マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

インビトロマイクロ核(MN)アッセイは、化学的および医薬品開発、ならびに様々な暴露者の間でヒトバイオモニタリングなどの研究のいくつかの分野におけるスクリーニングツールとして細胞毒性および登録毒性を評価するために一般的に使用される試験である。環境、職業またはライフスタイルの要因1、2、3.MNは、2つの主要な娘核の1つに組み込まれない細胞分裂中に生成された染色体断片または全染色体からなる。テロ相に続いて、この染色体材料は、主^核2のいずれかから分離された細胞質内の個々の丸みを帯びた体に形成される。したがって、MNはDNA損傷の代表であり、ゲノム毒性^試験4のエンドポイントとして長年使用されてきた。MNを測定する最も適切な方法は、サイトカインシスブロック微小核(CBMN)アッセイである。CBMNアッセイを用いて、ビヌクレス細胞(BNC)におけるMNの周波数は、試料にサイトチャラシンB(Cyt-B)を組み込むことによって得点することができる。Cyt-Bは核分裂を可能にするが、細胞分裂を防ぎ、MNのスコアリングを5回しか分割していないBNCに制限する。

顕微鏡検査とフローサイトメトリーの両方を使用するプロトコルが開発され、検証され、インビトロMNアッセイ6、7、8、9、10^{を実行するために日常的に使用されています。11,12,13,14}.顕微鏡検査は、MNが正当であることを視覚的に確認できることから利益を得るが、時間がかかり、スコア^ラー15間の変動が起こりやすい。これに対処するために、自動顕微鏡検査法は、スライドをスキャンし、核とMN 16、17、18、19の画像をキャプチャするために開発されましたが、細胞質を視覚化することはできません。MN が実際に特定のセルに関連付けられているかどうかを判断するのは困難です。さらに、これらの方法は、Cyt-B9を用いた場合の細胞傷害性の計算に必要な多核化(POLY)細胞(三角および四分円細胞を含む)を同定することが困難である。MNアッセイを行うために開発されたフローサイトメトリー法は、蛍光と前方および側散乱強度を用いて、lysis20,21に続いて細胞から解放された核とMNの両方の集団を同定する。 ^、22.これにより、数分で数千セルからデータを取得することができ、自動分析²³を可能にします。しかし、細胞を視覚化できないと、スコア付けされたイベントが本物であることを確認できなくなります。さらに、細胞膜を溶解すると、Cyt-Bの使用を阻害するだけでなく、染色体凝集体やアポトーシス体などの他の破片を含む懸濁液を作成し、これらをMN²⁴と区別する方法はありません。

これらの制限に照らして、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたMNアッセイを実行するのに理想的なシステムです。MIFCでは、すべての細胞が流体系に導入され、流動細胞キュベットの中心に動的に集動されます。すべての細胞の直交照明は、明視野(BF)発光ダイオード(LED)、サイド散乱レーザーおよび(少なくとも)1つの蛍光レーザーの使用を使用することによって達成される。蛍光光子は、3つの(20x、40xまたは60x)高い数値開口対物レンズのいずれかによって捕捉され、スペクトル分解要素を通過します。フォトンは、電荷結合デバイス (CCD) カメラに焦点を当てて、フロー セルを通過するすべてのセルの高解像度画像を取得します。ぼかしやストリークを避けるために、CCDは、流れのセルの速度と同期して行から行下にピクセルコンテンツを転送することにより、オブジェクトを追跡する時間遅延統合(TDI)モードで動作します。ピクセル情報は、ピクセルの最後の行から収集されます。スペクトル分解と組み合わせたTDIイメージングにより、フローセルを通過するすべての細胞から最大12枚の画像(2BF、10蛍光)を同時に捕捉できます。キャプチャされたすべての画像はサンプル固有のデータファイルに保存されるため、MIFCデータ解析ソフトウェアを使用していつでも分析を実行できます。最後に、データファイルは、すべての二変量プロット上のセルラー画像とドット間のリンクを保持します。これは、従来の二変量プロット上の任意のドットを強調表示することができ、対応するBFおよび蛍光画像^が25に表示されることを意味します。

近年、MIFCベースの方法は、トリアージ放射線バイオドシメトリー26、27、28、29、30、31^および遺伝的両方のMNアッセイを行うために開発された。毒物学32、33テスト。本研究は、主核、MNおよび細胞質の細胞画像が他の方法26よりも高いスループットで画像化できることを実証した。MONOセル、NNC(MNの有無にかかわらず)、POLYセルを含む解析に必要なすべての細胞タイプは、MIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別することができ、Fenechらによって開発されたスコアリング基準の実装は、によって達成されます。様々な数学的アルゴリズム6、34の使用。バイオドシメトリーの結果は、BNC²⁹あたりのMNの速度を定量化する際に文献の他の自動化された方法から得られたものと用量応答較正曲線が大きさで類似していることを示した。さらに、毒物学の最近の研究は、MONO細胞、BNC(MNの有無にかかわらず)およびPOLY細胞の画像がMIFCを使用して自動的に捕捉、同定、分類、列挙できることを実証しました。プロトコルおよびデータ分析は、TK6細胞をいくつかのクラストゲンおよびアヌ^ゲン32に暴露した後、細胞毒性および無毒性の計算を可能にした。

本論文で提示されるプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行う方法について説明する。この作業で使用されるサンプル処理技術は、単一のサンプルを処理するのに2時間未満で、他の方法と比較して比較的簡単に実行できます。MIFC 解析ソフトウェアのデータ分析は複雑ですが、このホワイト ペーパーで説明した手順に従って、分析テンプレートの作成は数時間で完了できます。さらに、テンプレートが作成されると、それ以上の作業を行わずに、収集されたすべてのデータに自動的に適用できます。このプロトコルは、TK6細胞をクラストゲンおよびアニューゲンに暴露するために必要なすべてのステップを概説し、細胞を培養、処理、染色する方法を説明し、MIFCを用いて高解像度画像を取得する方法を示す。さらに、本論文では、細胞毒性と無毒性の両方を計算する目的でMONO細胞、BNC、およびPOLY細胞を自動的に同定し、スコア付けするためにMIFCソフトウェアのデータを分析するための現在のベストプラクティスを示す。

1. 培養培地の調製とTK6細胞の培養

注:このプロトコルで使用される一部の化学物質は有毒です。皮膚Bを吸入、嚥下または接触することは致命的なことができます。実験室用コートと2組のニトリル手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。取り扱い後は手をよく洗ってください。ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入または飲み込んだ場合に有毒です。目、呼吸器系、皮膚を刺激する。吸入や皮膚接触により感せが生じる可能性があります。目に深刻な損傷を与える危険性があります。それは潜在的な発癌物質です。

1. 1x RPMI培養培地の565mLを調出す。MEM非必須アミノ酸(100x)、5mLのピルビン酸ナトリウム(100mM)、5mLのペニシリン連鎖筋ミン-グルタミン(100倍)、50mLの胎児ウシ血清(FBS)を1x RPMI10の500mLボトルに加えます。バイオセーフティキャビネットで培地を準備し、2-8 °Cで保存します。TK6細胞に添加する前に培地を37°Cに加熱します(材料の表を参照)。
2. TK6細胞の1mLを10mLの培地で解凍(DMSOで-80°Cで貯蔵)。細胞を200 x gで8分間遠心分離し、上清を吸引する。細胞を50mLの培体に移し、37°C、5%CO2でインキュベートする。TK6細胞の倍増時間は~12~18時間と変化し、細胞が最大増殖速度に達するためには少数の(3または4)の通過が必要になります(材料の表を参照)。
3. 培養100mLの細胞を〜7〜8 x 10⁵細胞/mLの濃度にする。

2. クラストゲンおよび/またはアヌゲンおよびサイトチャラシンBの調製

1. 所望のクラストゲンおよびアヌゲンの適切なストック濃度を調調す。例えば、ミトマイシンCの場合、無菌水の10mLに完全な2mgボトルを溶解し、200 μg/mLの最終ストック濃度を達成します。ミトマイシンCは4°Cで3ヶ月間保存できます(材料の表参照)。
2. 実験日に、滅菌水またはDMSOで希釈する場合、所望の暴露濃度よりも10倍または100倍高い所望の化学物質の希釈をそれぞれ調製する。
3. ミトマイシンCの場合は、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、および5.0 μg/mLの滅水で3mL希釈を調出します。コルチシンの場合は、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、および 0.5 μg/mL の滅水で 3 mL 希釈を調出します。最後に、マンニトールの場合は、5、10、20、30、40、および50mg/mLの無菌水で3 mL希釈を調出します。
4. 5mgボトルをDMSOの25mLに溶解することにより、サイトカラシンBの200 μg/mLストック濃度を調出します。サイトチャラシンBは、数ヶ月間-20°Cで保存することができる。

3. クラストゲンおよび/またはアヌイゲンへの細胞の暴露

1. 所望の化学物質の1 mL(例えばミトマイシンC)をT25フラスコで〜7-8x10⁵細胞/mLで9mLの細胞に加える。対照サンプルの場合は、滅菌水を1mL加えます。フラスコを37°C、5%CO2インキュベーターに3時間置きます。
   注:DMSOで化学物質を希釈する場合は、各フラスコに100 μLの化学物質のみを追加し、コントロールに100 μLのDMSOを追加します。各フラスコには 9.900 mL のセルが含まれている必要があります。
2. 3時間後、インキュベーターからフラスコを取り出し、細胞を15 mLポリプロピレンチューブに移します。遠心分離機を200xgで8分間、上清を吸引し、合計10mLの新鮮培養培地を含む新しいT25フラスコに細胞を移移す。 各フラスコに150 μLのストック濃度(200 μg/mL)を追加し、最終的な濃度を3μg/mLにします。
3. フラスコを37°C、5%のCO2インキュベーターに戻し、OECDガイドライン9で推奨されているように、1.5-2.0倍の回収時間に相当します。本研究で使用したTK6細胞の回収時間は24時間であった。
   注:ここで使用したTK6細胞の倍増時間は15時間で、回収時間は24時間(1.6倍)であった。回収時間が1.5倍未満の場合、BNCの数に影響を与える高用量にさらされたサンプルの増殖が減少します。歪んだ細胞毒性の計算。

4. DNA含有量の固定および標識のためのバッファーの準備(材料の表を参照)

1. 超純水の500 mLに2.79gを加えて塩化カリウム(KCl)の75mMを調調します。200 μm フィルターを通して磁気攪拌機と滅菌フィルターを使用して 5 分間溶液をかき混ぜます。75 mM KCl溶液は、数ヶ月間4°Cで保存することができます。
2. 実験に十分な量の4%ホルマリンを準備し、各サンプルに合計2.1 mLを添加する必要があることを予測します。例えば、4%ホルマリンの10mLを調製するために、Ca2+またはMg2+(PBS)を使用せずに1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液の6mLに10%ホルマリンストックの4 mLを添加する。この4%ホルマリンは、数週間室温で保存することができる。

このホワイト ペーパーで概説した分析方法により、MN の有無にかかわらず、BNC の自動識別とスコアリングを行い、ジェノ毒性を計算できます。さらに、MONO細胞とPOLY細胞も自動的に同定され、細胞毒性を計算するためにスコア付けされます。これらのイベントをスコアリングする際に遵守する必要がある公開されたスコア基準 6,34は、MIFC データ分析ソフトウェアに実装されています。ここで提示された結果は、細胞毒性の増加に伴うMN頻度の統計的に有意な増加が、ヒトリンパ芽球性TK6細胞をよく知られているMN誘導化学物質(ミトマイシンCおよびコルチシン)に曝露した後に検出できることを示している。試験された追加の化学物質に対する同様の結果は、別の出版物32で実証されている。さらに、Mannitolの使用の結果は、非MN誘導化学物質もここで概説するMIFC法を使用して正しく識別できることを示しています。すべてのマスク、特徴および領域の境界を作成するためにプロトコルで説明されているパラメータは、異なる細胞タイプ(例えば中国ハムスター細胞)がアッセイを実行するために使用される場合、調整する必要がある可能性が高い。

図 3は、BNC を識別するために選択した 4 つのパネルを示しています (図 3A-3D)。ここに示すのは、2つの核(図3A)と、類似した円形(図3B)、類似した領域と強度を持つBNCの選択を可能にする二変量プロットを持つ細胞の選択を可能にするヒストグラムです(図3C)。)と、スコアリングクリティエリア6、34に準拠して、十分に分離された、重複しない核(図3D)を有するBNC。図 3Eは、BF および Hoechst イメージ、および BNC および MN マスクを示し、単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示します。これにより、最終的なBNC集団における微小核BNCの速度を決定することによって、ゲノ毒性を計算することができる。図 4は、POLY マスクを使用して MONO、TRI、および QUAD セルを識別するスポットカウント機能の適用を示しています。次に、TRI セルと QUAD セルの数を合計して、最終的なポリセル数を取得できます (表1)。これにより、プロトコルに示す式を使用して細胞毒性を計算することができます。したがって、実験における各用量点は、無毒性および細胞毒性パラメータの両方によって評価することができる。

図5は、アヌゲンコルチシン、クラストゲンミトマイシンCおよび陰性対照、マンニトールに対するゲノ毒性および細胞毒性値を示す。コルチシン(図5A)の場合、0.02~0.05 μg/mL用量は、溶媒制御に対してそれぞれ1.28%から2.44%の範囲で、MN周波数の統計的に有意な増加を生み出した(表1)。ミトマイシンC(図5B)の場合、溶媒対照と比較した場合、0.4と0.5 μg/mLの2つのトップ用量が統計的に有意なMN周波数を生成した。これらのMN周波数は0.4 μg/mLで0.93%、0.5 μg/mLで1.02%であった(表2)。最後に、Mannitol(図5C)に対しては、試験された用量は30%を超える細胞毒性を誘導せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMN周波数の有意な増加を生じなかった(表3)。

図 1: MIFC計測器の設定。プロトコルのセクション 7 で説明されている MIFC 設定のスクリーンショット。(A) 405 nmレーザーパワーを10mWに設定。(B) BF チャンネル 1 および 9 を設定します。(C) 60倍倍倍の対物レンズを選択する。(D) 最も解像度の高い画像を生成する最も遅い流速を選択します。(E) 収集するイベントの数を 20,000 に指定します。(F) [ロード]ボタンをクリックして、サンプル読み込みプロセスを開始します。(G) [取得]ボタンをクリックして画像の取得を開始します。(H) [戻る]ボタンをクリックすると、未使用のサンプルが返されます。(I) 単一細胞の選択に対するBFアスペクト比対BF面積の散布図。(J) 集値セルの選択に対するホーチスト勾配RMS対BF勾配RMSの散布図。(K)DNA陽性細胞の選択のためのホエヒト強度のヒストグラム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2:分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのセクション 9 で説明するゲーティング戦略のスクリーンショット。領域は、二核化細胞(赤い箱)、微小核(黄色の箱)、および単核細胞(青い箱)の同定のための順番に示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: MN の有無にかかわらず、BNC の識別とスコアリング。(A) 2つの異なる核を持つ細胞の選択。(B) アスペクト比強度特徴を用いた2つの円高核を持つ二核(BNC)の同定。(C) 類似の領域と強度を持つ核を持つBNCの選択。これは、両方の核の面積の比率と両方の核のアスペクト比の比率を計算することによって達成される。(D) 形状比とアスペクト比機能を使用して、2つのよく分離された核を持つBNCを識別する。(E) 単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示すマイクロ核(MN)マスクを使用したスポットカウント機能。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: MONO および POLY セルの識別とスコアリング。スポットカウント機能を使用して、モノ、トライ、四分円のセルを識別して列挙します。成分マスク1は、単核細胞の同定を可能にする(上画像)。成分マスク1~3は、三角細胞(中間画像)の同定を可能にする。コンポーネントマスク1~4は、四分位細胞の同定を可能にする(下の画像)。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 細胞毒性の定量化。サイトカインシスブロック増殖指数(黒い円)とゲノキシック性を用いて定量した細胞毒性は、(A)コルチシン、(B)ミトマイシンCおよび(および(C)マンチトール。コントロールと比較したMN周波数の統計的に有意な増加は、星によって示されます(カイ二乗検定;*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。すべての量は、各線量点で2回の反復の平均である。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1:コルチシンの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

表 2:ミトマイシンCの細胞毒性(モノ、バイ、ポリ核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクレオ化細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

表 3:Mannitolの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびジェノ毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

補足 1: 完全なプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足2:マスクリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は、本作で使用したImageStreamマルチスペクトルイメージングフローサイトメーターのメーカーであるルミネックス株式会社に採用されています。