Method Article

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

DOI:

10.3791/59314

⸱

April 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

In This Article

Summary

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ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.

Abstract

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粒子追跡ビデオ シーケンスとそれらの軌道の事後解析では、今日多くの生物学研究の一般的な操作です。細胞膜受容体の解析を使用してクラスター モデルが、フィジー (ImageJ) および Matlab ルーチンを使用してこの画像解析タスクの詳細なプロトコルを提案する: 1) 関心領域を定義し、これらの地域に適応したマスクをデザイン2) 蛍光顕微鏡動画内の粒子を追跡します。3) 選択したトラックの拡散と強度特性を解析する.拡散係数の定量的解析、モーション、およびクラスター サイズの型を用いて蛍光顕微鏡と画像処理が粒子のダイナミクスと変更の結果を客観的に判断するための貴重なツールを提供します環境条件。この記事ではこれらの機能の解析のための詳しいプロトコルを提案する.説明する方法ここでだけでなく単一分子追跡検出が細胞膜で横方向の拡散パラメーターの推定の自動化にも、軌道の種類を分類でき、したがって克服する完全な分析、細胞膜でその全体の軌道上のスポット サイズを定量化の難しさ。

Introduction

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脂質二重膜に埋め込まれる膜タンパク質は、熱拡散のための連続的な動きにあります。そのダイナミクスは、分子間相互作用は、オリゴマー、モノマーからサイズが異なります、シグナリング複合体の安定性に影響を与える複合体の形成を許可する細胞応答を調整することが不可欠。細胞生物学、シグナル伝達経路を理解し、予期しない細胞機能を識別するために必要な新たな挑戦は、蛋白質ダイナミクスの制御機構の解明。

いくつかの光学的手法が開発されている細胞1生活のこれらの相互作用を研究します。これらのうち、全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡、1980 年代初頭に開発によりでまたは非常に近い細胞膜2分子間相互作用の研究ができます。細胞内の全反射データから得られる膜タンパク質軌道の動的パラメーターを研究、単一粒子追跡法 (SPT) が必要です。いくつかのアルゴリズムがこれを利用可能な我々 は現在結果のトラックを接続するための連続するフレーム間の粒子をリンクすることにより密な粒子フィールドの粒子運動の不均質性をアドレス Jaqaman ら3の発行するものを使用します。完全な軌道 (一時粒子消失) にセグメント。ソフトウェア キャプチャ粒子凝集・解離のイベント3からその結果を分割します。このソフトウェアの出力データの 1 つは、....

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Protocol

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1. 生物学的試料の調製

  1. 成長 10% FCS RPMI 1640 培 Jurkat 細胞 NaPyr、L-グルタミン (完全な RPMI)。Electroporate Jurkat 細胞 (20 x 106セル/400 μ 10 %fcs と RPMI 1640) 単量体 GFP 標識ケモカイン受容体ベクトル (CXCR4-AcGFP、20 μ g) 蛍光顕微鏡を用いた検出を許可するとします。
    注:MCherry、mScarlet など他の単量体の蛍光タンパク質を使用することが可能です。
  2. トランスフェクション後 24 時間は、細胞生存率と CXCR4 AcGFP 式の両方を決定する流れの cytometer 細胞を分析します。
  3. Transfected 受容体の発現は低下は個々 のトレースの単一粒子追跡を保障するために観察実験に必要な細胞が GFP低陽性細胞 (図 1) の選別による低 CXCR4 AcGFP レベルを表現するセルを選択します軌道9。
  4. 細胞表面の受容体の数を定量化します。
    注:例として13〜 8,500 22,000 AcGFP ラベル受容体/セル、〜 2 4.....

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Results

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このプロトコルは、使用蛍光顕微鏡映画とその動的特性の解析で検出された粒子の自動追跡です。当初、セルは追跡する蛍光結合タンパク質をトランスフェクトしました。SPT は、ソーティング (図 1) によって得られることができる細胞表面受容体の適切なレベルを示します。選択したセルは、このプロトコル (補足のビデオ 1) で説明されているツールを学ぶことができる形式の動画を生成する全反射型顕微鏡によって分析されます。

生成された動画を直接分析できないし、各ビデオの独立したフレームが必要です。ImageJ の使用は、.tiff 形式またはマスクのビデオ フレームなど Matlab ソフトウェアを使用して解釈することができますファイルを生成します。U トラック選択したビデオで見られる粒子を追跡し、Matlab (.mat) ファイル (movieData.mat

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Discussion

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この方法は、Matlab の使用経験がなくても実行する簡単です。しかし、Matlab ルーチンは非常に、さまざまなコマンドの名称とプログラムで採用されている別のフォルダーのローカライズ精度必要があります。追跡解析ルーチン (ステップ 3)、複数のパラメーターを変更することができます。「設定ガウス混合物モデルふさわしい」ウィンドウ (手順 3.8) U トラックがビデオの単一粒子を検出する方法を制御します。これは、3で説明したように、ガウス混合物モデル当てはめによる。このフィッティングの重要なパラメーターの 1 つは、極大を識別するためのフィルターを定義します。この操作の成功は、画像のコントラストとノイズ画像の存在に依存します。最初のパラメーター (ローカル バック グラウンドとの比較のアルファ値) は、スポットの識別中にノイズを低減する 2 番目の支援中の実際の場所をされているマキシマの自信を制御します。「追跡」の手順 (3.9) で重要なパラメーターはギャップを閉じるするフレームの数 (つまり、トラックは粒子は実際に見られないそれはこれらフレーム前に、これらのフレーム後; 0 の例で見ら.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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我々 は拡散係数解析のヘルプとソース コード カルロ Manzo とマリア ・ ガルシア ・ Parajo に感謝しています。この作品は一部スペイン語科学省、イノベーションや大学 (SAF 2017-82940-R) からの助成金によって支えられた、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス 3 世 (RD12/0009/009 と RD16/0012/0006; の RETICS プログラムRIER)。LMM との JV は、フンダシオン一般 CSIC の COMFUTURO プログラムによってサポートされます。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ヒトJurkat細胞ATCCCRL-10915ヒトT細胞株。このソフトウェア
pAcGFPm-N1(PT3719-5)Clontech632469でさまざまな蛍光タンパク質を追跡し、分析できます
 バイオラッド Jurkatセルには280 V、975 mFを使用します。トランスフェクション法は、あなたの手で最適に働きます。 
Cytomics FC 500 フローサイトメーター ベックマン・コールター
MoFlo Astrios セルソーター ベックマン・コールタートランスフェクションのレベルによっては、細胞選別が不要な場合があります。 また、目的の受容体の適切なレベルを安定して発現する細胞を使用することもできます。
Dako QifikitDakoCytomationK0078細胞表面の受容体の数を定量化するために使用されます。
ガラス底マイクロウェル皿MatTekP35G-1.5-10-C
血漿からのヒトフィブロネクチンSigma-AldrichF0895
組換えヒトCXCL12PeproTech300928A
反転ライカAM TIRFライカ
EM-CCDカメラAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABThe MathWorks, Natick, MA
U-Track2 ソフトウェアDanuser Laboratory
ImageJNIH
https://imagej.nih.gov/ij/ FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 ソフトウェアMatlabツール。 インストールするには、Webページ(http://lccb.hms.harvard.edu/software.html)から.zipファイルをダウンロードし、選択した
GraphPad PrismGraphPadソフトウェアの
で他の細胞タイプを分析できますDNA3GFP このルーチンGene Pulse X Cellエレクトロポレーター株式会社 ディレクトリでファイルを解凍します

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....

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