Method Article

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ex vivo照射後のマウス乳酸パッドの脱細胞化およびその後のヒドロゲル形成のための方法を提示する。

Abstract

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放射線は、トリプルネガティブ乳癌患者のための療法です。健康な乳房組織の細胞外マトリックス(ECM)に対する放射線の影響と原発性腫瘍部位における局所再発におけるその役割は不明である。ここでは、マウスママリー脂肪パッドに由来するECMヒドロゲルの脱細胞化、凍結乾燥、および製造の方法を提示する。脱細胞化プロセスの有効性に関する結果が発表され、評価された。ヒドロゲルに封入されたGFP-およびルシフェラーゼ標識乳癌細胞は、照射ヒドロゲルにおける増殖の増加を示した。最後に、封入腫瘍細胞の細胞骨格組織を可視化するためにファロイジンコンジュゲート染色を用いた。我々の目標は、腫瘍細胞の挙動を研究するために、生体内乳房組織環境と放射線に対する応答を模倣するインビトロ研究のためのヒドロゲルを製造する方法を提示することである。

Introduction

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癌は、アポトーシスを回避し、また遠方部位1に転移することができる細胞の過剰増殖によって特徴付げられる。乳癌は米国の女性の間で最も一般的な形態の1つであり、2018年には推定266,000人の新しい症例と40,000人の死亡が2018年2月に推定される。サブタイプを治療するのが特に積極的で困難なのは、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびヒト表皮成長因子(HER2)を欠いているトリプルネガティブ乳癌(TNBC)である。放射線療法は、腫瘍切除術後の残留腫瘍細胞を排除するために乳癌で一般的に使用されるが、TNBC患者の13%以上はまだ原発性腫瘍部位3で再発を経験する。

放射線療法は、腫瘍切除と放射線の組み合わせが乳房切除術と同じ長期生存をもたらすため、転移および再発を緩和するのに有効であることが知られている4。しかし、最近、放射線治療は、免疫不全の設定5、6における原発性腫瘍部位への局所再発と関連することが示されている。また、線維化7を誘導することにより、放射線が正常組織の細胞外マトリックス(ECM)を変化させるの<....

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Protocol

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動物研究は、ヴァンダービルト大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された機関ガイドラインとプロトコルに従って行われました。

1. MMFの調製と生体内照射

  1. CO2窒息を用いてアチミクスNu/Nuマウス(8~10週間)を犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。
  2. 70%のエタノールを使用して皮膚をきれいにします。
  3. 完全なRPMI培地を含む15mLの円錐管(RPMIは1%ペニシリン連鎖筋ミンと10%の胎児ウシ血清を補充した)を含む15 mL円錐管で殺菌されたはさみと鉗子を使用して犠牲マウスから乳腺脂肪パッド(MMF)を収集する(材料の表を参照)).
  4. セシウム源を用いて20Gyにサンプルを照射する。
  5. 照射された複合機を持ち込み、RPMIメディアをバイオセーフティキャビネットに取り込みます。培養媒体は、最終ヒドロゲルで増殖する細胞株に依存する。6 cm または 10 cm の皿を、MfP を水没させるのに十分なメディアを充填します。6 cm の料理の場合は、8 mL のメディアを使用し、10 cm の料理には 20 mL のメディアを使用します。
  6. 37 °C/5% CO2インキュベーターで2日間インキュベートします。インキュベーター内の時間の長さは、調整されてもよい。

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Results

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MMFは、図1Aに示す手順を用いて照射後に脱細胞化した。MMFの細胞内化(図1B)および細胞外化後(図1C)を示す。脱細胞化はヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を用いて確認され、1-(4-(Xylylazo)xylyl)-2-ナフトール染色を用いて脂質含有量を評価した(図2)。ECMヒドロゲルの特性も37°C(図3)で評価した。貯蔵係数は、すべての条件の損失係数よりも高く、安定したヒドロゲル形成を実証した。

GFP-およびルシフェラーゼ標識4T1乳癌細胞をヒドロゲルに封入した。細胞増殖は、蛍光顕微鏡、生物発光測定、およびカプセル化後48時間の生存率染色によって調べた(図4)。照射されたヒドロゲルは、腫瘍細胞増殖の増加傾向を示した。ファロ.......

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Discussion

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ヒドロゲル形成のこの方法は、開始組織の量に大きく依存する。マウスMGPは小さく、脱細胞化プロセスは材料の大幅な減少をもたらす(表1)。プロセスは、最終的な収率を高めるために、より多くの複合機で繰り返すことができます。フライス加工は、材料の損失につながる可能性のあるもう一つの重要なステップです。他の人は低温ミルで成功を示していますが、このプロトコルは、手持ちのモルタルを介したフライス加工と害虫の付属品8、17を備えた電気ドリルに基づいています。これは、資本コストを削減し、材料損失を最小限に抑える利点がありますが、最終製品にばらつきを導入する可能性があります。

脱細胞性および脱脂質の確認に対する課題は、クライオスタット埋め込み培地中の脂肪組織を凍結することである。図2Aは、パラフィンに埋め込まれ、区分された未照化された複合機のH&E染色を示す。異なる核は、他の細胞との接合部の近.......

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Disclosures

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著者は何も開示していない。

Acknowledgements

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著者らは、GFPおよびルシフェラーゼ-4T1細胞を提供したローラ・L・ブロンサート博士に感謝し、エドワード・L・ラゴリー博士は1-([4-(ザイラゾ)xylyl]アゾ)-2-ナフトール染色、IVISおよび凍結性細胞使用のためのクレイグ・L・デュバル博士にアドバイスを提供した。使用。この研究は、NIH助成金#R00CA201304によって財政的に支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% 中性緩衝ホルマリン、スピゴット付きキューブVWR16004-128-2
-メチルブタンアルファ エーザー19387-AR
2000ex レオメーターTA Instruments10D4335レオメーター
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA1933-25G-
カルセイン アセトキシメチル (カルセイン AM)Molecular Probes, Inc.C1430-D
-ルシフェリンホタル、カリウム塩Biosynth化学&生物学L-8820(S)-4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシ-2-ベンゾチアゾリル)-4-チアゾールカルボン酸カリウム
組織学用DPXマウンタン剤Sigma-Aldrich06522-500ML-
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水Gibco14040133-Eosin-Y
with Phloxineリチャード・アラン・サイエンティフィック71304エオシン
・エチジウム・ホモダイマーモレキュラープローブ株式会社E1169ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571クライオスタット埋め込み培地
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01水性封入剤
FreeZone 4.5Labconco7751020凍結乾燥機
Hoechst 33342 溶液 (20 mM)Thermo Scientific62249青色蛍光色素
塩酸Sigma-Aldrich258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334生物発光イメージングシステム
Kimtech ScienceKimwipes Kimberly Clarkデリケート タスク ワイプ
n-プロパノール (過酸化物フリー/シーケンシング)、Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1-([4-(キシリルアゾ)キシリル]アゾ)-2-ナフトール
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4Quality Biological, Inc.119-069-151リン酸緩衝生理食塩水
豚
胃粘膜由来Sigma-AldrichP6887-5Gペプシン
過酢酸Sigma-Aldrich77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 試薬 (ab176757)abcamab176757ファロイジンコンジュゲート
プロピレングリコールSigma-AldrichW294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series ブルーイング試薬Richard-Allan Scientific7301Lブルーイングエージェント
Richard-Allan Scientific Signature Series ヘマトキシリン 7211Richard-Allan Scientific7211-RPMI
Medium 1640Gibco11875-093-Nadium
deoxycholate, 98%フロンティアサイエンティフィックJK559522デオキシコール酸
ショ糖シグマ-アルドリッチS5016-
トリトンx-100グマアルドリッチX100-100MLt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドGibco25200-056-Whatman
定性的濾紙、グレード4Whatman1004-110グレード4定性濾紙
キシレン(認定ACS)、フィッシャーケミカルフィッシャーサイエンティフィックX5-4-
塩 シ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.

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