方法論記事

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

DOI：

10.3791/59312

⸱

2019年6月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、殺虫剤などの植物全体が取り込むことができる外部化合物の代謝を調べることができる茶(カメリア・シネンシスL.)葉に由来する細胞懸濁培養を確立するためのプロトコルを提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

茶植物の体外組織を用いて殺虫剤代謝を研究するプラットフォームを開発した。無菌茶植物の葉は、植物ホルモン2,4-ジクロロフェノキシアセチン酸(2,4-D,1.0mgL-1)およびキネチン(KT,0.1 mg L-1)を用いてムラシゲおよびスコウグ(MS)基底培地に緩いカルスを形成するように誘導した。カルスは、3または4ラウンドのサブ培養の後に形成され、それぞれが28日間続く。次いで、同じ植物ホルモンを含むB5液媒体に疎化カルス(約3g)を接種し、25±1°Cで暗闇の中で揺れインキュベーター(120rpm)で培養した。3−4サブ培養後、茶葉由来の細胞懸濁液を1:1〜1:2のサブ培養比で確立した(懸濁母液:新鮮な培地)。このプラットフォームを用いて、6種の殺虫剤(5μg mL-1各チアメトキサム、イミダクロプリド、アセトモピプリド、イミダクロスイズ、ジメトエート、およびオメトエート)を茶葉由来細胞懸濁培養物に添加した。殺虫剤の代謝は、液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを用いて追跡した。茶細胞懸濁培養の有用性を検証するために、処理された細胞培養物および無傷植物に存在するチアメトキサンおよびジメトネートの代謝産物を質量分析法を用いて比較した。処理された茶細胞培養では、チアメトキサンの7つの代謝産物と2つのジメトエートの代謝産物が見つかり、治療された無傷の植物では、チアメトキサムの2つの代謝産物とジメトエートの1つだけが見つかった。細胞懸濁液の使用は、特に茶のような困難なマトリックスのために、無傷の茶植物の使用と比較して代謝分析を簡素化した。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

お茶は、世界で最も広く消費されているノンアルコール飲料の一つです 1,2.お茶は、木質多年生のカメリアシネンシスL.茶植物の葉や芽から生産され、広大なプランテーションで栽培され、多数の昆虫害虫3、4に影響を受けやすい。有機リンおよびネオニコチノイド殺虫剤は、白いハエ、葉ホッパー、およびいくつかのレピドプテラン種6、7などの害虫から茶植物を保護するために全身殺虫剤5としてしばしば使用される。塗布後、これらの殺虫剤は、植物に吸収または転移されます。植物内では、これらの全身殺虫剤は、植物酵素による加水分解、酸化または還元反応を介して形質転換されうる。これらの変換産物は、親化合物よりも極性が高く、毒性が低い場合があります。しかし、一部の有機リン酸塩では、一部の製品の生体活性が高くなります。例えば、アセファトは、より有毒なメタミドホス8、9、およびジメトエート10、11に代謝される。植物代謝研究は、このように植物12内の農薬の運命を決定するために重要です。

植物組織培養物は、農薬代謝を調るための有用なプラットフォームであることが証明されており、同定された代謝産物は、無傷の植物13、14、15に見られるものと同様である。組織培養物、特に細胞懸濁培養物の使用には、いくつかの利点がある。第一に、微生物を含まない実験を行うことができ、微生物による農薬変換や分解の干渉を回避することができます。第二に、組織培養はいつでも使用するための一貫した材料を提供する。第三に、代謝産物は無傷の植物よりも組織培養物から抽出する方が簡単であり、組織培養は多くの場合、介在化合物が少なく、化合物の複雑さが低い。最後に、組織培養は、単一の実験16における一連の農薬代謝を比較するためにより容易に使用することができる。

本研究では、無菌成長茶プラントレットの葉由来の細胞懸濁液が正常に確立された。次いで、茶細胞懸濁培養物を用いて、6種類の全身殺虫剤の消散挙挙を比較した。

この詳細なプロトコルは、研究者が紅茶中の異種生物学の代謝の運命を研究するのに有用な植物組織培養プラットフォームを確立できるように、いくつかのガイダンスを提供することを意図しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 茶カルス文化

注:無菌葉は、研究グループ17で最初に開発されたインビトロ成長植物株に由来した。セクション5までのすべての手順は、インキュベーターでの培養時間を除いて、無菌層流フードで行った。

  1. オートクレーブ(121°C、20分)の前に、2つの媒体(ムラシゲとスコウグ[MS]基底媒体およびガンボルグのB5液体培地)のpHを5.8に調整します。
  2. はさみを使って無菌葉の中静脈に沿って切断し、その後、ペトリ皿で約0.3センチメートルx 0.3センチメートルの小片に各半分を細分化します。
  3. 植物ホルモン2,4-D(1.0mg L-1)とKT(0.1mg L-1)を含むMS基底培地に滅菌下片(小葉片)を置きます。6つの移植はMS基底媒体の100 mLを含む300 mLフラスコに置くことができる。
  4. 上記の葉を暗闇の中で25°Cの一定温度で移植する培養する。28日後、誘発カルスの第一世代を選択し、新鮮なフラスコ(サブカルチャー)に移します。3-4サブカルチャーの後に緩く、冷凍カルスを取得します。

2. 茶細胞懸濁液培養

  1. 無菌条件下で無菌手術ブレードを使用して、固体媒体から小片(範囲0.5−2mm)に活発で、可燃性および緩い呼び出しを切る。
  2. カルスの小片の約3グラムの重量を量る。2,4-D (1.0 mg L-1)と KT (0.1 mg L-1)を補充した B5 液体媒体の 20 mL を含む 150 mL フラスコにカルスを入れます。
  3. 液体細胞懸濁液を一定温度(25±1°C)で暗闇で120rpmで振盪インキュベーターで培養する。
  4. 7~10日間培養した後、培養フラスコを取り出し、数分間放置します。
  5. サブ培養用の種子材料として全ての上清を新鮮な培地(懸濁液のサブ培養比と新鮮な培地のサブ培養比1:1~1:2の範囲)にします。沈殿した大きな呼び出しを取り除く。
  6. それぞれ28日の3−4サブ培養サイクル後に最終的に成長した細胞懸濁液培養物を得る。

3. 細胞生存率のトリフェニルテトラゾリウムアッセイ

  1. 生存率染色の前に対照細胞として100°Cで生細胞のサンプルを10分間殺す。
  2. 6000 x gで8分間のすべての細胞懸濁液培養を遠心分離する。リン酸緩衝生理食べ物(PBS)バッファー(pH 7.3)の2.5mLで細胞を中断する前に上清を取り出し、手で1分間振ります。
  3. 0.4%トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)溶液の2.5 mLを追加し、再び手で振ります。
  4. 常設インキュベーター(30°C)で1時間の混合物をインキュベートします。

4. 殺虫剤による茶細胞懸濁培養物の治療とサンプリング

  1. 4つのネオニコチノイド(チアメトキサム、アセトモピリド、イミダクロプリド、イミダクロフィズ)または2つの有機ホスファ(ジメトエートおよびオメトホウ酸塩)の400 μLのフィルター殺菌ストック溶液(500 μg mL-1)のアリコートを細胞懸濁液に加えます。それぞれ。
    注:異種生物的挙動を比較することを目的としている場合は、細胞懸濁液の同じ母バッチを使用して異なる化合物をテストします。
  2. 細胞懸濁液の試料を一定温度(25±1°C)で培養し、振盪インキュベーター速度(120rpm)を加養殖する。0、3、5 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75日のサンプル(ステップ4.3または4.4を参照)を取ります。
  3. ネオニコチノイドを含むサンプルを試験するには、均質な細胞培養の1 mLアリコートを取り出し、1.5mLのプラスチック遠心管に入れ、遠心分離機を4000 x gで2分間使用します。
    1. 高性能液体クロマトグラフィー-紫外線(HPLC-UV)および超高性能液体クロマトグラフィー四重極飛行時間(UPLC-QTOF)質量による分析前に、0.22μmの細孔サイズのフィルター膜を通して上清を通過する分光(材料の表)。
  4. 有機リン酸塩を含むサンプルを試験するには、細胞培養物の500 μLアリコートを取り出し、35 mL遠心管または1.5mLのプラスチック遠心管に入れます(ネオニコチノイドのような後者のサンプルを調製します)。
    1. 500 μLサンプルの35mL遠心管に塩化ナトリウム0.1g、アセトン/エチルアセテート(3:7、v/v)の5mLを加えます。
    2. 混合物を1分間渦にし、10分間休息させます。
    3. 上清の2.5mLを10mLのガラス管に入れ、40°Cの窒素蒸発器を用いてほぼ乾燥に蒸発させます。
    4. 残渣を1mLアセトンで溶解し、渦を1分間溶かし、ガスクロマトグラフィー炎フォトメトリック検出器(GC-FPD)で分析する前に0.22μmフィルター膜を通過させます。

5. 殺虫剤を含む無傷の茶植物のサンプル調製

注:無傷の茶植物試験は、栄養溶液の50 mLで成長した茶苗を用いた水耕栽培システムで行われた(30 NH4+,10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+,20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, 10 Al3 +, mg L-1)18.実験用温室は安寧農業大学で20°Cの明暗サイクル(光12時間、暗闇12時間)下にあった。

  1. 4Lプラスチックポットに5つの植物を15日間入れます。
  2. チアメトキサムまたはジメトエートの0 ppm(対照)または100 ppmをそれぞれプラスチックポットに加えます。
  3. 前述の方法に従って無傷の植物試料を調べ、予め19を除き、正確な質量スペクトルを質量分析で分析する。

6. 計測器分析

  1. ネオニコチノイドの代謝挙動のHPLC分析
    1. HPLC-UV(材料の表)を使用して、254 nmの波長でチアメトキサムおよびアセトアミノプリドの含有量および代謝産物を検出し、セクション4.3からのサンプルで270 nmのイミダクロプリドおよびイミダクロスリズを検出する。
      注:HPLC-UV条件は、前回の研究19と同じであった。
  2. 有機リン酸塩の代謝挙動のGC解析
    1. キラルカラム(材料の表)を使用してGC-FPDによってセクション4.4からのサンプル中のジメトエートおよびオメトエートの含有量を検出する。
    2. キャリアガスとして窒素を使用し、流量を1.0 mLmin-1に設定します。
    3. 初期温度を120°Cに設定し、5分間保持し、30°C分-1で150°Cに温度を上げ、10°C分-1で170°Cに増加し、7分間保持します。最後に30°C分-1で210°Cに増加し、5分間保持します。
    4. スプリットレスモードで射出温度を200°Cに設定します。検出器の温度を 250 °C に設定します。
    5. 射出量を 1 μL に設定します。
  3. 細胞培養における殺虫剤代謝産物のUPLC-QTOF分析
    1. C18カラム(材料の表)を持つUPLC-QTOFを使用して、細胞培養中の殺虫剤の代謝産物(セクション4.3からのサンプル)を検出します。
    2. 流量を 0.2 mL 分-1に設定します。射出量を 10 μL に設定します。
    3. ネオニコチノイド処理サンプルの場合、初期移動相を85%A(5mMアンモニウム・フォアメイト水)と15%B(アセトニトリル)に設定します。10分以上、モバイルフェーズBを38%に増やし、1分間で15%に戻り、9分間保持します。
    4. 有機リン酸処理サンプルの場合、初期移動相を55%A(0.1%ギ酸水)と45%B(アセトニトリル)に設定します。5分以上、移動相Bを70%に増やし、0.5分以上でBの45%に戻り、2.5分間保持する。
    5. QTOF動作パラメータを次のように設定します:ガス温度、325 °C;乾燥ガス(窒素)、10 L分-1;シースガス温度、350 °C;シースガスの流れ、11 L分-1;毛細管電圧、4000 V;ノズル電圧、1000 V;フラグメント電圧、ネオニコチノイド殺虫剤の場合は100V、有機リン殺虫剤の場合は110V。スキマー電圧、65 V;正イオンモードで動作します。
    6. 計測器をフルスキャンスペクトルに設定し、MS/MSモードをターゲットにします。
    7. 正確なマスツールを使用してデータを処理します。MS/MS アノテーションおよび文献12、15、20、21、22から標準製品を持たない代謝産物を推測します。
  4. 無傷の植物抽出物中の殺虫剤代謝産物のUPLC-オービットラップ分析
    1. UPLC-Orbitrap質量分析(材料の表)を用いて、無傷の植物抽出物中の殺虫剤の代謝物を検出する。
    2. 質量分析(材料の表)操作パラメータを次のように設定します:シースガス圧、35アーブ。ガス温度、 300 °C;ノズル電圧、3.5 KV;毛細管温度、350 °C.
    3. 細胞培養のUPLC-QTOF分析では、溶出プログラムを上記(ステップ6.3.3および6.3.4)に設定します。

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結果

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無菌環境でインビトロで栽培された茶植物から採取した葉や葉から採取した葉からのカルスの誘導を、MSメディアで28日間の栽培後の汚染、褐変、誘導を測定して比較した(図1A)。カルスの成長は、培養の20、37、62および90日で記録された(図1B)。インビトロ成長葉に由来するカルスは、栽培の全体の90日間の間に畑で成長した葉に由来するカルスよりも活発な成長を示した。無菌葉からのカルスは明るい黄色で、畑で育った葉からのカルスは茶色でした(図1B)。

2,4-D23の1.0mgL-1の濃度で、KTの濃度を最適化した。0.05 mg L-1 KT では、カルスの成長率は低く、テクスチャは少しコンパ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、茶植物組織における農薬代謝モデルの確立の詳細なプロセスについて、移植の選択、細胞生存率の決定、代謝の高い茶細胞懸濁培養物の確立を含む。活動。植物組織の任意の部分は、殺菌された環境25でカルスを開始するために使用することができる。この研究では、葉が地下の部分よりも汚染が少ない傾向があるだけでなく、作物の食用部分であり、農薬塗布の主な標的であるため、この研究ではカルスの開始のために選ばれました。

本研究では、現場から採取した葉から採取した葉と、インビトロで栽培された無菌植物から取り除いた葉からのカルスの誘導速度と成長状況を比較した。無菌葉は褐変と汚染のはるかに低い率を持っていたし、フィールド成長葉に比べて誘導の高い率を持っていました。これは、畑産植物の葉がエタノールや水銀を用いた表面殺菌を受けただけでなく、生育環境の変化を受けただけでなく、無菌環境で無菌の葉を栽培し、直接使用できるからと考えられる。付加的な殺菌。さらに、インビトロ成長した無菌植物に由来するカルスは、栽培の90日間の間に畑で成長した葉よりも活発な成長を示した。無菌...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国の国家主要研究開発プログラム(2016YFD0200900)、中国国家自然科学財団(No.31772076およびNo.31270728)、中国ポストドクター科学財団(2018M630700)、およびオープンファンドによって支援されました。茶植物生物学と利用の状態キーラボ(SKLTOF20180111)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセタミプリド(99.8%)博士エーレンストルファー46717CAS番号:135410-20-7
アセトニトリル(CAN、99.9%)TediaAS1122-801CAS番号:75-05-8
寒天Solarbio科学&技術A8190CAS番号:9002-18-0
Clothianidin(99.8%)博士Ehrenstorfer525CAS番号:210880-92-5
メトエート(98.5%)博士Ehrenstorfer109217CAS番号:60-51-5
ミダクロプリド博士(99.8%)博士Ehrenstorfer91029CAS番号:138261-41-3
Imidaclothiz(99.5%)トロント研究化学I275000CAS番号:105843-36-5
キネチン(KT、>98.0%)Solarbio Science &テクノロジーK8010CAS番号:525-79-1
オメトエート(98.5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS番号:1113-02-6
ポリビニルポリピロリドン(PVPP)Solarbio Science &テクノロジーP8070CAS番号:25249-54-1
ショ糖トクリスバイオサイエンス5511CAS番号:57-50-1
アメトキサム(99.8%)博士エーレンストルファー20625CAS番号:153719-23-4
塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC、98.0%)Solarbioサイエンス&技術T8170CAS No: 298-96-4
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸 (2,4-D, >98.0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS No: 94-75-7
キラルカラムAgilent CYCLOSIL-B112-6632クロマトグラフィーカラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
ガスクロマトグラフィー(GC)Shimadu2010-PlusPaired with Flame Photometric Detector (FPD)  
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)Agilent1260と紫外線検出器(UV)
HSS T3 C18 カラムWaters186003539クロマトグラフィーカラム(100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)Agilent1290-6545タンデム四重極飛行時間型質量分析計(QTOF)
超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)Orbitrap 質量分析計に接続されたThermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive Focus
ジイチの組み合わせ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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