b, E) よりもっと半透明。 - 鉗子、眼組織に触れることがなく目脳錯体に関連付けられているほとんどの脂肪を慎重に取り外します。
3. 蛍光抗体法により組織の処理
- 説明されている (手順 2.1 2.9) として、少なくとも 6-10 蛹を解剖します。
注: 各郭清の 3 ~ 4 独立した複製は、仮説をテストするための十分なデータを生成する傾向があります。 -
洗濯と固定
- P20 の先端または半径 〜 1 mm 先端開口を高め、PBS と上下脂肪のミックスをピペッティングによる潤滑にきれいなかみそりの刃と P100 ピペット チップを切り取ります。この脂肪は、2.6 の手順で削除された枝肉の残党から入手できます。
- ~ 400 μ L の PBS の 9 よくガラス皿に、氷の上に目脳錯体を転送します。潤滑のヒントと P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットを使用して転送します。
注: 目脳錯体がピペッティング中無潤滑のヒントに従うとする破損または紛失しました。 - 目脳複合体を軽く旋回、上下に PBS をピペッティングによる眼組織に関連付けられている残りの脂肪を除去します。これとすべての後続の洗浄のステップではない直接ピペット上下目脳錯体これは壊れやすい眼組織に損傷を与えるよう。
- 最小限のボリュームで目脳錯体 (< 20 μ L) に定着剤の少なくとも 250 μ L の PBS の。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 35 分間インキュベートします。
注: 3.1.1 準備した同じ潤滑のヒントは、この転送する使用できます。 - 同じピペット チップも含む ~ 400 μ L の PBS に目脳錯体を転送します。ソリューションを上下にピペッティングで混ぜるし、を洗う、氷の上の 5-10 分間インキュベートします。少なくとも 2 回洗浄のステップを繰り返します。
メモ: 最終的な PBS 洗浄、4 ° C、3.3.1 の手順に進む前に、氷の上で数時間目脳錯体を維持できます。
-
抗体の汚損
- 抗体ソリューションへの暴露の前に組織をブロックするには、PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。転送のため潤滑のヒントと P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットを使用します。氷の上の 10 ~ 60 分間インキュベートします。
- PBT で適切な抗体を希釈して一次抗体溶液を準備します。目脳複合体抗体溶解液の 10 μ L の因数で孵化する、ので、準備量は 10 の複製になります。
- 72 よくマイクロウェル トレイのきれいなウェルに抗体溶解液の 10 μ L 分注 (ディスカッションを参照してください)。
- 半径 ~0.5 mm 先端開口上下ピペッティング PBT で注油してきれいなかみそりの刃で P10 ピペット チップの先端をカットします。
- ボリュームで、5 以上の目脳錯体 < P10 空気変位マイクロ ピペットと潤滑のヒントを使用して抗体溶液の各 10 μ L に 3 μ L の PBS。
- 上下にソリューションをピペッティングによる抗体溶液を均質化します。これは組織を損傷するために、上下目脳錯体のピペットないです。
- 抗体溶液の蒸発を抑えるマイクロウェル トレイに蒸留水に浸した組織の小片を置くし、(例えばで提供されるふた) トレイを封印します。4 ° C で一晩インキュベートします。
- マイクロウェル トレイから洗浄する 9 流したガラス皿に PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。(準備手順 3.3.4) P10 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 5-10 分間インキュベートします。
- 少なくとも 2 回洗浄のステップを繰り返します。P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用して、洗浄溶液間目脳錯体を転送します。
- 適切なタグ付きの fluorophore 二次抗体 PBT で必要に応じて希釈することによって二次抗体溶液を準備します。二次抗体溶液を 100 μ l 添加は 6-10 蛹のバッチごとで十分です。因数 9 流したガラス解剖皿に二次抗体の解決。
- 二次抗体の解決に目脳錯体を転送します。P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを転送に使用します。
- 二次抗体溶液室温で 1-2 時間または 4 ° C で 3-5 h 目脳錯体を孵化させなさい光による蛍光物質の漂白を防ぐため、箔と準備をカバーします。
注: 最適な二次抗体溶液中の潜伏期間は使用される第一次および二次抗体によると異なる場合があります。 - 9 よくガラスの皿を洗うの PBT の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送します。上下にソリューションをピペッティングで混ぜます。氷の上の 5-10 分間インキュベートします。この洗浄工程は、少なくとも 2 回繰り返す必要があります。
-
二次固定
- 二次固定用定着剤の少なくとも 200 μ L に移動目脳錯体と 20 分室温でまたは 4 ° C で 35 分間インキュベート
注: 二次固定取付 (ステップ 3.5) の補助眼組織を硬直します。 - 9 よくガラス皿、氷の上で 5 分間洗浄するのに PBT の ~ 400 μ L に移動目脳錯体に P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。
- 少なくとも一度洗浄手順を繰り返します。
- 9 よくガラス皿、氷の上で 1-2 分間洗浄する PBS の ~ 400 μ L に目脳錯体を転送するためのヒントの pbt 樹脂潤滑や P100 空気変位マイクロ ピペット使用、P20 維持ピペッティング PBS による運動の組織は組織ではないです。、上下目脳体沈降と PBS リンスの中にガラスの皿に付着を防ぐために。
- 二次固定用定着剤の少なくとも 200 μ L に移動目脳錯体と 20 分室温でまたは 4 ° C で 35 分間インキュベート
-
取付
- メディアのマウントの 〜 200 μ L に目脳錯体を転送します。目脳錯体に P20 または P100 空気変位マイクロ ピペットと PBT 潤滑のヒントを使用します。1-2 時間のメディアのマウントで平衡に組織を許可します。
- きれいな顕微鏡スライド上に新鮮なマウント メディアの 5-8 μ L のドロップを配置します。
- ~0.5 mm、半径に先端開口を増加し、これと P10 空気変位マイクロ ピペットを使用して、スライドにメディアをマウントのドロップにメディアのマウントの 5-8 μ L で目脳錯体きれいなかみそりの刃で P10 の先端をカットします。
- 視葉から目を分離するのに 2 つのタングステンの針を使用します。丈夫なタングステン針でスライドに目脳複合体をピンし、細かいタングステン針 (図 2 f) でその関連付けられた視葉からそれぞれの目をスライスします。
- スライドに隣接するそれぞれの目の基底面の顕微鏡スライドの表面にそれぞれの目を操縦するためには、細かいタングステン針を使用します。優しくティッシュの上クリーン カバー スリップを下、マニキュアで固定します。
注: は、互いに近接または行にので、スライドに目を配置することその後顕微鏡容易になります。 - 蛍光灯や共焦点顕微鏡を用いた網膜をイメージします。
注: スライドする必要があります 4 ° C で保存されないイメージをすぐに作成します。
4. ウェスタンブロッティング用眼組織の準備:
- 10-16 蛹 (手順 2.1 2.9) 以下の変更を分析: a) 収集と 2 つのバッチは、10-15 分間隔で蛹を解剖し、b) PBS (PBS + pi) ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を添加したで解剖。
- 移動、P20 を使用して目脳錯体化や空気の変位マイクロ ピペット P100 ~ 400 μ L の PBS + pi 9 よくガラス皿、氷の上で簡単にリンスするに (3.2.1 の手順と準備) の先端を潤滑
注: この潤滑のヒントは、4.3 や 4.4 以降の手順使用できます。 - リンスの手順を 2 回繰り返します。
- 氷冷 PBS + きれいな黒解剖皿の上にデカント pi の ~ 400 μ L にすべて目脳錯体を転送します。
- 丈夫なタングステン針を使用して (目脳複合体を安定させる) する視葉からそれぞれの目を削除して罰金のかみそりの刃や顕微解剖はさみきれいにカットするそれぞれの目視葉から。
注: 目がこの段階で '付箋' と解離性の皿に軽く付着可能性があります。(説明参照) 視葉から目の除去を容易に助けることができる、これは便利です。 - '掃引' すべての目 '山' に PBS + 鉗子の罰金ペアの 1 つのブレードを使用して解剖皿の上の pi。
- P10 の先端半径 ~0.5 mm 先端開口を広げるヒント インテリア ピペッティング ウエスタン組織換散バッファー (WTLB) によってを上下に注油してきれいなかみそりの刃をカットします。
- 500 μ L の微量遠心チューブに 5 μ L の PBS + pi の目脳錯体を転送します。転送を完了するのにこの潤滑ヒントと P10 空気変位マイクロ ピペットを使用します。
- 遠心チューブを氷を場所します。サンプルに WTLB と 2 x 集中蛋白質のサンプルバッファーの 10 μ L (または 5 x 高濃度タンパク質サンプルのバッファーの 2.5 μ L) の 1 ボリューム (5 μ L) を追加します。タップしてミックスします。
- 渦、遠心は簡単にチューブし、デスクトップ小型遠心分離機を使用してサンプルをスピンします。
- 分析までには、-20 ° C でサンプルを格納します。標準的なプロトコルを使用して分析します。
5. に備えて眼組織の RNA の抽出:
- 手袋、クリーン ベンチ、顕微鏡、解剖ツール、および 70% エタノール、RNase 除去試薬と皿をまず解剖黒身に着けています。乾燥することができます。
- 説明されている (手順 2.1 2.9) 以下の変更として 30 40 蛹を解剖:) を収集し、バッチ、15 〜 20 分離れて; 6 に 8 蛹を解剖b) 無料のヌクレアーゼ PBS、c で解剖) 目の各バッチを個別に分離しますが、同じ遠心チューブ (ステップ 5.5) にすべての網膜組織を蓄積します。
注: 同時に解剖 2 人を持っていることは、良い眼組織の効率的な分離を加速させます。 - 各バッチの目脳錯体 (手順 2.1 2.9) と P20 または P100 空気変位マイクロ ピペット、潤滑のヒント (3.1.2 の手順で説明されているように準備) 使用して ~ 400 μ L の氷の上を簡単に洗浄する 9 よくガラス皿のヌクレアーゼ フリーの PBS に転送を分離します。
注: この潤滑のヒントは、5.4、5.5、および 5.8 以降の手順使用できます。 - リンスの手順を 2 回繰り返します。
- ヌクレアーゼ フリーの氷冷 PBS の新鮮な 400 μ L ドロップに解剖料理きれいな黒目脳錯体を転送します。
- (複雑な目脳を安定した) に丈夫なタングステン針を用いて視葉からそれぞれの目を削除して罰金のかみそりの刃や顕微解剖はさみきれいにカットするそれぞれの目視葉から。
注: 目がこの段階で '付箋' と解離性の皿に軽く付着可能性があります。(説明参照) 視葉から目の除去を容易に助けることができる、これは便利です。 - '掃引' すべての目 '山' に鉗子の罰金ペアの 1 つのブレードを使用して解剖皿の上ヌクレアーゼ フリーの PBS の。
- 生殖不能の RNase フリーの遠心管に目を転送し、液体窒素で急速凍結。
- 蛹の各バッチの解離 (ステップ 5.3 5.8) を繰り返します。1 つの管ですべての目を蓄積する液体窒素 (ステップ 5.5) で維持されている同じ遠心チューブに目の各バッチを転送します。
- RNA の抽出まで-80 ° c のサンプルを格納します。
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結果
蛹の目は、そのドライブ形態の発達過程を調査するためのエクセレント モデルとして機能する簡単にアクセスできる組織です。ここで、私たちは網膜を解剖したが、頂アドヘレンスジャンクション (図 3 a, C) またはアポトーシス (図 3)25時にアクティブが Dcp 1 カスパーゼ (図 3 D) を検出する蛍光を使用します。明らかに募集と (18 h APF) から初代培養細胞の形態形成などを含む主要な形成プロセスの中に細胞を観察することがこれらのアプローチ、格子のインターカレーション細胞それぞれの ommatidium (18-24 h APF) 周りの確立、第三紀ニッチ (21-24 h APF) は、セル サイズと形状 (18 h から 40 h APF)、アポトーシス (18 〜 33 h APF) から変更します。これらの形成のイベントのタイミングは温度に依存しが異なります...
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ディスカッション
ここで説明したショウジョウバエ蛹目郭清法 10 〜 15 分以内 6 に 10 目脳錯体の分離できます。しかし、忍耐と実践は、解剖テクニックをマスターし、品質と解離の速度を向上させるために不可欠です。今回は短い郭清によりそれぞれの目が約同じ発達段階、データ セット内の網膜の式表現型あるいは遺伝子の可変性を減らすこと。我々 のプロトコルを念入り涙やシャーリング、目への損傷が応力経路の活性化を誘導したりもできるためのリスクを最小限に抑えながら繊細な網膜組織を分離するため代替プロトコルは、マスターの少ない練習を必要があります、しながら細胞死。初心者最初のマスター 40 h APF に若い目を解剖する前に培養した蛹の郭清にお勧めします。あることを確認常に十分な蛹コレクション (手順 1.3) で使用できるすべての実験 (ステップ 1.1) の交差する複製の設定をお勧めします。網膜は、研究者に関心の明確な形態形成イベントによって、蛹の発育中に縦長の様々 で解剖することができます。これらは募集とアポトーシス (18 〜 33 h APF) から、セル サイズと形状 (18 h から 40 h APF) に変更 (21-24 h A...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
原稿には、ザック ドラムと有用なコメントのための我々 のレビューをありがとうございます。この作品は、R15GM114729 によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Adobe | 画像処理ソフト | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| ベータ メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| β-グリセロール リン酸 | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| 黒 解剖皿 | SYLG170またはSYLG184 (細かく挽いた木炭粉末で黒く着色) で縁まで充填されたガラス ペトリ皿。室温で24〜48時間放置して重合します。 | ||
| ブレードホルダー | ファインサイエンスツール | 10053 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠 | ロシュ | 4693132001 | |
| 共焦点顕微鏡 (ツァイス LSM 501) | カールツァイス | または類似の顕微鏡 | |
| ジエチルピロカーボネート (DEPC) | シグマアルドリッチ | 40718 | |
| 両面テープ | 3M | 665 | |
| ショウジョウバエ食品培地、栄養豊富な | 7.5%スクロース、15%グルコース、2.5%寒天、20%ビール酵母、5%ペプトン、0.125%MgSO4.7H2O、0.125%CaCl2.2H20 | ||
| ショウジョウバエ食品培地、 標準的な | ブルーミントンショウジョウバエストックセンターのコーンミールレシピ。(https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| エチレンジアミン四酢酸 | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| PBS | 中の 4% フォルマデヒド | ||
| 蛍光顕微鏡(TCS SP5 DM顕微鏡) | ライカマイクロシステム | ズまたは類似顕微鏡 | |
| Forceps | ファインサイエンスツール | 91150-20 | 鉗子は頻繁に研ぐ必要があります。 |
| ホルムアルデヒド | Thermo Scientific | 28908 | |
| ガラス製9ウェル皿 | コーニング | 7220-85 | 別名9ウェルディッシュ |
| ガラスカバースリップ (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| ガラス顕微鏡スライド (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| ガラスシャーレ | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio ソフトウェアバージョン 5.2.5 | LI-COR Biosciences | ウェスタンブロットの定量のための画像処理ソフトウェア。 | |
| Laemmli サンプルバッファー | Bio-Rad | 161-0737 | 2X 濃縮タンパク質サンプルバッファー、メーカーの指示に従ってベータメルカプトエタノールを添加します。 |
| レーンマーカーによるサンプルバッファの削減 | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X 濃縮タンパク質サンプルバッファー。 |
| マイクロセントリグリューグルチューブ | Axygen | MCT-175-C | |
| マイクロダイセクションハサミ | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| マイクロウェルトレイ (72 x 10 & micro;L wells) | Nunc | 438733 | |
| PBS中の0.5%N-プロピルガレートおよび80%グリセロール封 | 入剤 | ||
| N-プロピルガレート | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| ヌクレアーゼフリーPBS(0.1%DEPC中のPBS、pH 7.4) | PBSに適量のDEPCを加え、よく混合し、室温で一定攪拌しながら一晩インキュベートします。少なくとも20分間オートクレーブします。4°Cで保管します。C | ||
| PBS(リン酸緩衝生理食塩水pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | 製造元の指示に従って調製 |
| PBS+pi (PBSとプロテアーゼおよびホシャターゼ阻害剤) | 10mM NaF、1mMβ-グリセロールリン酸および1mM Na3VO4 PBS、pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonXおよび0.5% ウシ血清アルブミン PBS、pH 7.4 | ||
| ピンホルダー | ファインサイエンスツール | 26016-12 | |
| 一次抗体:ヤギ抗GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | ウェスタンブロッティング用。1:3000で使用 |
| 一次抗体:ウサギ抗切断Dcp-1 | 細胞シグナル伝達 | 9578S | 免疫蛍光用。1:100で使用 |
| 一次抗体:ラット抗DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | 免疫蛍光用。1:20に使用 |
| 一次抗体:ラット抗DEcad | DOI:10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | タダシ・ウエムラからの贈り物。1:100で使用します。 |
| RNA抽出キット:Relia Prep RNAtissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase Decontamination Reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | スケープルブレードの小片を折ってブレードホルダーに固定します。 |
| 二次抗体:488-conjugated ロバ抗ラットIgG(H + L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | 免疫蛍光用。1:200で使用 |
| 二次抗体:cy3-標識ヤギ抗ウサギIgG(H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | 免疫蛍光用。1:100で使用 |
| 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ラットIgG(H + L) | 細胞シグナル技術 | 7077 | スタンブロッティング用。1:3000で使用 |
| 二次抗体:HRP標識ウサギ抗ヤギIgG(H + L) | ジャクソン免疫研究 | 305-035-003 | スタンブロッティング用。1:3000 |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| フッ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| バナジウム酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| 分光光度計 (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| 実体解剖顕微鏡(M60またはM80) | ライカマイクロシステム | ズまたは類似の顕微鏡 | |
| シルガード(黒) | ダウ・コーニング | SYLG170 | |
| シルガード(透明) | ダウ・コーニング | SYLG184 | カラー ブラック、細かく挽いたチャコールパウダー |
| ティッシュ:キムテック | キムテック | 34120 | |
| トリトンX | シグマ・アルドリッチ | T8787 | |
| Trizma 塩酸塩 pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| タングステン針、ファイン | ファインサイエンスツール | 10130-10 | ピンホルダーへの挿入 |
| タングステンニードル、頑丈な | ファインサイエンスツール | 10130-20 | ピンホルダーWTLB |
| (ウェスタン組織溶解バッファー) | への挿入150 mM NaCl、1.5% Triton X-100、1 mM EDTA、20% グリセロール、10 mM NaF、1 mM β-グリセロールリン酸、1 mM Na3VO4 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 中。10 mL溶液あたり1つのcOmpleteプロテアーゼカクテルテーブルを補充します。 | ||
| イーストペースト | (地元のスーパーマーケット) | 約大さじ2杯のフライシュマンのアクティブドライイースト(または類似のもの)を~20mLの蒸留H2Oに溶かしました |
参考文献
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