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マウスの二次運動皮質における二国間局場電位記録による半球横化の評価

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Research Article

マウスの二次運動皮質における二国間局場電位記録による半球横化の評価

DOI: 10.3791/59310

July 31, 2019

, , ,

1School of Life Sciences,Guangzhou University, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation,South China Normal University, 3School of Life Sciences,South China Normal University

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Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

マウスの二次運動皮質(M2)における局所電位電位(LFP)の生体内電気生理学的記録を提示し、半球横化を評価するために適用することができる。今回の研究では、WTコントロールと比較して、APP/PS1マウスにおける左右のM2間の同期レベルの変化が明らかになった。

Abstract

この記事では、マウスの皮質領域における生体内二国間の記録と局所視野電位(LFP)の分析の両方に関する完全で詳細な手順を示し、横質欠損の可能性を評価するのに有用であり、げっ歯類における脳の接続性とニューラルネットワーク活動の結合を評価する。一般的な神経変性疾患であるアルツハイマー病(AD)の根底にある病理学的メカニズムは、ほとんど知られていない。脳の横質の変化は高齢者で実証されているが、異常な横振りがADの初期徴候の一つであるかどうかは決定されていない。これを調べるために、3~5ヶ月前のADモデルマウスAPP/PS1に、リメイトワイルドタイプ(WT)コントロールを含む両側LFPを記録した。ガンマバンドにおける左右二次運動皮質(M2)のLFPは、WTコントロールよりもAPP/PS1マウスにおいてより同期性が高く、このADマウスモデルにおける両側M2の半球非対称性の低下を示唆した。特に、記録およびデータ解析プロセスは柔軟で簡単に実行でき、ニューロン回路に焦点を当てた実験を行う際に他の脳経路にも適用できます。

Introduction

アルツハイマー病(AD)は、認知症1、2の最も一般的な形態です。細胞外βアミロイドタンパク質(β-アミロイドタンパク質、Aβ)沈着および細胞内神経線維性もつれ(NOF)は、AD3、4、5の主な病理学的特徴であるが、ADの根底にあるメカニズムである病因はほとんど不明のままである。認知と記憶の重要な構造である大脳皮質は、AD6で障害を受け、歩行が遅いなどの運動障害、環境のナビゲートが困難、歩行障害が7歳に伴って起こる。Aβ沈着および神経線維性もつれは、AD患者8および認知的影響を受けた高齢者9の前運動皮質(PMC)および補助運動領域(SMA)においても観察され、障害を持つ運動の関与を示す。AD病因のシステム。

脳は縦割れで分割された2つの異なる大脳半球によって形成される。健康な脳は、構造的および機能的な非対称性10の両方を示し、「横化」と呼ばれ、脳が複数のタスクや活動を効率的に処理できるようにします。老化は認知および移動の悪化をもたらす, 脳の横数の減少と一緒に11,12.左半球の運動能力は健康な脳13で容易に明らかであるが、AD脳異常横性は左皮質萎縮に関連する左半球支配の失敗の結果として起こる14、 15、16.したがって、AD病因における脳横形成の起因性変化の可能性を理解することは、AD病因に関する新たな洞察を提供し、治療のための潜在的なバイオマーカーの同定につながる可能性がある。

電気生理学的測定は、動物の神経活動の変化を評価する敏感で効果的な方法です。高齢者における半球非対称性の減少(HAROLD)17は、同期した半球間移動時間を伴う電気生理学的研究によって文書化されており、これは、半球非対称性の弱体化または不在を示す。高齢者18の発話刺激.APP/PS1を利用して、最も一般的に使用されるADマウスモデルの19、20、21、22、左右両方のM2におけるLFPの生体内両側細胞外記録と組み合わせて、ADで可能な横割り赤字を評価した。さらに、単純なパラメータ設定により、データ解析ソフトウェア(材料表を参照)の組み込み機能により、数学的によりも電気信号の同期をより速く、より簡単に分析できます。生体内電気生理学で初心者に優しい複雑なプログラミング言語。

Protocol

中国科学技術省の実験動物ガイドラインと実験によると、すべての動物は標準的な条件(12時間の光/暗い、一定の温度環境、食物と水への自由なアクセス)の下でペアで収容されました。広州大学の地元の倫理委員会によって。これは非生存の手順です。

注:代表的な結果に示すデータについては、APP/PS1(B6C3-Tg(ApPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J)の二重トランスジェニックマウスおよびリターメイト野生型(WT)コントロールを生後3~5ヶ月で、記録に使用した(n=10、グループあたり)。

1. 動物麻酔と手術

  1. あなたの地元の動物ケア委員会から承認された麻酔レジメンによってマウスを計量し、麻酔します。
  2. 手術前に深い麻酔を確認するために鉗子で尾またはつま先のピンチを行う。
  3. マウスを立体装置に置き、頭部を固定します。
  4. しっとり保つために両目に目のミントを適用します。術前および術後の鎮鎮薬に関する地元の動物ケアガイドラインに従ってください。
  5. 外科バリカンを使用して髪を剃ります。はさみで露出した外科領域の真ん中に小さな切開(12〜15ミリメートル)を作ります。鉗子を使用して、頭皮を中線からそっと引き離します。
  6. 皮膚を穏やかに分離し、残留組織を除去します。過酸化水素コーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨をきれいにします。
  7. 頭蓋骨の左右に半径1.0~1.5mmの小さな穴を2つドリルで穴を開け、記録マイクロ電極を立体顕微鏡下でM2領域に挿入できるようにします(図1A)。
    注:両側M2の立体位置:ブレグマに1.94 mm、中線に1.0mm、硬膜に0.8〜1.1 mmの腹部。
  8. タングステン針で慎重にデュラ母を取り除きます。
  9. 1-2 MΩの抵抗を持つ記録マイクロ電極としてガラスホウケイ酸塩マイクロピペット(外径:1.0mm)を引っ張ります。
  10. 機械的マイクロマニピュレータ(60°、図1B)を使用して、0.5 M NaClで満たされた2つの別々の記録マイクロ電極を穴に挿入します。

2. マウスの両側M2におけるLFP記録

  1. 左右のガラス電極をゆっくりと両側M2の適切な座標に下げる(図1C)。
  2. 品質管理のために、差動アンプを使用して各電極の抵抗をテストしてから、LFPをキャプチャします。
  3. 1,000倍の増幅で0.1Hzのハイパスと1,000Hzローパスで録音プロセスを設定します。
  4. 安定した状態で少なくとも60sの自発的な活動のデジタル化された生のLFPデータを収集し、マウスは麻酔下で毎秒2呼吸の呼吸速度で均等に呼吸する。
  5. 記録後、ゆっくりと脳から電極を上げ、速い子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
  6. データを保存し、オフラインで分析します。

3. 相互相関分析

  1. [解析 - 解析ソフトウェアの波形相関]をクリックし、データをインポートします。
  2. パラメータ設定
    1. 一方の波形チャネル信号を最初のチャネルとして定義し、もう一方を参照として定義します。幅を 2 に設定し、オフセットを 1 (図 2 A) に設定します。
    2. 開始時刻と終了時刻を選択して、両方の LfP の継続時間を 100 s に設定します。[プロセス]ボタンを押して相互相関解析を実行します (図 2B)。
      注:このような持続時間を持つ同時二国間信号は、ニューロンの自発的な活動を示すのに十分な長さであり、それによって同期の基本的な特性を明らかにする。
  3. [ファイル -[名前を付けてエクスポート]をクリックし、結果のポップアップチャートに対応する相互相関結果を .txt 形式で保存します。
  4. .txt ファイル (図 2C)を開き、タイム ラグの相関値を削除する 0 ± 0.01 s (2 つの連続ガンマ波には少なくとも 0.01 秒間隔があるため)、負のタイム ラグ部分または平均で残りの相関データを平均化します。正のタイム ラグ部分のクロス相関データの残りの部分。

4. コヘレンス分析

  1. 分析ソフトウェアでデータをインポートして実行します。
  2. 2 つの LFP 信号を 1 番目と 2 番目の波形チャネルに個別に割り当てます。次に、ブロック サイズの値を設定します (図 3A)。
    注: ブロック・サイズは、FFT で使用されるデータ・ポイントの数を意味します。ブロック サイズが大きいほど、周波数分解能が高くなります。ここでは、4096 として設定することをお勧めします。
  3. 点線を手動で移動して、両方のチャンネルの信号の時間精度が同じ期間として設定されていることを確認します(図 3B)。[エリアの追加] ボタンを押して領域を読み込み、一貫性解析を実行します。
  4. [ファイル - [名前を付けて保存]をクリックして、結果のポップアップ チャートに対応するコハネの結果を .txt 形式で保存します (図3B)。

Representative Results

早期AD病理が半球横化の能力を損なうかどうかを調えるために、APP/PS1マウスおよびWTコントロールの左右M2における両側細胞外LFP記録(3~5ヶ月)を実施し、これらの左の相互相関を解析し、右の LFP。WTマウスでは、正のタイムラグにおける左右のLFP間の平均相関が負のタイムラグと有意に異なり、WTコントロールのM2領域における半球非対称性の存在を示す結果が示された(図4) C;WT 陽性、 0.08161 ± 0.01246;WT 負、0.0206 ± 0.01218;p = 4.74531E-4 < 0.001 2つのサンプルt -testによる)対照的に、APP/PS1マウスの左右のLFPは、時間領域でより高い同期を示し、左右M2間の非対称性の低下を示唆した(図4C;APP/PS1陽性、 0.13336 ± 0.0105 APP/PS1 陰性、 0.12635 ± 0.01066;p = 0.64157 > 0.05 2 サンプルt-test)。

次に、LFP(図5A)からガンマ振動をフィルタリングし、プロトコルに記載されているように一貫性解析を行い、ガンマ周波数範囲における電気信号の類似性を測定した。その結果、APP/PS1における左右のM2間のガンマの一貫性がWTマウスよりも有意に高かったことが示された(図5B;C;WT, 0.13267 ± 0.00598;アプリ/PS1、0.17078 ± 0.0072;p = 0.00550 < 0.01 by 2 つのサンプルt-test) は、APP/PS1 マウスの左右の M2 間の同期が高いことを示し、その結果、横向き化を減少させた。

Figure 1
図 1:同時LFP記録手順の図。(A) 左右M2のLFPの生体内記録用に頭蓋骨を露出し、デュラマターを取り外した立体マウス。(B)同時に掘削された穴の皮質表面と接触する2つのガラスマイクロ電極。(C) マイクロ電極とAg/AgCl線を適切な部位に配置した基準電極として記録する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 相互相関分析の図。(A) 波形相関ダイアログボックスの設定。これにより、どの波形チャネルが参照を選択し、2 つの信号の相関関係を分析するためのオプションが提供されます。(B) プロセスダイアログボックス。これにより、参照波形の時間長を設定し、別の波形の継続時間を設定するオプションが提供されます。解析は、両方の波形チャネルが存在するデータの領域に対してのみ行われます。(C) マイナスと正のタイムラグの値を持つ.txt ファイルの例は、統計に対して別々に行われます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: コサイレンス解析の図。(A) コサイレンスダイアログボックスのパラメータ設定。ブロック サイズによって、解析で使用されるデータ ポイントの数と周波数解像度が決まります。(B) 点線は、オペレータが分析のための信号の持続時間を設定するために手動で移動するために調整可能です。(C) ソフトウェアがチャートを作成したら、[ファイル -保存] をクリックして、コシエンスの結果を .txt ファイル名拡張子を持つファイルとして保存します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:交差相関は、APP/PS1マウスの左右M2間の半球横化の低下を示す。(A) 細胞外記録法を用いたWTおよびAPP/PS1マウスの両側M2に同時に記録されたLFPの代表的な生の痕跡(L:左M2;R:右M2)。(B) クロス相関曲線は、異なるタイムラグにおける両側LFP信号の相関を示す。(C) 左右のM2の間では、WTコントロールは負の時間差の範囲で有意に高い相互相関値を示した。対照的に、APP/PS1マウスの相互相関値は類似性を有し、非対称性の低下を示す(n=10、群当たり)。値は平均±標準誤差を表す。p < 0.001;2つのサンプルt-test。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: WTとAPP/PS1マウスの左右M2間のガンマ振動の一貫性。(A) 左右のM2のLFPからフィルタリングされたガンマ振動の代表的な痕跡。(B) 両側M2に同時に記録されたLFP間のコヘレンス分布。APP/PS1マウスは、ガンマ周波数範囲のWTコントロールとは大きく異なります。(C) 両側M2のガンマ振動間の一貫性
APP/PS1マウスはWTコントロールよりも有意に高い(n = 10、グループあたり)。値は平均±標準誤差を表す。**, p < 0.01;2つのサンプルt-test。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

著者は何も開示していない。

Disclosures

マウスの二次運動皮質(M2)における局所電位電位(LFP)の生体内電気生理学的記録を提示し、半球横化を評価するために適用することができる。今回の研究では、WTコントロールと比較して、APP/PS1マウスにおける左右のM2間の同期レベルの変化が明らかになった。

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(31771219、31871170)、広東省科学技術部(2013KJCX0054)、広東省自然科学財団(2014A030313418)の助成金によって支援されました。2014A030313440)。

Materials

MEH3SW10
AC/DC差動増幅器A-M SystemsModel 3000
アナログデジタルコンバータCambridge Electronic Design Ltd.Micro1401
ガラスホウケイ酸マイクロピペット南京春教育実験装置会社161230外径:1.0mm
マイクロ電極プーラー成重PC-10
NaCl広州化学試薬工場7647-14-5
ピンマイクロ電極ホルダーWorld Precision Instruments, INC.
スパイク2 ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン・リミテッド
実体顕微鏡Zeiss435064-9020-000
脳定位固定装置 RWDライフサイエンス68045
ウレタンSigma-Aldrich94300

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