方法論記事

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

DOI：

10.3791/59329

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2019年6月26日

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1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、質量分析のためのHIV-1複製の存在下でのRev免疫沈殿について説明する。記載された方法は、HIV-1感染サイクルに関与するヌクレオラー因子の同定に使用することができ、研究中の経路の特徴付けのための他の疾患モデルに適用可能である。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1感染サイクルは、ウイルスの複製、包装、および放出を容易にするために、宿主因子とのウイルスタンパク質相互作用を必要とする。感染サイクルはさらに、スプライシングを調節し、ヌクレオサイトプラズム輸送を可能にするために、HIV-1 RNAを用いたウイルス/宿主タンパク質複合体の形成を必要とする。HIV-1 Revタンパク質は、イントロニックシス-作用型標的-Rev応答元素(RRE)との多層化を通じてHIV-1 mRNAの核輸出を達成する。核色の局在シグナル(NoLS)は、Revアルギニン豊富なモチーフ(ARM)のCOOH終位内に存在し、核内のRev/RRE複合体の蓄積を可能にする。核因子因子は、mRNAに依存しない核輸出およびスプライシングを媒介することに加えて、様々な他の機能を通じてHIV-1感染サイクルをサポートすると推測される。質量分析のためのHIV-1複製の存在下で、Revヌクレオラー変異(欠失および単一点Rev-NoLS変異)と比較して、野生型(WT)Revの免疫沈殿法について述べるとよ。ヌクレオ細胞性輸送に関与するヌクレオロール因子(ヌクレオホスミンB23およびヌクレオリンC23)ならびに細胞スプライシング因子は、Rev-NoLS変異の存在下でRevとの相互作用を失う。snoRNA C/Dボックス58のような様々な他の核因子は、Rev変異との相互作用を失うことが同定されるが、HIV-1複製サイクルにおけるその機能は未知のままである。ここで提示された結果は、HIV-1感染サイクルを維持するウイルス/宿主ヌクレオロール因子の同定にこのアプローチを使用することを示す。このアプローチで使用される概念は、研究中の経路の特性を必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

核は、ウイルス複製に必要な様々な細胞宿主およびウイルス因子の相互作用場として仮定される。核は3つの異なったコンパートメントに細分される複雑な構造である:フィブリラコンパートメント、密な線維のコンパートメントおよび粒状コンパートメント。HIV-1 Revタンパク質は、粒状コンパートメント内で特異的に局所化します。ただし、このローカリゼーション パターンの理由は不明です。NoLS配列(Rev突然変異4、5、および6)内に単一点突然変異が存在する場合、Revは核パターンを維持し、以前にHIV-1HXB2複製を救出することが示されているが、WT Rev 1と比較して効率が低下した。.すべての単一点突然変異は、HIV-1NL4-3感染サイクルを維持することができません。NoLS配列内の複数の単一点突然変異(Rev-NoLS突然変異2および9)の存在下で、Revは核および細胞質全体に分散することが観察され、HIV-1HXB2複製1を救出することができませんでした。このプロテオミクス研究の目的は、Rev媒介性HIV-1感染経路に関与するヌクレオラーおよび非ヌクレオロール細胞因子を解読することです。Rev免疫沈殿条件は、ヌクレオラーB23リンタンパク質との相互作用を通じて最適化され、以前にヌクレオラー変異の存在下でRevとの相互作用を失うことが示されている。

Rev細胞因子は、過去に広範囲に研究されています。しかし、これはウイルス病因の不在で行われている。特に、HIV-1複製中のRev相互作用を介して本研究で特徴付けられた1つのタンパク質は、両生類2、3、両生類におけるヌクレオホスミン(NPM)、ヌマトリン、またはNO38とも呼ばれるヌクレオホスミンB23である。4.B23は、3つのアイソフォーム(NPM1、NPM2、およびNPM3)として表される- 核核ホスミン/核オプラスミン核シャペロンファミリー5、6の全メンバー。NPM1分子シャペロンは、ヌクレオソームの適切な組み立てにおいて、クロマチン高次構造7、8に関与するタンパク質/核酸複合体の形成において、および凝集の防止において機能し、N末端コアドメインを介した標的タンパク質の誤折(残渣1-120)9.NPM1機能は、核と細胞質間のプリリボソーム粒子の輸送を通じてリボソーム発生にまで及び、内部転写スペーサー配列におけるプリリボソームRNAの処理12,13,リボソームアセンブリ14,15の間にタンパク質の核凝集を逮捕する.NPM1は、アポトーシス16の阻害および腫瘍抑制剤ARF 17、18およびp5319の安定化に関与し、発生因子および腫瘍抑制剤としての二重の役割を明らかにする。NPM1は、ゲノム安定性、セントロソーム複製、転写の細胞活動に関与する。NPM1は、細胞周期間相中のヌクレオリ、有人化時の染色体周辺、および有分裂の終わりに核前核体(PNB)に見出される。NPM2およびNPM3は、悪性腫瘍20の間に発現レベルの変化を受けるNPM1ほどよく研究されていない。

NPM1は、内部ファミコンおよびNLS 9、21を介した様々な核/核系タンパク質の核細胞質シャトルに記載されており、HIV-1タットおよびRevタンパク質の核輸入を促進することが以前に報告されている。B23-結合ドメイン-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在下で、タットは細胞質内で誤局在化し、トランス活性化活性を失う。これはB232のためのタットの強い親和性を示す。別の研究は、RRE含有mRNAの不在でRev/B23安定複合体を確立した。RRE mRNAの存在下で、RevはB23から解離し、好ましくはHIV RREに結合し、B2322の変位を引き起こす。核レベルでは、HIV mRNAに対するB23のタットトランス活性化およびRev交換プロセスがどこで起こるかは不明である。両方のタンパク質は、B23相互作用を介して同時に核に入ると仮定される。HIV核経路における他の宿主細胞タンパク質の関与が期待される。このプロテオミクス調査に記載されている方法は、HIV-1病因の間に関与する宿主細胞因子との核の相互作用を解明するのに役立つ。

プロテオミクス調査は、HIV-1HXB2産生に対するRev NoLS単点変異(M4、M5、およびM6)および複数のアルギニン置換(M2およびM9)の発現を通じて開始された。このモデルでは、Rev欠損HIV-1HXB2(HLfB)を安定的に発現するHeLa細胞株を、3'末端にフラグタグを含むWT RevおよびRevヌクレオラー変異でトランスフェクトする。WT Revの存在は、Rev欠乏症(M2およびM9)を救済しないRev-NoLS変異と比較して、HLfB培養においてウイルス複製が起こることを可能にする、またはウイルス複製がWT Rev(M4、M5、およびM6)1ほど効率的に起こらないことを可能にする。細胞リサートは、Rev発現の存在下でウイルス増殖後48時間後に収集され、Rev/B23相互作用用に最適化されたリシスバッファーを用いて免疫沈殿を行った。様々な塩濃度を用いた溶解バッファー最適化について説明し、HIV-1 Revのタンパク質溶出方法を銀染色またはクマシー染色SDS-PAGEゲルで比較・分析する。最初のプロテオミクスアプローチは、タンデム質量分析による発現WT Rev、M2、M6、およびM9からの放出サンプルの直接分析を含む。WT Rev、M4、M5、およびM6の溶出をゲル抽出プロセスを受けた第2のアプローチを、第1のアプローチと比較する。WT Revと比較してRev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率を表示する。これらのアプローチは、HIV-1 mRNA輸送およびHIV-1複製中のRevとのスプライシングに関与する潜在的な因子(ヌクレオールおよび非ヌクレオラー)を明らかにする。全体的に、記載された細胞溶解、IP、および溶出条件は、感染経路を活性化および調節する宿主細胞因子の理解のために目的とするウイルスタンパク質に適用可能である。これは、様々な疾患モデルの持続性に必要な細胞宿主因子の研究にも適用可能である。このプロテオミクスモデルでは、HIV-1 Rev IPは、核細胞質シャトル活性およびHIV-1 mRNA結合に関与するヌクレオロール因子を解明するためにB23相互作用用に最適化されています。さらに、目的の主要タンパク質に欠乏している感染症モデルを安定的に発現する細胞株は、HLfB細胞株と同様に、目的とする感染経路を研究するために開発することができる。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞培養

  1. 10%の胎児ウシ血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、および1mMのピルビン酸ナトリウムを組織培養処理100mmプレート内で補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でHLfBを維持する。5%CO2で供給される加湿インキュベーターで37 °Cで細胞培養物を保つ。1 x 106細胞/mLの細胞密度への通過コンフルエント細胞。
  2. 細胞培養培養培養を破棄します。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の10 mLで細胞を穏やかにすすいですすいで下します。セル層を中断することなく、1x PBSを取り外して破棄します。
  3. 細胞に1xトリプシン-EDTA溶液の2 mLを追加します。単層をコーティングし、加湿室内で37°Cでインキュベートする皿を5分間ロックします。
  4. 手のひらで皿の側面をしっかりとタップし、細胞を取り外します。切り離された細胞を8mLの新鮮培養培養培養に再停止させる。細胞を400 x gで5分間回転させます。
  5. 細胞ペレットを破壊することなく培養培養培養を廃棄する。細胞ペレットを10mLの新鮮培養培養培養に再ステープルする。組織培養処理100mmプレート内の新鮮な培養培地の9 mLを用いた濃縮細胞のサブ培養1mL。
    注:Rev-NoLS変異のたびに、3x 100 mm HLfBまたはHeLa培養プレートは、ウェスタンブロット分析および質量分析に十分なタンパク質リザートを得ます。WT Rev 正のコントロールと負のコントロール用に余分なプレートを追加します。サブ培養細胞量は、異なる細胞タイプを使用して最適化を必要とします。

2. HIV-1複製中のRev-NoLS-3'フラグ変異の発現

  1. HLfB細胞培養を2 x 106細胞/mLの細胞密度に増殖させる。100mmプレート毎にリン酸カルシウム-DNA懸濁液を以下のように4mLずつ調製する。
    1. 2 本の 15 mL チューブに 1 と 2 のラベルを付けます。2x HBSの2 mL(0.05 M HEPES、0.28 M NaCl、および1.5 mM Na2HPO4 [pH 7.12])をチューブ1に追加します。TE 79/10 (1 mM トリス-HCl および 0.1 mM EDTA [pH 7.9]) をチューブ 2 に追加します。TE 79/10 の体積は 1.760 mL - DNA の体積です。
    2. チューブ2に目的のRev-NoLs-3'フラグ変異を含むプラスミドの20 μgを追加し、その内容を再懸濁液を介して混合します。チューブ2に2M CaCl2の240 μLを追加し、再び再び再び混合します。
    3. チューブ2の混合物をチューブ1滴回りに移し、穏やかに混合する。サスペンションが30分間室温で座るようにします。
  2. 3セル培養のそれぞれに1mLの懸濁液を滴下し、100mmプレートを加えながら、メディアを穏やかに旋回させる。プレートをインキュベーターに戻し、トランスフェクション混合物を6時間放置し、トランスフェクション混合物を10mLの新鮮な培養培養培養物で置き換え、細胞を42時間インキュベートする。

3. ウイルスタンパク質リサートの採取

  1. 細胞媒体48hポストトランスフェクションを廃棄する。各100mmプレートを氷のベッドの上に置きます。Rev-NoLS変異サンプルごとに15 mLチューブにラベルを付け、チューブを氷の上に置きます。
  2. 細胞層を破壊することなく、10mLの1x PBSで細胞を静かにすすいで下す。1x PBS を破棄します。3 mLのリシスバッファー(50 mMトリス-HCl[pH 8.0]、137mM NaCl、および1%X-100洗剤[材料の表を参照])を追加し、プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理し、各100mmプレートに。
  3. セルスクレーパーを使用して、セル層を破壊します。プレートを傾け、そっとこすり、プールに細胞を集めます。1,000 μLマイクロピペットを使用して細胞リサートを収集し、あらかじめ標識された15 mLチューブ内の3つの100mmプレートのそれぞれから細胞のライサットを混合します。
  4. 氷上で細胞を15分間インキュベートし、5分ごとに15,000 x gで細胞を渦動かします。
  5. 細胞破片ペレットを破壊することなくタンパク質上清を収集し、別の無菌15 mLチューブに移します。ブラッドフォード法を用いてウイルスタンパク質リサート濃度を得る(セクション4参照)。
  6. 西洋の免疫ブロット分析のために入力サンプル(20 μg)のアリコートを保存します。2xサンプルバッファー(20%グリセロール、0.02%ブロムフェノールブルー、125mMトリス-Cl[pH 6.8]、5%SDS、および10%2-メルカプトエタノール)を最終容積に加えます。95°Cで10分間沸騰させ、-20°Cで入力サンプルを保存します。

4. ブラッドフォードアッセイ

注:タンパク質標準曲線を生成する前に、100x BSAストックから10xウシ血清アルブミン(BSA)を調調します。

  1. 以下のブランクと標準のためのマイクロ遠心管にアリコート水: ブランク = 800 μL;標準 1 = 2 mg/mL、 798 μL;標準 2 = 4 mg/mL、 796 μL;標準 3 = 6 mg/mL、 794 μL;標準 4 = 8 mg/mL、 792 μL;標準 5 = 10 mg/mL、 790 μL. アリコット 10x BSA を次の指定規格に: 標準 1 = 2 μL;標準 2 = 4 μL;標準 3 = 6 μL;標準 4 = 8 μL;標準 5 = 10 μL。
  2. 795 μLの水と5μLのタンパク質サンプルを混合して、タンパク質サンプルの混合物を調質します。各ブランク、標準、タンパク質サンプルに200 μLのタンパク質アッセイ染料試料(材料表を参照)を追加します。サンプルを均一な混合物のために短時間渦を起し、室温(18~20°C)で5分間インキュベートします。
  3. ブランク、スタンダード、タンパク質のサンプルをキュベットに転送します。595 nmのODでタンパク質濃度を測定します。

5. Rev-NoLS-3'フラグのコイノチノ沈殿

  1. M2アフィニティゲルビーズのリンス25 μL(材料表参照)を500μLのリシスバッファーで、プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理した。すべての変異サンプルおよびコントロールに対してより多くの親和性ゲルビーズをすすいでください。
    注:2つのゲル(50μL)のための十分なM2アフィニティゲルビーズを準備する - 1つは西洋免疫ブロット分析用、もう1つはタンパク質染色および質量分析用です。
  2. 820 x gで2分間4°Cでスピンします。上清を取り除く。2倍以上のリンス。
  3. ウイルスタンパク質リザート(総体積5mLで1mg/mL)を前文M2アフィニティビーズに添加する。リシスバッファを使用して総体積を調整します。
  4. 反応を3時間インキュベートし、4°Cで回転させる。遠心分離機M2親和性ビーズ/ウイルスタンパク質は1分間820 x gでリサートする。
  5. 上清を収集し、西洋の免疫ブロット分析のためのポストIPサンプル(20 μg)のアリコートを保存します。ポストIPリサートのタンパク質濃度を測定します。西洋免疫ブロッティングのために20 μgを収集します。
  6. 最終ボリュームに 2x サンプル バッファを追加します。95°Cで10分間沸騰させ、-20°CでポストIPサンプルを保存します。
  7. 750 μLのリシスバッファーでM2ビーズをすすいで、4°Cの回転子でビーズを5分間洗い、M2ビーズを820xgで5分間洗い、上清を捨てます。
  8. 5.7の手順を繰り返し、4°Cの回転子でさらに2回の洗浄を5分間行います。3回目の洗浄後、長いゲルローディングチップを使用してM2ビーズ/co-IP複合体からリシスバッファーの痕跡を取り除きます。
    注:リシスバッファーの微量を除去する前に、ゲルローディング先端の端を平らなピンセットでつまみます。これにより、M2ビーズの破壊と取り込みが防止されます。
  9. M2ビーズを2倍のローディングバッファの55 μLで再中断します。サンプルを95°Cで10分間沸騰させます。
  10. 2つの別々のSDS-PAGEゲル(1つのゲルは西洋免疫ブロッティング用、もう1つのゲルはクーマッシー染色用)に溶出します。

6. SDS-PAGEゲルの調製

  1. 50 mLチューブに以下の試薬を混合して15%SDS-アクリルアミド溶解ゲルを2個投動(最終容積40mL、4ゲル分):4.16mL、アクリルアミド15mL:ビサクリアミド(29:1)、10mLの1.5ML(8.M.8)。、10% SDS の 400 μL、10% ペルサルフェートアンモニウムの 400 μL、および TEMED の 40 μL。
  2. 50mLチューブを数回反転して溶出ゲルを混ぜます。溶像ゲル混合物を、あらかじめ洗浄された西洋ゲル装置(4つのゲル-西洋免疫ブロッティング用3個、クーマッシー/銀染色用1個)にピペットする。
  3. ゲル混合物の最上層をカバーするのに十分な水を穏やかにピペット。溶解ゲルを重合させる。
  4. 余分な水を吸収するために、繊細なタスクワイパー(材料の表を参照)を使用して、溶解ゲルから水層を注ぎます。
  5. 50 mLチューブに以下の試薬を混合して2つの5%SDS-アクリルアミドスタッキングゲルを鋳造(最終容積20mL、4ゲル分):11.88mL、40%アクリルアミドの2.5mL:ビサクリアミド(29:1)、5.2mL(1M.8)の5.2mL、10% SDS の 200 μL、10% ペルサルフェートアンモニウムの 200 μL、および TEMED の 20 μL。
  6. 50 mLチューブを数回反転して積み重ねゲルを混ぜます。溶像ゲルの上の積み重ねゲル混合物を装置の上部にピペットする。
  7. 適切な数のレーンを含むゲルカセット櫛を積み重ねゲルに入します。繊細なタスクワイパーを使用してゲル混合物のオーバーフローを吸収します(材料の表を参照)。積み重ねゲルが完全に重合することを許可します。
  8. 1xウェスタンランニングバッファー(5x濃度:250 mMトリス-Cl[pH 8.3]、1.92 Mグリシン、0.5%SDS、および10mM EDTA)でウェスタンゲル装置をフラッディングします。
  9. 積み重ねゲルからゲルカセット櫛をそっと引っ張ります。1x西部のランニングバッファが荷重ウェルを埋めることを許可します。サンプルをロードする前に注射器を使用して、1xウェスタンランニングバッファで各ウェルをフラッシュします。
  10. ウェスタン免疫ブロットサンプルを各対応ゲル(入力サンプル、共免疫沈殿サンプル、およびポストIPサンプル)にロードします。西洋ゲルタンパク質マーカーをロードします。
  11. クーマッシー/銀染色用の共免疫沈殿サンプルを別のゲルにロードします。西洋ゲルタンパク質マーカーをロードします。
  12. ランニングゲル装置を電源に接続し、ローディング色素が溶出ゲルに達するまでゲルを100Vで動かします。荷重色素が溶出ゲルの底に達するまで電圧を140Vに上げる。

7. ウェスタンブロット転送

  1. 西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。
  2. 溶解ゲルをウェスタントランスファーバッファー(25 mMトリス、194mMグリシン、0.005%SDS、20%メタノール)で満たされたきれいなトレイにそっと移し、15分間浸します。
  3. ゲル転写装置を以下のように組み立てる。
    1. PVDF転写膜3枚とフィルターペーパー6枚(材料表参照)を溶出ゲルの大きさに切ります。
    2. PVDF膜をメタノールに5分間浸し、5分間水に水を入れ、使用する準備ができるまでPVDF膜を西部転写バッファーに入れます。
    3. ゲルホルダーカセットを、西側の転送バッファーで部分的に充填されたガラスベーキングトレイに入れ、下部に黒い面を置きます。
    4. ゲルホルダーカセットの黒い側面に対して西洋の転送バッファで浸した泡パッドを置きます。
    5. 西洋の転送バッファにフィルターペーパーを濡らし、泡パッドの上に置きます。溶解ゲルをフィルターペーパーの上に置きます。
      注:PVDF膜に転送する正しいローディング方向に溶溶解ゲルを配置します。
    6. 溶解ゲルの上に1つのPVDF転写膜を置きます。西洋の転写バッファーでフィルターペーパーを濡らし、PVDF転写膜の上に置きます。
    7. フィルターペーパーの上に西洋の転送バッファを浸した別の泡パッドを置きます。ジェルホルダーカセットの白い側面を、浸した泡パッドの上に慎重に折りたたみます。カセットをしっかりとロックします。
    8. ゲルホルダーカセットを転写装置電極アセンブリに入れておきます。残りの溶解ゲルごとに手順 7.3.4-7.3.8 を繰り返します。
    9. 転送装置タンクをウェスタン転送バッファで充填します。攪拌棒を装置タンクに入れます。
    10. 装置タンクを攪拌プレートの上に置きます。攪拌の設定を5-6に調整し、攪拌バーが立ち往生したり、ゲルホルダーカセットに当たっていないことを確認します。
    11. ゲル転写装置を電源に接続し、100Vで1時間4°Cでゲルを移します。

8. 免疫ブロッティング

  1. ゲルホルダーカセットを取り外し、黒い側面をきれいなガラスベーキングトレイに当てはめます。カセットを開き、泡パッドとフィルターペーパーを慎重に捨てます。PVDF膜の角にマークを付け、正しい荷重方向を特定します。膜を濡らしておいてください。
    注:PVDF膜は空気乾燥され、きれいな密閉容器に貯えることができる。ステップ7.3.2を繰り返すことによって膜を水分補給する。
  2. 膜を100mLの遮断液(5%ミルク、1x TBS、および0.1%のツイエン20)に入れます。室温(18~20°C)で1時間の緩やかな揺れで膜を遮断します。
  3. 25 kDaタンパク質マーカーの上の膜を横切って切断します。膜の上部を、25kDaより大きいタンパク質バンドを含む、B23マウスモノクローナルIgG 1(1:500希釈)を含む遮断溶液中に配置する。一晩ブロックし、4°Cで揺れる。
  4. 膜の底部を、25kDaより小さいタンパク質バンドを含む、M2マウスモノクローナルIgG1を含む遮断溶液中に置く(1:1,000希釈、材料の表を参照)。一晩ブロックし、4°Cで揺れる。
  5. ウエスタンウォッシュ溶液(1x TBS、0.1%ツイエン20)の25mLで10分間膜3xを10分間洗浄します。
  6. ヤギの抗マウスIgG 1-HRP(1:5,000希釈)で膜を内温で1時間のブロッキング溶液で定熱します。ロッキングプラットフォーム上の西洋洗浄液の25 mLで10分間膜3xを洗浄します。
  7. 化学発光ウエスタンブロッティング基板を調作する。p1000マイクロピペットを使用して、基板を膜に追加します。
  8. 化学発光ウエスタンブロッティング基板で各膜を5分間開発し、基板から膜を取り除きます。繊細なタスクワイパーを使用して余分な基板を吸収します(材料の表を参照)。
  9. カセットの内側にテープで留めたクリーンシートプロテクターに膜を置きます。暗い部屋にカセットを取り、カセットにフィルムの1枚を置きます。カセットを所定の位置にロックし、5~15分間インキュベートします。

9. クーマッシー染色

  1. 西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。溶真量ゲルを25mLの超純水で満たされたきれいなトレイにゆっくりと移します。
  2. ロッキングプラットフォーム上でゲルを15分間インキュベートし、穏やかな揺れでゲルが壊れないようにします。超純水を捨て、洗浄工程を2倍以上繰り返します。
    注:SDS気泡が洗浄工程後に残っている場合、ゲルは一晩超純水で洗浄することができます。残留SDSは、ゲルの高いバックグラウンド染色を引き起こす可能性があります。
  3. ボトルを反転してクーマッシー染色試薬を混ぜます(材料の表を参照)。100 mLのクーマッシー染色試薬を置き、溶解ゲルを覆い、1時間のロッキングプラットフォーム上でゲルをインキュベートし、クーマッシー染色試薬を捨て、15分間ロッキングプラットフォーム上の脱イオン水でゲルを洗います。
  4. 脱イオン水を捨てる。洗浄工程を2倍以上繰り返します。タンパク質バンドの所望の分解能が観察されるまでゲルを洗浄し続けます。

10. 銀染色

  1. 西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。溶真量ゲルを25mLの超純水で満たされたきれいなトレイにゆっくりと移します。
  2. ロッキングプラットフォーム上でゲルを15分間インキュベートし、穏やかな揺れでゲルが壊れないようにします。超純水を捨て、洗浄工程を2倍以上繰り返します。
    注:SDS気泡が洗浄工程後に残っている場合、ゲルは一晩超純水で洗浄することができます。残留SDSは、ゲルの高いバックグラウンド染色を引き起こす可能性があります。
  3. 30%エタノール:10%酢酸溶液(6:3:1水:エタノール:酢酸)で一晩室温でゲルを固定します。10%エタノール溶液で10%のエタノール溶液で5分間室温で洗浄します。エタノール溶液を交換し、さらに5分間洗浄します。
  4. ピアスシルバーステインキットから500部の超純水(50μLの超純水で50μLの感作剤)を混合して、ピアスシルバーステインキットから感作剤加工液を調製します。感性作動液中の溶剤を1分間インキュベートし、ゲルを超純水で1分間洗浄し、水を交換し、再度1分間洗浄します。
  5. 50部の銀染色(25mLの銀染色でエンハンサーの500 μL)と一部の銀染色エンハンサーを混合して汚れ作業液を調製します。染色作業液中のゲルを30分間インキュベートします。
  6. 1部銀染色エンハンサーと50部銀染色開発者(25mLの開発者を含むエンハンサーの500 μL)を混合して、開発者の作業ソリューションを準備します。停止溶液として5%酢酸溶液を調出す。ゲルを超純水で1分間洗い、水を交換し、さらに1分間ゲルを洗います。
  7. 水を開発者の作業溶液に置き換え、所望のタンパク質バンド強度が解決されるまでインキュベートします(5分)。開発者の作業ソリューションをストップソリューションに置き換え、10分間インキュベートします。

11. インゲル還元、アルキル化、クマシー染色ゲルバンドの消化

  1. きれいなかみそり刃を使用してゲルバンドをカットします。各ゲルバンドを約5mmの立方体に切り、きれいな0.5 mLマイクロ遠心管に入れます。
  2. ゲル片を1:1アセトニトリルで100mMの重炭酸アンモニウムで覆って汚し、室温で15分間水を下します。この手順を繰り返します。
  3. ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。乾燥したゲル片を10mMのジチオスレイトールで10mMの重炭酸アンモニウムで覆い、56°Cで1時間インキュベートしてタンパク質を減らします。
  4. 上清を切り落とすピペット。100mMのヨウドアセタミドでゲル片を水で覆い、暗闇の中で室温で1時間インキュベートしてタンパク質をアルキル化します。
  5. 上清を取り除き、アセトニトリルで覆い、室温で15分間ゆっくりと振ってゲル片を細かくし、重炭酸アンモニウムで覆って振ることでゲル片を再膨大にする。室温で15分間ゆっくりとお待ちください。
  6. 手順 11.5 を繰り返します。ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。
  7. ゲル片を50ng/μLシーケンシンググレードで覆い、重炭酸アンモニウム100mでリプシン(材料の表を参照)を変更します。ゲルが5分間膨るのを許可します。その後、残りの溶液をピペットオフします。ゲル片を100mMの重炭酸アンモニウムで覆い、完全に再膨大にし、ゲル片が完全に覆われているように100mMの重炭酸アンモニウムを追加します。
  8. ゲル片を37°Cで一晩インキュベートします。水に10%ギ酸の体積の1/10を加えて反応を停止します。各チューブから上清を収集します。
  9. 60%のアセトニトリルで1%のギ酸で覆い、穏やかな振りで15分間インキュベートすることによってゲル片を抽出します。
  10. 真空遠心分離機で結合した上清の体積を20μL未満に減らし、上清を完全に乾燥させないように注意してください。1%のギ酸を加えて総体積を20μLに戻します。

12. 液体クロマトグラフィー/質量分析

注:サンプルは、超HPLC、ナノスプレー源、およびカラムを備えた質量分析計を用いて分析した(材料の表を参照)。溶媒AとBは、それぞれ水中のギ酸とアセトニトリルで0.1%である。

  1. 消化されたタンパク質を高回収ポリプロピレンオートサンプラーバイアルにロードします。バイアルをUPLCシステムのサンプルマネージャにロードします。
  2. 各サンプルに6 μLを注入します。各サンプルをナノタイルのトラッピングカラムに8 μL/minで1.5分間ロードし、99%溶媒A/1%溶媒Bを使用します。
  3. ペプチドを30分間にわたって溶媒Bの3%から35%の線形勾配で質量分析計に溶出し、次いで溶媒Bの35%から50%、溶媒Bの50%から90%を1分間にわたって3分間維持する。次に、%B を 5 分以上で 3% に戻します。
  4. 正イオンプロファイル質量スペックデータを解像度(20,000解像度)モードで取得します。0.6秒ごとに1回のスキャンの割合で100~2,000 Daのデータを取得し、衝突エネルギーのないスキャンと高い衝突エネルギーでスキャンすることで、MSEモードでデータを取得します。
  5. 上昇した衝突エネルギーの場合、Trapセル内の衝突エネルギーを15Vから40Vにランプし、ロック質量として[Glu 1]-フィブリノペプチドBの+2イオンを使用して、30秒ごとにロックマススキャンを取得します。溶媒Aのブランク注入を用いてデータファイルを取得し、各サンプルのペア間で同じ取得方法を使用して持ち越しを制御する。

13. 質量分析のためのデータ分析

  1. 質量分析結果ファイルを、定量的および定性的なプロテオミクス研究プラットフォーム(ProteinLynxグローバルサーバ)を実行しているコンピュータにコピーします。データ分析は CPU を集中的に使用するため、別の高性能データ分析コンピュータで実行する必要があります。
  2. データの新しいプロジェクトを作成します。オートサンプラープレートを表す新しいマイクロティタープレートを作成します。サンプルをマイクロティタープレート内の同じ位置にオートサンプラー内の位置に割り当てます。
  3. 各サンプル処理パラメータを割り当てます。使用するパラメータは、自動クロマトグラフィーピーク幅とMSTOF解像度です。低エネルギー閾値、100カウント。上昇したエネルギー閾値、5カウント;強度しきい値、500 カウント。
  4. 各サンプル ワークフロー パラメータを割り当てます。使用するパラメータは、データベース、連結人間のSwissProtとHIV、逆のシーケンスです。自動ペプチドおよびフラグメント耐性;分フラグメントイオンはペプチド当たり一致します, 3;分断片イオンはタンパク質当たり一致します, 7;分ペプチドはタンパク質当たり一致します, 1;一次消化薬, トリプシン;欠落した切断, 1;固定修飾剤試薬、カルバミドメチルC;可変修飾剤試薬、酸化M;偽の発見率、100。
  5. サンプルを選択し、[最新の生データを処理]を選択します。検索が完了したら、サンプルを選択し、[データをスキャフォールドにエクスポート]を選択します (バージョン 3)。スキャフォールドを開き、新しいファイルを作成し、前駆体イオン定量を使用して新しいバイオサンプルとしてプロテオミクスプラットフォームからエクスポートされた各ファイルをインポートします。
  6. すべてのファイルがインポートされた場合は、[データの読み込みと分析]画面に進みます。LFDR スコアリングと標準的な実験全体のタンパク質グループ化を使用して、検索データとインポートデータに使用するのと同じデータベースを選択します。表示オプションをタンパク質同定確率、タンパク質閾値を20%、ペプチドの最小数を1に、ペプチド閾値を分析中に0%に設定します。

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結果

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様々な細胞下局在パターンに対応するRev-NoLSの単一および多点アルギニン変異は、WT Rev.WT Rev-3'フラグおよびp cDNA-flagと比較して細胞宿主因子と相互作用する能力において検討された。ベクターはHLfB培養において発現した。タンパク質複合体を全細胞リサートから処理し、銀染色試薬で染色した。Rev-NoLS-3'フラグは、図1のNaCl(137 mM、200mM、および300mM)の様々な濃度を含む3つの異なるライシスバッファー条件で検出可能(約18 kDa)である。B23は、低塩濃度(137mM、レーン2~4)を含むリシスバッファー中で検出可能(37kDa)、200mM NaClを含むリシスバッファーでほとんど検出できず、高塩濃度(300mM NaCl)を含むリシスバッファーでは検出不能であった。図2では、WT Rev-3'フラグ、Rev-NoLS M1-3'フラグ、およびpcDNA-フラグベクターがHLfB培養で発現した。タンパク質錯誤は、2つのリシスバッ...

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ディスカッション

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HIV-1の存在下でRev-NoLS変異とWT Revを比較した質量分析は、ウイルス複製サイクルに関与するヌクレオロール因子を理解するために評価された。これは、ウイルス感染に必要なヌクレオラー成分を同定するであろう。ヌクレオラーB23はRev-NoLSに対して高い親和性を有し、Rev3およびRev結合HIV mRNA22のヌクレオ細胞局在化における機能を有する。単一または複数のアルギニン置換を含むRev-NoLS変異を有するB23の親和性は、ウイルス産生中のRev-3'フラグの免疫沈殿を通じて評価された(図2;WTおよび突然変異M2、M6、およびM9)。単一点Rev-NoLS変異M4、M5、およびM6に対するB23親和性は、HIV-1複製の存在下で以前に調べられた。前の研究では、M4、M5、およびM6のIP溶出剤を、RevおよびB23親和性1に対するαフラグに特異的な抗体を用いてウェスタン免疫ブロッティングを行った。Revシングルポイン...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、国立衛生研究所(NIH)エイズ研究・参照試薬プログラム、エイズ部門、国立アレルギー・感染症研究所が提供するHLfB付着培養のためのバーバラ・K・フェルバー博士とジョージ・N・パヴラキス博士を認めます。病気 (NIAID), NIH.著者らはまた、NIH、助成金AI042552とAI029329によって提供される財政源を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸フィッシャーケミカルA38S-212
トニトリルフィッシャーケミカルA955-500
アミド:ビサアクリルアミドBioRad1610158
重炭酸アンモニウムッシャーケミカルA643-500
過硫酸アンモニウムSigma-Aldrich7727-54-0
フラグM2アフィニティーゲルSigma-AldrichA2220
抗フラグ M2 マウスモノクローナル IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS フィルムCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye 試薬濃縮液、450 mLバイオ・ラッド5000006
B23 マウスモノクローナル IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
ブロモフェノールブルーSigma-AldrichB0126
カーネーション 無脂肪粉ミルクネスレN/A
セルスクレーパーサーモフィッシャーサイエンティフィック179693PK
C18IonKey nanoTile カラムウォーターズ 186003763
コーニング 100mm TC処理培養皿フィッシャーサイエンティフィック08-772-22
ジチオスレイトールサーモ科学J1539714
1 x DPBSコーニング21-030-CVRS
ECL エステルンブロッティング基質Pierce32106
エタノール、200プルーフフィッシャーケミカルA409-4
FBSギブコ16000044
ギフィッシャーケミカルA117-50
GelCode ブルーステイン試薬サーモフィッシャー24590
グリセロールフィッシャーケミカル56-81-5
ヤギ抗マウスIgG-HRPサンタクルーズバイオテクノロジーsc-2005
ドアセトアミドACROS有機122270050
KimWipe繊細なタスクワイパーキンバリークラークプロフェッショナル34120
L-グルタミンGibco
メタノールフィッシャーケミカル67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15 mL ポリプロピレンコニカルチューブFalcon352097
Prestained Protein Ladder、10 to 180 kDaThermo Scientific26616
プロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ4693132001
精製BSAニューイングランドバイオラボB9001
PVDF ウェスタンブロッティングメンブレンロシュ3010040001
ピルビン酸ナトリウムGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 洗剤溶液BioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
トリプシン-EDTA, Corning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt, G2, 質量分析計Waters,N/A
Whatman, 濾紙Tisch Scientific10427813
アセアクリルフィアンチ酸 ヨー25030081, , , , , , ,

参考文献

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