方法論記事

精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために

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DOI：

10.3791/59320

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2019年4月10日

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1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

一過性エクソソーム通常筋前駆細胞由来の移植によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するためにプロトコルを紹介します。

要約

デュシェーヌ型筋ジストロフィー (DMD) は、X 連鎖劣性遺伝病機能ジストロフィン蛋白質の欠乏によって引き起こされます。病気を治癒することはできませんと進行するにつれて、患者は拡張型心筋症、不整脈、うっ血性心不全の症状を開発します。DMDMDX変異マウスは、ジストロフィンを発現していないと、DMD のマウスのモデルとして使われます。最近の研究では、我々 は観察幅広タイプ (WT) 心筋内注射すること-筋前駆細胞由来エクソソーム (MPC-エキソ) は一過性だった関連付けられている DMDMDX変異マウスの心筋内のジストロフィンの発現を復元示唆して心臓の機能の一時的な改善で WT MPC エキソ DMD の心臓の症状を緩和するためのオプションがあります。この記事では、MPC-エキソ精製と DMDMDX変異マウスの心移植の手法について説明します。

概要

デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) は X 連鎖劣性、進歩的な神経筋疾患です DMD 遺伝子と機能ジストロフィン1の損失の突然変異によって引き起こされます。ジストロフィンは主に骨格筋や心筋、表し、少ない平滑筋と腺内分泌ニューロン2,3で表されます。DMD は、3,500 に 5,000 新生児男の子世界4、5の 1 の発生率と筋ジストロフィーの最も一般的なタイプです。個人は通常進行性筋壊死、思春期、および心不全と呼吸不全6のための彼らの生命の第 2 から第十年の死によって歩行自立の損失を開発します。

拡張型心筋症、不整脈、うっ血性心不全は、DMD7,8の一般的な心血管症状です。病気を治癒することはできません、支持療法が症状を改善したり、心不全の進行を遅らせるが、心臓機能9,10を改善するために非常に困難です。

DMD 患者は、X-リンクされている筋ジストロフィーのよう (MDX) マウスはジストロフィン蛋白質および11心筋症の症状を呈するに欠乏しているし、関連付けられている DMD 心筋症研究で広く使用されしたがって。影響を受ける筋肉のジストロフィンを復元、するために同種造血幹細胞治療は、DMD12,13,14の効果的な治療であると証明しました。各種細胞から分泌される 30-150 nm 膜小胞エクソソームはメッセンジャー RNA (mRNA)、非コーディング RNAs15,16,17 などの遺伝学的物質輸送による細胞間コミュニケーションの重要な役割を再生します。 ,18,19,20,21。

私たちの以前の研究に由来する筋前駆細胞 (MPC)、C2C12 細胞株などエクソソームはジストロフィンを転送できることを示されているホスト心筋心臓噴22後の同種の配信にしたを示す mRNAMPC 派生エクソソーム (MPC-エキソ) 一過性 MDX マウスにおける DMD 遺伝子発現を復元できます。MPC-エキソ精製と移植技術について説明します。

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プロトコル

動物は、承認されたプロトコルおよび機関動物ケアとオーガスタ大学ジョージア医科大学の利用委員会の動物福祉規則に従って処理されていました。

1 MPC 派生エクソソームの分離, 精製

  1. 20 mL 完全・ ダルベッコと 15 cm 細胞培養皿の中シード 5 x 106 C2C12 細胞変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン G および 100 μ g/mL ストレプトマイシンを含みます。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。
  2. FBS の 100,000 × gで遠心スイング バケツの回転子を使用して 4 ° C で 18 h のエキソソーム枯渇媒体を準備します。ペレットを破棄します。
  3. 単層細胞培養皿で 80% の合流点に達するときエキソソーム枯渇の中で完全な DMEM を置き換えます。
  4. 転送ピペットを使用して、細胞培養ディッシュ計 3 回のすべての 48 h から上澄みを収集します。50 mL 遠沈管で残りのセルを削除する 10 分間 150 × gで遠心上清を収集します。
  5. 細胞の残骸を除去するために 0.22 μ m のフィルターを通して、上澄みをフィルターします。遠心フィルター エクソソームを沈殿させる 4 ° C で 120 分 100,000 × gでスイング バケツの回転子を使用して超クリアなチューブ中。
  6. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でエキソソームを含むペレットを再懸濁します、PBS と全体の超クリアなチューブを埋めます。汚染タンパク質を除去するために 4 ° C で 120 分のこの懸濁液 100,000 × gで遠心を実行します。
  7. 上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS でエキソソーム ペレットを再懸濁します。将来の使用に備えて-80 ° C で保存します。
  8. 電子顕微鏡による解析、室温で 5 分間 200 メッシュ ホルムバール被覆銅電子顕微鏡グリッド上 exosomal 懸濁液の 3 μ L を配置します。23の染色標準 005. を続行します。透過電子顕微鏡によるセミドライ グリッドを確認します。

2. 心筋エキソソーム配信

注:各グループの六つのマウスを使いました。

  1. DBA/2 j-DMDMDXマウス (男性; 年齢 > 10 ヶ月、体重 (BW) > 18 g) を 100 mg/kg BW ケタミン 10 mg/kg BW、キシラジンの併用腹腔注射で麻酔し、つま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。
  2. 臥位手術のプラットフォーム上で各マウスを修正するには、テープを使用して各肢を確保し、3-0 縫合場所で上顎を保持する上の歯の下に水平に配置します。
  3. 脱毛クリームを皮膚から毛皮を削除するマウスの胸の左側に適用されます。
  4. 24 G カテーテルを用いた口腔内から気管内挿管を行いマウス齧歯動物人工呼吸器を使用して 195 の呼吸/分の速度で部屋の空気を換気 (材料の表を参照してください)。
  5. 75% アルコール 10% ポビドン ヨードと皮膚を消毒します。
  6. 10\u201215 mm 斜切開左胸骨端から向かって左側の脇の下を作る、はさみ、によって、大胸筋および小胸筋をカット、第 4 肋間スペースを通って左開胸を行います。10 mm の幅に胸腔を広げるためリトラクター バンドをそっと挿入します。左の肺への損傷を避けるために注意してください。
  7. 心膜を削除し、それらを抜く際、中心部を公開するリトラクター ヒントの背後にそれらを置く 2 つのストレート ピンセットを使用します。MPC Exo を注入 (30 μ L の PBS で 50 μ g) または 1 つのサイトで 31 G インスリンの針を使用して左心室の前壁に 30 μ L の PBS (コントロール) として intramyocardially。
  8. 6-0 ナイロン縫合糸を使用して、シーケンスの胸腔内、大胸筋の筋肉と皮膚を閉じます。
  9. マウスを回復します。リズミカルな自発呼吸があれば、一度人工呼吸器と extubate から、マウスを削除します。観察し、手術後マウスの状態を記録します。

3. 心エコー

注:実験群に目がくらんで、単一の観察者は、心エコー検査、データ分析を行います。

  1. PBS/エキソソーム移植後 2 日間は麻酔 1\u20122% イソフルランとマウスです。
  2. テープを使用して仰臥位の位置でマウスを修正し、左胸の部分に予熱音響ゲルを適用します。
  3. 前述の16,24として、心エコー法による左室機能を評価します。
    1. 2 次元 (B モード)、左心室 (LV) の傍胸骨長軸ビューを取得し、乳頭筋レベルで LV の短い軸のビューを取得する超音波プローブ 90 ° を回転します。
    2. M モード心エコー画像を記録し、メジャー左心室末期径 (LVEDD)、左室収縮末期容積 (LVESD)、左心室末期容積 (LVEDV)、左室収縮末期容積 (LVESV)。
      注:短縮率 (FS %) = [(LVEDD − LVESD)/LVEDD 】 x 100、および左室駆出率 (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV)/LVEDV] x 100。

4. 免疫組織化学

  1. PBS/エキソソーム移植後 2 日間は (参照ステップ 2.1) マウスを麻酔し、胸骨を切開胸腔内を公開します。下大静脈の解剖、3 ml の PBS、常温で 4% パラホルムアルデヒドの 3 mL に続いて 5 mL 注射器に付いている 25 G 針と蝶カテーテルを用いた左心室尖を通して心臓を灌流します。
  2. 固定の心を埋め込むパラフィンで、5 μ m 厚いセクションにカットします。
  3. キシレンのスライドを deparaffinize、次の順序でのエタノール溶液から水分補給: 100% キシレン (3 分)、100% キシレン (3 分)、100% エタノール (1 分)、100% エタノール (1 分)、95% エタノール (1 分)、80% エタノール (1 分)、H2O (1 分)。
  4. 組織切片を室温で 8 分 4% パラホルムアルデヒドで固定します。
  5. クエン酸ナトリウム (0.01 M、pH 6.0) のスライドを没頭し、抗原レトリーバーを用いた抗原検索を実行します。
  6. PBS で 1% ポリエチレング リコール tert-オクチルフェニル エーテルと室温で 1 時間のセクションを permeabilize します。
  7. 室温で 1 時間 PBS で 5% ヤギ血清を使用してセクションをブロックします。
  8. 希釈した一次抗体 (抗ジストロフィン抗体) PBS (1: 100) で 4 ° C で一晩でセクションをインキュベートし、5 分 3 回を PBS で洗浄します。
  9. セクション希釈した二次抗体 (Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗うさぎ IgG) PBS (1: 400) で常温で 45 分間、インキュベートします。
  10. 蛍光が蛍光消光キット (材料の表を参照) を使用してコントロールします。
  11. 使用マウント培 DAPI (材料の表を参照)、スライドをマウントします。
  12. 共焦点顕微鏡のスライドを確認します。

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結果

分離し、C2C12 細胞からエクソソームを浄化のフローチャートを図 1に示します。エクソソームの存在を確認するには、透過電子顕微鏡による解析を行った。透過電子顕微鏡像 (図 1B) は、派生した C2C12 エクソソームの明るいとラウンド形状の小胞の形態を示しています。西部のしみの分析は CD63 と TSG101 を含むエキソソーム マーカーの存在を確認した (図 1C)。

心筋注入の成功を示す心筋 MDX マウス (図 2)、左心室の前壁に PBS/MPC-エキソ注入後半透明浮腫領域を観測しました。

免疫蛍光染色、ジストロフィンと共焦点顕微鏡とイメージングを行った心臓 MPC-エキソ配信...

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ディスカッション

純粋なエクソソームを分離する方法は、エクソソームの機能を研究するために不可欠です。エキソソーム分離の一般的なテクニックの 1 つはポリエチレン グリコール (ペグ) を介した降水量17,18,25です。エクソソームを釘で沈殿し、低速遠心分離によってペレットできます。ペグを介した浄化は非常に便利で、低コスト、それは任意の高度な機器を必要はありませんが、他のリポタンパク質一緒に沈殿することがあります、削除しにくいのでエクソソームの純度についての懸念があります。限外濾過は分子量と除外サイズ制限26に基づいてエキソソーム分離のため定期的な方法です。限外ろ過分離による遠心分離より高速ですが、大きい小胞構造上の損傷を引き起こすことができます。膜エクソソーム CD9、CD63 と CD8127などのさまざまなエピトープの存在は、これらのエピトープと抗体磁性ビーズに結合イム...

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開示事項

すべての著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

謝辞

唐は部分的に米国心臓協会によって支えられた: GRNT31430008, NIH AR070029, NIH HL086555, NIH HL134354。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上 μ;m フィルターフィッシャーブランド09-720-004
15 cm 細胞培養皿サーモフィッシャーサイエンティフィック157150
24 G カテーテルテルモSR-OX2419CA
31 G インスリン針BD328291
4% パラホルムアルデヒド AffymetrixAAJ19943K2
50 mL 遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック339652
6-0 縫合Pro Advantage by NDCP420697
Alexa Fluor 488 ヤギ 抗ウサギ IgGサーモフィッシャーサイエンティフィックA-11008
抗生物質 抗真菌剤コーニング 30-004-CI
抗ジストロフィン抗体Abcamab15277
抗原回収試薬 Aptum BiologicsR2100-US抗原回収
自家蛍光消光キット Vector LaboratoriesSP-8400
C2C12細胞株ATCCCRL-1772
遠心分離機UnicoC8606
Change-A-Tip High Temp CauteriesBovie Medical CorporationHIT
共焦点顕微鏡ZeissZeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx マウスジャクソン研究所013141
DMEMコーニング 10-013-CM
ウシ胎児血清 (FBS)コーニング 35-011-CV
ヤギ血清 MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
KetamineHenry Schein056344
Mounting Medium with DAPI ベクターラボラトリーズH-1500
マウスリトラクターセットケントサイエンティフィックSURGI-5001
ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテルフィッシャーサイエンティフィックBP151-100
げっ歯類の人工呼吸器ハーバード装置55-7066
SW-28 Tiベックマン 342207
Vevo 2100 イメージングプラットフォームFUJIFILM VisualSonicsVevo 2100超音波診断装置 
超遠心分離機ベックマン365672
ウルトラクリアチューブベックマン344058
キシラジン (キシラメッド)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006
糸 溶液 ローター

参考文献

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