生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

Summary

このプロトコルは、臓器構造に変化を起さずにリンパ節を排出する異なる細胞集団を画像化する技術を説明する。

Abstract

リンパ節(LN)は体内に広がる器官であり、自然免疫応答が適応免疫とつながる。実際、LNはリンパ管の経路に戦略的に介入され、LN内のすべての常駐免疫細胞と組織抗原との親密な接触を可能にする。したがって、ex vivo全体LNイメージングを用いて細胞組成、分布、位置および相互作用を理解することは、身体が局所的および全身性免疫応答をどのように調整するかに関する知識を追加する。このプロトコルは、従来の共焦点顕微鏡およびストック試薬を用いて非常に再現性が高く、実行しやすい方法論を可能にする蛍光標識抗体の生体内投与に続くex vivoイメージング戦略を示す。抗体の皮下注射を通じて、従来の免疫蛍光顕微鏡技術によって損傷を受ける可能性のある組織構造に影響を与えることなく、RNを排出する異なる細胞集団に標識することができる。

Introduction

リンパ節(LN)は、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする重要な機能を持つ全身に広く存在する卵形の器官である。LNは、それらに対する免疫応答をマウントするために異物粒子および癌細胞を同定するためにリンパを濾過する1.抗原提示細胞(APC)、T細胞およびB細胞は、抗原特異的抗体(体液性免疫)および細胞傷害性リンパ球(細胞性免疫)を生成するために一緒に働き、外来粒子および癌細胞2を排除する。したがって、リンパ系に存在する免疫細胞のダイナミクスを理解することは、ワクチン開発とがん免疫療法に重要な意味を持つであろう。

新しい共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡を含む強力な顕微鏡の出現は、異なる免疫細胞集団が彼らのネイティブ環境でどのように振る舞うかを理解する上で並外れた進歩を可能にしました3。特定の標的4、5の制御下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスとのプローブの組み合わせを用いて、複数の同時細胞サブタイプを画像化することが可能となった。実際、質量サイトメトリーやマルチパラメトリックフロー解析などの高次元技術は、健康と疾患における異なる免疫細胞の区画化と機能性に関する知識を拡大するために重要

Protocol

このプロトコルは、ハーバード大学医学部とブリガム・アンド・ウィメンズ病院の動物常任委員会(プロトコル2016N000230)によって承認されました。

1. 実験に使用したマウス

1. 抗体ミックスを投与するためにB6の背景に8週齢の雄および雌マウスを使用する。
2. CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WTマウスを使用して、抗体ミックスを投与せずにレポーターマウスにもex vivo全体LNイメージングを適用できるかどうかを判断し、抗原提示を含む単核細胞の存在を調べることができます。細胞および咽頭細胞、およびLNにおけるその分布。
   注:CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WTレポーターマウスは、それぞれCX3CR1およびCCR2プロモーターの制御下に挿入された緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(RFP)を有する。レポーターマウスは、抗体ミックスの注射の有無にかかわらず使用することができる。レポーターマウスにおける抗体ミックス注射については、リファレンス4を参照してください。抗体が注入されない場合は、手術に進みます。

2. 抗体ミックス製剤および注射

注: 手順 1.1....

Results

この原稿は、これらの器官の特定の細胞集団を染色するために蛍光標識抗体を注入した後、その構造を損傷することなく鼠径およびポピライトリンパ節を除去する技術を示しています(図1および図2)).

BV421抗CD4およびBB515抗CD19および共焦点イメージング解析を用いたLN細胞の免疫標識の強力な組み合わせは、鼠径およびポピュライトLNにおけるT細胞(CD4+)およびB細胞(CD19+)の局在を定義した。両器官において、B細胞卵胞はT細胞集団(図3、図4およびビデオ1)に囲まれ、LN^構造1の特徴である。リンパ洞を覆う食細胞が注入された蛍光抗体を捕捉し、細胞マーカーの非特異的標識をもたらす可能性を排除するために、PE抗F4/80は抗体ミックスに含まれていた。

Discussion

イメージングと分子生物学や高次元免疫表現型を含む他の技術との組み合わせは、免疫細胞をネイティブの文脈で調べる能力を高めています。実際、他のアプローチでは組織の消化と細胞の単離が必要になる場合がありますが、組織の完全性を失う可能性がありますが、生体内またはex vivoイメージングを使用すると、地理的な方法で異なる細胞サブタイプを調査する上で大きな利点が得られます3^,16.細胞が異なる蛍煙を発現するために特異的に標的とされる遺伝子組み換えマウス株の利用可能性が急速に増加しているのは驚くべきことではない。重要なことに、レポーターマウスと抗体ミックスの注射の組み合わせは、同じ器官4内の異なる細胞集団を染色する強力なツールである。さらに、CRISPR/Cas9のような遺伝子編集ツールの普及により、異なるグループがマウス株をカスタマイズすることができ、事実上あらゆる細胞型が彼らの正真正の位置17で画像化できるようになりました。このアプロ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 抗CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 抗CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 ラット IgG2a, κアイソタイプコントロール	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 マウス IgG2b, K アイソタイプコントロール	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview 培養ディッシュ	Greiner-Bio	627861	35x10 mm ガラス底イン
スリンシリンジ	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtechサイエンスブランド	7557	サイズ 21 x 20 cm / 100枚/箱
マイクロサージェリー湾曲鉗子	WEP手術器具	カスタムメイド	12.5cm
マイクロサージェリー湾曲ハサミ	WEP手術器具	カスタムメイド	11.5cm
針	BD PrecisionGlide-30		ゲージ × ½ インチ
ニコン エクリプス Te + A1R 共焦点ヘッド	ニコン	-	メインの4つのレーザーライン(405、488、543、647nm)PE
抗F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342を搭載、0.2 mg mL-1
PEラットIgG2a、およびカッパ;アイソタイプコントロール	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
>Zeiss LSM 710 共焦点顕微鏡	Zeiss	-	メイン 4 レーザーライン (405、488、543、647 nm)