方法論記事

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

DOI：

10.3791/59324

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2019年5月13日

1Biology Department, Luminex Corporation

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

インビトロ微小核(MN)アッセイは、細胞毒性およびゲノキシビリティを評価するためにしばしば使用されますが、手動顕微鏡検査を介してアッセイを採点することは面倒であり、スコアラー間の変動による結果の不確実性を引き起します。これを改善するために、自動スライドスキャン顕微鏡と従来のフローサイトメトリー法が導入され、スコアラーバイアスを除去し、スループットを向上させようとしています。しかし、これらの方法には、細胞の細胞質を可視化できない、フローサイトメトリーによる視覚的なMN検証や画像データストレージの欠如など、独自の固有の制限があります。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、これらの制限を克服する可能性を秘めています。MIFCは、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と、従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたものです。さらに、収集されたすべての画像は、線量固有のファイルに格納することができます。本論文では、MIFC上で完全に自動化されたMNアッセイを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。ヒトリンパ芽球体TK6細胞は、低対性溶液(75mM KCl)を用いて拡大し、4%ホルマリンで固定し、核含有量をHoechst 33342で染色した。すべてのサンプルはMIFC上で懸濁液中で実行され、アッセイに必要なすべての主要事象の高解像度画像の取得を可能にした(例えば、MNの有無にかかわらず二重化細胞、および単核化細胞および多核化細胞)。画像はMIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別、分類、列挙され、細胞毒性と無毒性の両方の自動スコアリングが可能でした。結果は、MIFCを使用してインビトロMNアッセイを行うことを示し、TK6細胞の曝露後の溶媒対照と比較した場合、MN周波数の統計的に有意な増加をいくつかの異なるレベルで検出することを可能にするミトマイシンCおよびコルチシンは、マンニトールへの曝露後にMN周波数の有意な増加が観察されない。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

インビトロマイクロ核(MN)アッセイは、化学的および医薬品開発、ならびに様々な暴露者の間でヒトバイオモニタリングなどの研究のいくつかの分野におけるスクリーニングツールとして細胞毒性および登録毒性を評価するために一般的に使用される試験である。環境、職業またはライフスタイルの要因1、2、3.MNは、2つの主要な娘核の1つに組み込まれない細胞分裂中に生成された染色体断片または全染色体からなる。テロ相に続いて、この染色体材料は、主核2のいずれかから分離された細胞質内の個々の丸みを帯びた体に形成される。したがって、MNはDNA損傷の代表であり、ゲノム毒性試験4のエンドポイントとして長年使用されてきた。MNを測定する最も適切な方法は、サイトカインシスブロック微小核(CBMN)アッセイである。CBMNアッセイを用いて、ビヌクレス細胞(BNC)におけるMNの周波数は、試料にサイトチャラシンB(Cyt-B)を組み込むことによって得点することができる。Cyt-Bは核分裂を可能にするが、細胞分裂を防ぎ、MNのスコアリングを5回しか分割していないBNCに制限する。

顕微鏡検査とフローサイトメトリーの両方を使用するプロトコルが開発され、検証され、インビトロMNアッセイ6、7、8、9、10を実行するために日常的に使用されています。11,12,13,14.顕微鏡検査は、MNが正当であることを視覚的に確認できることから利益を得るが、時間がかかり、スコアラー15間の変動が起こりやすい。これに対処するために、自動顕微鏡検査法は、スライドをスキャンし、核とMN 16、17、18、19の画像をキャプチャするために開発されましたが、細胞質を視覚化することはできません。MN が実際に特定のセルに関連付けられているかどうかを判断するのは困難です。さらに、これらの方法は、Cyt-B9を用いた場合の細胞傷害性の計算に必要な多核化(POLY)細胞(三角および四分円細胞を含む)を同定することが困難である。MNアッセイを行うために開発されたフローサイトメトリー法は、蛍光と前方および側散乱強度を用いて、lysis20,21に続いて細胞から解放された核とMNの両方の集団を同定する。 、22.これにより、数分で数千セルからデータを取得することができ、自動分析23を可能にします。しかし、細胞を視覚化できないと、スコア付けされたイベントが本物であることを確認できなくなります。さらに、細胞膜を溶解すると、Cyt-Bの使用を阻害するだけでなく、染色体凝集体やアポトーシス体などの他の破片を含む懸濁液を作成し、これらをMN24と区別する方法はありません。

これらの制限に照らして、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたMNアッセイを実行するのに理想的なシステムです。MIFCでは、すべての細胞が流体系に導入され、流動細胞キュベットの中心に動的に集動されます。すべての細胞の直交照明は、明視野(BF)発光ダイオード(LED)、サイド散乱レーザーおよび(少なくとも)1つの蛍光レーザーの使用を使用することによって達成される。蛍光光子は、3つの(20x、40xまたは60x)高い数値開口対物レンズのいずれかによって捕捉され、スペクトル分解要素を通過します。フォトンは、電荷結合デバイス (CCD) カメラに焦点を当てて、フロー セルを通過するすべてのセルの高解像度画像を取得します。ぼかしやストリークを避けるために、CCDは、流れのセルの速度と同期して行から行下にピクセルコンテンツを転送することにより、オブジェクトを追跡する時間遅延統合(TDI)モードで動作します。ピクセル情報は、ピクセルの最後の行から収集されます。スペクトル分解と組み合わせたTDIイメージングにより、フローセルを通過するすべての細胞から最大12枚の画像(2BF、10蛍光)を同時に捕捉できます。キャプチャされたすべての画像はサンプル固有のデータファイルに保存されるため、MIFCデータ解析ソフトウェアを使用していつでも分析を実行できます。最後に、データファイルは、すべての二変量プロット上のセルラー画像とドット間のリンクを保持します。これは、従来の二変量プロット上の任意のドットを強調表示することができ、対応するBFおよび蛍光画像が25に表示されることを意味します。

近年、MIFCベースの方法は、トリアージ放射線バイオドシメトリー26、27、28、29、30、31および遺伝的両方のMNアッセイを行うために開発された。毒物学32、33テスト。本研究は、主核、MNおよび細胞質の細胞画像が他の方法26よりも高いスループットで画像化できることを実証した。MONOセル、NNC(MNの有無にかかわらず)、POLYセルを含む解析に必要なすべての細胞タイプは、MIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別することができ、Fenechらによって開発されたスコアリング基準の実装は、によって達成されます。様々な数学的アルゴリズム6、34の使用。バイオドシメトリーの結果は、BNC29あたりのMNの速度を定量化する際に文献の他の自動化された方法から得られたものと用量応答較正曲線が大きさで類似していることを示した。さらに、毒物学の最近の研究は、MONO細胞、BNC(MNの有無にかかわらず)およびPOLY細胞の画像がMIFCを使用して自動的に捕捉、同定、分類、列挙できることを実証しました。プロトコルおよびデータ分析は、TK6細胞をいくつかのクラストゲンおよびアヌゲン32に暴露した後、細胞毒性および無毒性の計算を可能にした。

本論文で提示されるプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行う方法について説明する。この作業で使用されるサンプル処理技術は、単一のサンプルを処理するのに2時間未満で、他の方法と比較して比較的簡単に実行できます。MIFC 解析ソフトウェアのデータ分析は複雑ですが、このホワイト ペーパーで説明した手順に従って、分析テンプレートの作成は数時間で完了できます。さらに、テンプレートが作成されると、それ以上の作業を行わずに、収集されたすべてのデータに自動的に適用できます。このプロトコルは、TK6細胞をクラストゲンおよびアニューゲンに暴露するために必要なすべてのステップを概説し、細胞を培養、処理、染色する方法を説明し、MIFCを用いて高解像度画像を取得する方法を示す。さらに、本論文では、細胞毒性と無毒性の両方を計算する目的でMONO細胞、BNC、およびPOLY細胞を自動的に同定し、スコア付けするためにMIFCソフトウェアのデータを分析するための現在のベストプラクティスを示す。

プロトコル

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1. 培養培地の調製とTK6細胞の培養

注:このプロトコルで使用される一部の化学物質は有毒です。皮膚Bを吸入、嚥下または接触することは致命的なことができます。実験室用コートと2組のニトリル手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。取り扱い後は手をよく洗ってください。ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入または飲み込んだ場合に有毒です。目、呼吸器系、皮膚を刺激する。吸入や皮膚接触により感せが生じる可能性があります。目に深刻な損傷を与える危険性があります。それは潜在的な発癌物質です。

  1. 1x RPMI培養培地の565mLを調出す。MEM非必須アミノ酸(100x)、5mLのピルビン酸ナトリウム(100mM)、5mLのペニシリン連鎖筋ミン-グルタミン(100倍)、50mLの胎児ウシ血清(FBS)を1x RPMI10の500mLボトルに加えます。バイオセーフティキャビネットで培地を準備し、2-8 °Cで保存します。TK6細胞に添加する前に培地を37°Cに加熱します(材料の表を参照)。
  2. TK6細胞の1mLを10mLの培地で解凍(DMSOで-80°Cで貯蔵)。細胞を200 x gで8分間遠心分離し、上清を吸引する。細胞を50mLの培体に移し、37°C、5%CO2でインキュベートする。TK6細胞の倍増時間は~12~18時間と変化し、細胞が最大増殖速度に達するためには少数の(3または4)の通過が必要になります(材料の表を参照)。
  3. 培養100mLの細胞を〜7〜8 x 105細胞/mLの濃度にする。

2. クラストゲンおよび/またはアヌゲンおよびサイトチャラシンBの調製

  1. 所望のクラストゲンおよびアヌゲンの適切なストック濃度を調調す。例えば、ミトマイシンCの場合、無菌水の10mLに完全な2mgボトルを溶解し、200 μg/mLの最終ストック濃度を達成します。ミトマイシンCは4°Cで3ヶ月間保存できます(材料の表参照)。
  2. 実験日に、滅菌水またはDMSOで希釈する場合、所望の暴露濃度よりも10倍または100倍高い所望の化学物質の希釈をそれぞれ調製する。
  3. ミトマイシンCの場合は、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、および5.0 μg/mLの滅水で3mL希釈を調出します。コルチシンの場合は、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、および 0.5 μg/mL の滅水で 3 mL 希釈を調出します。最後に、マンニトールの場合は、5、10、20、30、40、および50mg/mLの無菌水で3 mL希釈を調出します。
  4. 5mgボトルをDMSOの25mLに溶解することにより、サイトカラシンBの200 μg/mLストック濃度を調出します。サイトチャラシンBは、数ヶ月間-20°Cで保存することができる。

3. クラストゲンおよび/またはアヌイゲンへの細胞の暴露

  1. 所望の化学物質の1 mL(例えばミトマイシンC)をT25フラスコで〜7-8x105細胞/mLで9mLの細胞に加える。対照サンプルの場合は、滅菌水を1mL加えます。フラスコを37°C、5%CO2インキュベーターに3時間置きます。
    注:DMSOで化学物質を希釈する場合は、各フラスコに100 μLの化学物質のみを追加し、コントロールに100 μLのDMSOを追加します。各フラスコには 9.900 mL のセルが含まれている必要があります。
  2. 3時間後、インキュベーターからフラスコを取り出し、細胞を15 mLポリプロピレンチューブに移します。遠心分離機を200xgで8分間、上清を吸引し、合計10mLの新鮮培養培地を含む新しいT25フラスコに細胞を移移す。 各フラスコに150 μLのストック濃度(200 μg/mL)を追加し、最終的な濃度を3μg/mLにします。
  3. フラスコを37°C、5%のCO2インキュベーターに戻し、OECDガイドライン9で推奨されているように、1.5-2.0倍の回収時間に相当します。本研究で使用したTK6細胞の回収時間は24時間であった。
    注:ここで使用したTK6細胞の倍増時間は15時間で、回収時間は24時間(1.6倍)であった。回収時間が1.5倍未満の場合、BNCの数に影響を与える高用量にさらされたサンプルの増殖が減少します。歪んだ細胞毒性の計算。

4. DNA含有量の固定および標識のためのバッファーの準備(材料の表を参照)

  1. 超純水の500 mLに2.79gを加えて塩化カリウム(KCl)の75mMを調調します。200 μm フィルターを通して磁気攪拌機と滅菌フィルターを使用して 5 分間溶液をかき混ぜます。75 mM KCl溶液は、数ヶ月間4°Cで保存することができます。
  2. 実験に十分な量の4%ホルマリンを準備し、各サンプルに合計2.1 mLを添加する必要があることを予測します。例えば、4%ホルマリンの10mLを調製するために、Ca2+またはMg2+(PBS)を使用せずに1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液の6mLに10%ホルマリンストックの4 mLを添加する。この4%ホルマリンは、数週間室温で保存することができる。






  1. figure-protocol-1

    1. figure-protocol-2

    2. figure-protocol-3

結果

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このホワイト ペーパーで概説した分析方法により、MN の有無にかかわらず、BNC の自動識別とスコアリングを行い、ジェノ毒性を計算できます。さらに、MONO細胞とPOLY細胞も自動的に同定され、細胞毒性を計算するためにスコア付けされます。これらのイベントをスコアリングする際に遵守する必要がある公開されたスコア基準 6,34は、MIFC データ分析ソフトウェアに実装されています。ここで提示された結果は、細胞毒性の増加に伴うMN頻度の統計的に有意な増加が、ヒトリンパ芽球性TK6細胞をよく知られているMN誘導化学物質(ミトマイシンCおよびコルチシン)に曝露した後に検出できることを示している。試験された追加の化学物質に対する同様の結果は、別の出版物32で実証されている。さらに、Mannitolの使用の結果は、非MN誘導化学物質もここで概説するMIFC法を使用して正しく識別できることを示しています。すべてのマスク、特徴および領域の境界を作成するためにプロトコルで説明されているパラメータは、異なる細胞タイプ(例えば中国ハムスター細胞)がアッセイを実行するために使用される場合、調整する必要がある可能性が高い。

図 3は、BNC を識別するために選択した 4 つのパネルを示しています (図 3A-3D)。ここに示すのは、2つの核(図3A)と、類似した円形(図3B)、類似した領域と強度を持つBNCの選択を可能にする二変量プロットを持つ細胞の選択を可能にするヒストグラムです(図3C)。)と、スコアリングクリティエリア6、34に準拠して、十分に分離された、重複しない核(図3D)を有するBNC。図 3Eは、BF および Hoechst イメージ、および BNC および MN マスクを示し、単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示します。これにより、最終的なBNC集団における微小核BNCの速度を決定することによって、ゲノ毒性を計算することができる。図 4は、POLY マスクを使用して MONO、TRI、および QUAD セルを識別するスポットカウント機能の適用を示しています。次に、TRI セルと QUAD セルの数を合計して、最終的なポリセル数を取得できます (表1)。これにより、プロトコルに示す式を使用して細胞毒性を計算することができます。したがって、実験における各用量点は、無毒性および細胞毒性パラメータの両方によって評価することができる。

図5は、アヌゲンコルチシン、クラストゲンミトマイシンCおよび陰性対照、マンニトールに対するゲノ毒性および細胞毒性値を示す。コルチシン(図5A)の場合、0.02~0.05 μg/mL用量は、溶媒制御に対してそれぞれ1.28%から2.44%の範囲で、MN周波数の統計的に有意な増加を生み出した(表1)。ミトマイシンC(図5B)の場合、溶媒対照と比較した場合、0.4と0.5 μg/mLの2つのトップ用量が統計的に有意なMN周波数を生成した。これらのMN周波数は0.4 μg/mLで0.93%、0.5 μg/mLで1.02%であった(表2)。最後に、Mannitol(図5C)に対しては、試験された用量は30%を超える細胞毒性を誘導せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMN周波数の有意な増加を生じなかった(表3)。

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図 1: MIFC計測器の設定。プロトコルのセクション 7 で説明されている MIFC 設定のスクリーンショット。(A) 405 nmレーザーパワーを10mWに設定。(B) BF チャンネル 1 および 9 を設定します。(C) 60倍倍倍の対物レンズを選択する。(D) 最も解像度の高い画像を生成する最も遅い流速を選択します。(E) 収集するイベントの数を 20,000 に指定します。(F) [ロード]ボタンをクリックして、サンプル読み込みプロセスを開始します。(G) [取得]ボタンをクリックして画像の取得を開始します。(H) [戻る]ボタンをクリックすると、未使用のサンプルが返されます。(I) 単一細胞の選択に対するBFアスペクト比対BF面積の散布図。(J) 集値セルの選択に対するホーチスト勾配RMS対BF勾配RMSの散布図。(K)DNA陽性細胞の選択のためのホエヒト強度のヒストグラム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図 2:分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのセクション 9 で説明するゲーティング戦略のスクリーンショット。領域は、二核化細胞(赤い箱)、微小核(黄色の箱)、および単核細胞(青い箱)の同定のための順番に示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図 3: MN の有無にかかわらず、BNC の識別とスコアリング。(A) 2つの異なる核を持つ細胞の選択。(B) アスペクト比強度特徴を用いた2つの円高核を持つ二核(BNC)の同定。(C) 類似の領域と強度を持つ核を持つBNCの選択。これは、両方の核の面積の比率と両方の核のアスペクト比の比率を計算することによって達成される。(D) 形状比とアスペクト比機能を使用して、2つのよく分離された核を持つBNCを識別する。(E) 単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示すマイクロ核(MN)マスクを使用したスポットカウント機能。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図 4: MONO および POLY セルの識別とスコアリング。スポットカウント機能を使用して、モノ、トライ、四分円のセルを識別して列挙します。成分マスク1は、単核細胞の同定を可能にする(上画像)。成分マスク1~3は、三角細胞(中間画像)の同定を可能にする。コンポーネントマスク1~4は、四分位細胞の同定を可能にする(下の画像)。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図 5: 細胞毒性の定量化。サイトカインシスブロック増殖指数(黒い円)とゲノキシック性を用いて定量した細胞毒性は、(A)コルチシン、(B)ミトマイシンCおよび(および(C)マンチトール。コントロールと比較したMN周波数の統計的に有意な増加は、星によって示されます(カイ二乗検定;*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。すべての量は、各線量点で2回の反復の平均である。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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表 1:コルチシンの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

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表 2:ミトマイシンCの細胞毒性(モノ、バイ、ポリ核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクレオ化細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

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表 3:Mannitolの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびジェノ毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

補足 1: 完全なプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足2:マスクリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近の出版物でVermaらは、フローサイトメトリーのハイスループットの利点と画像解析35のデータおよび画像記憶の利点を組み合わせたシステムを開発することの重要性を強調した。このホワイト ペーパーに記載されている IMFC in vitro MN アッセイは、この引用を満たしており、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー法における前述の課題の多くを克服する可能性を秘めています。ここで説明するプロトコルは、細胞毒性と無毒性の両方がMIFCを用いて評価できることを示している。サンプル調製、細胞染色、データ収集は簡単ですが、プロトコルには常に実装する必要がある重要な手順がいくつかあります。細胞への塩化カリウム(KCl)の添加は、細胞を膨らみ、主核間の分離を生成するために重要である。これにより、マスキング アルゴリズムは、列挙に必要な BNC および POLY セル (POLY セル) 内のすべての個々の核を識別できます。さらに、KCLは正確なMNマスキングおよび定量のために不可欠である核とMNの間の分離を提供する。さらに、KClの添加に続くホルマリンの使用は、遠心分離中に細胞がlysingすることを防ぎます。サイトチャラシンBの添加により、複数の核分裂を受けたTK6細胞が非常に大きくなります。その結果、細胞質が壊れやすくなり、KClを添加した直後に遠心分離が行われれば、凍結が起こり得る。さらに、最終的な濃度ではなく、サンプル中の細胞数に応じてサンプルにHoechstを導入することは非常に重要です。例えば、Hoechstの最終的な濃度が10 μg/mLの最終濃度は、1 x 106細胞のサンプルを均一に染色しますが、5 x 106細胞を含むサンプルを適切に染色すされず、薄暗い核を有する多くの細胞が生じる可能性があり、分析が困難になります。また、MIFCに488nmおよび/または642nm励起レーザーが装備されている場合、MIFCが405 nm励起レーザーまたはDRAQ5を装備している場合、HoechstはDAPIなどの別のDNA色素に置き換えることができることに注意することも重要です。核汚れを修正する場合は、必要な/所望のレーザーパワーに適した濃度を見つけるために染色を力付けることが重要です。

MIFC でデータを収集する場合は、グラデーション RMS フィーチャに最適な領域境界を決定することが重要です。このプロトコルで提示される境界は、MIFC計測器間のわずかな変動のために調整が必要な場合があります。データ収集中にこの機能を適用することは、高度に集中した画像を確実にキャプチャするために不可欠です。データ ファイルにぼやけた画像や焦点が合っていない画像が多数含まれている場合、解析ソフトウェアのマスキング アルゴリズムがぼやけた領域の染色アーティファクトを誤ってハイライト表示し、多数の誤検知アーティファクトが MN としてスコア付けされる可能性があります。ここで説明する画像処理技術は難しいかもしれませんが、MIFCソフトウェアで解析テンプレートを開発すると、バッチ処理によりデータファイルを自動的に分析できるため、ユーザーの介入が不要になり、スコアラーバイアス。また、TK6細胞以外の細胞株を用いてアッセイを行う場合、細胞の形態特性(例えば、サイズ)がTK6細胞のものと異なるようにマスクおよび領域境界を修正する必要がある。

ここで提示された結果(図5)は、TK6細胞をミトマイシンCおよびコルチシンの様々な用量に暴露する際のMN誘導の統計的に有意な増加を示す。溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加は、両方の化学物質で複数の用量について観察された。さらに、マンニトールの用量は30%以上の細胞毒性を誘発せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加も起用しなかった。この論文で説明するプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行い、陽性および陰性制御化学物質の両方から期待される結果を与える。MNの周波数とサイトカインシスブロック増殖指数(CBPI)の両方のベースライン値を開発するために、溶媒制御と陰性制御化学物質の両方を使用して多くの実験を行うことが非常に重要です。遺伝子毒性については、MN周波数の統計的に有意な増加は、使用される細胞タイプによく知られている必要があるベースラインMN周波数との比較によって決定される。さらに、すべての細胞毒性計算は、コントロールサンプルのCBPIに基づいているため、MONO、BNCおよびPOLY細胞のベースラインレートは、コントロールで十分に定量化されなければなりません。

MNアッセイの文脈でMIFCを使用することのいくつかの制限と利点は、前の研究29、32で説明されている。主な制限事項は、顕微鏡検査と比較した場合のMN周波数の低下に関するもので、分析ソフトウェアでスコアリング基準を実装する際の柔軟性の欠如とMIFCの被写界深度の限られた深さの両方から生じ込まれる可能性があります。十分に輪郭を描かれたマスクは、主核を正確に識別するために作成できますが、主核に触れている(または非常に近い)MNはBNCマスク内で捕捉される可能性があります。さらに、顕微鏡検査を使用してかなり簡単に採点できる非常に小さなMNは、小さなアーティファクトのスコアリングを避けるために、MNマスクの面積パラメータの下限のためにMIFCを使用する場合、おそらく誤って見逃されます。画像ベースのデータ解析の難しさに加え、その設計により、MIFCは3次元細胞物体の2次元投影画像を取得します。これにより、一部の MN は、2 つのメイン MN とは異なる深さでキャプチャされ、マスキングを使用して非常に暗く、コーザブルに見える可能性があります。さらに、MN のごく一部が 2 つの主要な核の 1 つの後ろに存在し、視覚化とスコア付けが不可能になります。したがって、これらの困難を考慮すると、低用量でMN周波数の有意な増加を解釈する際には注意が必要である。

これらの欠点にもかかわらず、ここで説明するMIFC法は、他の技術に対していくつかの利点を提供する。Fenechらは、MNアッセイ36の自動化されたシステムと方法論を開発する際に考慮すべき基準とガイドラインを提案した。これらには、主核および細胞質の直接可視化、試験対象の化学物質または薬剤の様々な用量からのMNの頻度の決定、形態を定量し、すべての位置を決定する能力が含まれるが、これらに限定されない。核とMNは、それらが細胞質内にあることを確認します。本論文は、インビトロMNアッセイを行うために開発されたMIFC法が、これらの基準を満たす(または満たす可能性を有する)ことを示す。具体的には、核とMNの画像は蛍光レーザーで捕捉することができ、細胞質画像はBF LEDを用いて得ることができる。正常な核形態を持つ細胞の画像は、高度なマスクと特徴の組み合わせを使用して、不規則な形態を持つ細胞から自動的に区別することができます。コルチシンおよびミトマイシンC(図5)に提示された結果は、溶媒対照と比較した場合、ジェノ毒性と細胞毒性の両方が様々な用量で評価され、統計的に有意なMN周波数がどこで観察されることを示しています。期待。さらに、OECD試験ガイドライン487は、細胞毒性を決定するために、テスト濃度当たり少なくとも500細胞と共に、MNの存在を評価するために、テスト濃度当たり2,000 BNCを採点することを推奨しています。これは手動顕微鏡検査を使用して1時間以上かかる場合があります。この論文のプロトコルと結果は、約6,000 BNC、16,000 MONO細胞、および800個のPOLY細胞を約20分で試験濃度当たりに捕捉し、スコア付けしたことを示している。このような短時間で得得たデータ取得の急速な速度と多数の候補細胞は、インビトロMNアッセイを実行するためにMIFCを採用するもう一つの重要な利点を強調しています。

本論文で発表された結果は励みになりますが、初期の概念実証法を代表しています。この研究は、カークランドら37で示唆されたような、複数のクラスと毒性および細胞毒性のメカニズムをカバーするより大きく、より多様な化学セットのより徹底的な調査によって続かれるべきである37しかし、時間と労働集約的であり、この論文の範囲外であるこの大規模な研究は、弱い毒性物質を確実に同定する方法の能力に関する貴重な洞察を提供する。ここで提示される方法論は、より大きな線量範囲にわたってより迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にするマイクロウェル形式にまだ小型化されていない。したがって、現在の形では、ここで提示されるMIFCベースのインビトロMNアッセイは、労働集約的なフォローアップ研究や良好な実験室の実践に関する研究に最も適している可能性があります。しかし、この方法は引き続き最適化され、検証され、細胞の割合を増加させるアヌーゲン暴露など、形態に関連する化学的特異的事象を検出する柔軟性を高める可能性を秘めています。まだコーラブルである非円形核38.最後に、MIFC法は、MN誘導のメカニズムのより包括的なビューを提供するために、MNアッセイ(例えばキネトコレ染色)に追加のバイオマーカーを導入する機会を提供する。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、本作で使用したImageStreamマルチスペクトルイメージングフローサイトメーターのメーカーであるルミネックス株式会社に採用されています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、以前の形式のデータ分析テンプレートの開発に取り組んだクリスティン・プロブスト(ルミネックス社)と、ヘイリー・パグスリー博士(ルミネックス株式会社)とフィル・モリッシー博士(ルミネックス株式会社)に感謝しています。原稿。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL遠心チューブファルコン352096
クレンザー - コールタークレンツ ベックマン・コールター8546931容器に200 mLのクレンザーを充填します。  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
Corning ボトルトップ真空フィルター MilliporeSigmaCLS4307690.22 um フィルター、500 mL ボトル
サイトカラシン BMilliporeSigma14930-96-25 mg ボトル
Debubbler - 70% IsopropanolEMD Millipore1.3704容器に 200 mL の Debubbler を充填します。  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
ジメチルスルホキシド(DMSO)ミリポアシグマ67-68-5
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水1XEMDミリポアBSS-1006-BPBS Ca++MG++フリー 
ウシ胎児血清HyCloneSH30071.03
ホルムアルデヒド 10%、メタノールフリー Ultra PurePolysciences, Inc.04018これが4%と1%のホルマリンに使用されているものです。注意:ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入および飲み込むと有毒です。 目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。 吸入や皮膚接触により感作性を引き起こす可能性があります。目に重大な損傷を与える恐れがあります。 潜在的ながんの危険性があります。 http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL 溶液
MannitolMilliporeSigma69-65-8
MEM 非必須アミノ酸 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIEMD Millipore100220405nm、488nm、642nm レーザーを搭載した 2 台のカメラ ImageStreamX Mark II を使用しました。http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC 解析ソフトウェア - IDEASEMD Millipore100220MIFC のコンパニオン ソフトウェア (ImageStreamX MKII)
MIFCソフトウェア - INSPIREEMD Millipore100220これは、MIFC(ImageStreamX MKII)
Mitomycin CMilliporeSigma50-07-7
NEAA混合物100XロンザBioWhittaker13-114E
ペニクリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液100XGibco15070063
塩化カリウム(KCl)MilliporeSigmaP9541
Rinse - 超純水または脱イオン水NA超純水または脱イオン水であれば何でも使用できます。 容器に900mLのリンスを入れます。
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1XHyCloneSH30027.01
シース - PBSEMD MilliporeBSS-1006-Bこれはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 1X Ca++MG++フリー. 容器に900mLのシースを入れます。
滅菌水HyCloneSH30529.01
器- 0.4-0.7%次亜塩素酸塩VWRJT9416-1これは、クロロックス漂白剤を水で溶出することによって作ることができる10%クロロックス漂白剤です。容器に200mLの滅菌器を入れます。
システムキャリブレーション試薬 - SpeedBeadEMD Millipore400041各チューブは~10 mLを保持します。  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25フラスコファルコン353109
T75フラスコファルコン353136
TK6細胞ミリポアシグマ95111735
NA 滅菌

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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