iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

サマリー

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。

要約

誘導多能性幹細胞(iPSC)は、任意の体細胞型に分化することができる患者特異的、増殖性細胞源である。二能性内皮前駆体(EP)は、成熟した機能的血管系を組み立てるのに必要な細胞タイプに分化することができ、胚性および誘導多能性幹細胞の両方から得られている。しかし、これらの細胞は3次元環境では厳密に評価されておらず、血管球電位の定量的尺度は依然として解明されていない。ここでは、蛍光活性化細胞選別によるiPSC-EPの生成と単離について最初に概説し、続いてコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化および培養の説明を行う。この細胞外マトリックス(ECM)模倣微小環境は、堅牢な血管学的応答を奨励する。血管ネットワークは、培養の1週間後に形成されます。オープンソースソフトウェアを利用してこの血管学的応答を定量化する計算パイプラインの作成を示す。このパイプラインは、キャピラリープレクサスの 3D アーキテクチャを維持し、ブランチの数、分岐ポイント、およびユーザー入力を最小限に抑えてネットワークの総長を堅牢に識別するように特別に設計されています。

概要

ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および他の一次内皮細胞型は、インビ^トロ1における血管の発芽および発達をモデル化するために20年間利用されてきた。このような血管プラットフォームは、心血管疾患の分子および組織レベルのメカニズムを照らすことを約束し、原始的な血管ネットワーク2,3の発達に生理学的洞察を提示しうる。血管モデリングの分野は大きな進歩を遂げましたが、生理学的血管の発達を定量的にモデル化し評価できる「ゴールドスタンダード」アッセイは依然として解明されていません。ほとんどの公表されたプロトコルは、成熟した機能的な血管の形成を奨励するために血管ニッチを十分に要約しないか、評価された細胞型の血管球電位を3次元で定量的に比較する方法を持っていない(3D)。

多くの現在の血管モデルは、生理血管ニッチを模倣する能力に制限されています。インビトロプラットフォームで最も一般的に採用されているのは、ゼラチン性タンパク質混合物系チューブ形成アッセイです。簡単に言えば、HUVECは、マウス肉腫細胞外マトリックス(ECM)から採取されたタンパク質からなるゲルの薄い層上の単一細胞として播種される。1〜2日以内に、HUVECは原始的な^管4に自己集合する。しかしながら、このプロセスは、このアッセイで利用される2次元(2D)および内皮細胞(IC)が密閉された中空の内包を形成せず、それによってこれらの研究の生理的意義を制限する。さらに最近では、ICおよび支持細胞(例えば、間葉系幹細胞(MSC)およびペリサイト)は、コラーゲンまたはフィブリンヒドロ^ゲル5などの天然ECMの繊維構造をシミュレートする3D微小環境で共培養されている。この微小環境における血管発達をモデル化するために、ICでコーティングされたポリマービーズは、典型的には6^を採用している。ヒドロゲルに間に埋め込まれた他の細胞によって分泌される外因性成長因子および/または成長因子の添加は、ICを誘導し、ポリマービーズをコーティングし、単一の内気を発芽させ、形成することができる。その後、芽や血管の数と直径を計算することができます。しかし、これらの芽は特異であり、生理学的条件で見られるように密閉された接続されたネットワークを形成しないため、腫瘍血管系モデルを連想させる。マイクロ流体デバイスはまた、血管ニッチを模倣し、ECを含むヒドロゲル7、8における血管系の形成を促進するために利用されている。典型的には、血管新生成長因子勾配は、EC移行および発芽を誘導するために循環細胞培養培地に適用される。発達した血管の内気を構成するICは、マイクロ流体装置を通る流体の流れの適用によって引き起こされるせん断応力に敏感である。したがって、これらのマイクロ流体デバイスは、静的モデルではアクセスできない主要な生理学的パラメータを捕捉します。しかし、これらのデバイスには高価な微細加工能力が必要です。

最も重要なことは、3つの血管モデル(2D、3D、マイクロ流体)すべてが、一次ICと一次支持細胞タイプを圧倒的に利用していることです。一次細胞は、移植時に免疫応答を生じるので、効果的な心血管療法に開発することはできません。さらに、HUVECおよび同様の一次細胞型は患者特異的ではなく、遺伝的性質または既存の健康状態(例えば糖尿病)を有する患者に生じる血管異常を捕捉しない。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、患者特異的で増殖性の細胞源として過去10年間に出現しており、人体内のすべての体細胞に分化することができる9。特に、iPSC由来の内皮前駆子(iPSC-EPs)10,11の生成と単離を概説するプロトコルが公開されている。iPSC-EPは二重能であり、したがって、成熟した機能的血管系のビルディングブロックである内皮細胞および平滑筋細胞/ペリサイトにさらに分化することができる。3D微小^環境12におけるiPSC-EPからの一次毛細叢の開発を説得力のある詳細に述べた研究は1つだけだ。本研究は、iPSC-EPアセンブリの理解と天然および合成ヒドロゲルの分化にとって重要であるが、得られた血管系のネットワークトポロジを定量的に比較しなかった。別の最近の研究では、ポリマービーズモデルを使用して、HUVECとiPSC由来のIC5の発芽を比較しました。したがって、3D微小環境におけるiPSC-EP血管形成を調節する物理的および化学的シグナル伝達機構をさらに解明し、これらの細胞が虚血療法および心血管疾患に適しているかどうかを判断する必要があることは明らかである。モデリング。

過去10年間で、血管ネットワークの長さと接続性を定量化し、比較するために、さまざまなオープンソースの計算パイプラインとスケルトン化アルゴリズムが開発されました。例えば、Charwatらは、フィブリンマトリックス13,14における脂肪由来幹細胞と成長するICの共培養に由来する血管ネットワークの濾過されたバイナリ化画像を抽出するPhotoshopベース^のパイプラインを開発した。おそらく、最も広く使用されているトポロジ比較ツールは、AngioTool、国立がん^研究所15によってオンラインで公開されたプログラムです。プログラムの広範な採用と十分に文書化された忠実さにもかかわらず、プログラムは2次元で血管のような構造を分析し、AngioSysとWimasisを含む他のプログラムは、同じ次元^制限16を共有しています。イマリス、ルシス、メタモルフなどの強力なソフトウェアスイートは、設計された微小血管のネットワークトポロジを分析するために開発されました。ただし、これらのスイートは、ほとんどのアカデミック ラボにとってコストがかかり、ソース コードへのアクセスを制限する必要があるため、エンド ユーザーが特定のアプリケーションに合わせてアルゴリズムをカスタマイズする機能を妨げる可能性があります。オープンソースの磁気共鳴イメージング/コンピュータ断層撮影パッケージである3Dスライサーには、3D血管ネットワークのトポロジを効果的に分析できる血管モデリングツールキットが含まれています^17;ただし、分析はユーザーがネットワークのエンドポイントを手動で配置することに依存します。この原稿では、3D血管ネットワークを定量することができる計算パイプラインについて詳しく説明する。上記の制限を克服するために、このオープンソースの計算パイプラインは、ImageJを使用して取得した共焦点イメージを事前に処理し、3D ボリュームをスケルトンアナライザにロードします。スケルトンアナライザは、並列中間軸間引きアルゴリズムを使用し、もともとKerschnitzkiらによって開発され、骨細胞^{ネットワーク18}の長さと接続性を分析しました。このアルゴリズムは、設計された微小血管の長さと接続性を特徴付けるために効果的に適用することができる。

全体として、このプロトコルは、3Dマイクロ環境における微小血管ネットワークの作成の概要を説明し、オープンソースとユーザバイアスの自由な計算パイプラインを提供し、iPSC-EPの血管学的可能性を容易に比較します。

プロトコル

1. 培養培養剤・コーティングソリューションの調製

1. ビトロネクチンコーティング溶液を調製するために、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食べ物(DPBS)でビトロネクチン1:100を希釈する。
   注意: 一度希釈すると、将来の使用のためにこのソリューションを保存することはお勧めしません。
2. フェノールレッドフリー、成長因子還元ゼラチン状タンパク質混合物(材料の表を参照)をメーカーから受け取ると、混合物が透明かつ流体になるまで氷上で4°Cで融解する。層流フードで氷上に混合物を保持し、1.8 mLマイクロ遠心管に混合物のピペット75 μLを、すぐに-20 °Cで凍結します。これらのアリコートは、最大1年間保存することができます。
   注意:このゼラチン状タンパク質混合物は、室温で保つと非常に粘性になり、より高い温度で固化します。このソリューションは氷冷に保ちます。
3. コーティングのためにこの混合物を調製するには、氷上の75 μLアリコートを解凍し、6 mLの氷冷ダルベッコの改変イーグル媒体:栄養混合物F-12(DMEM/F12)で希釈します。この調製された容積は12ウェルプレートをコーティングするのに十分である。
4. 10mLガラスシンチレーションバイアルに500mgの粉末を5mLの水に加えて、超純水中のアスコルビン酸マグネシウム-2-リン酸(白色凍結乾燥粉末)の100mg/mLストック溶液を調製する。溶液が完全に透明になるまで攪拌バーで攪拌します(これは1時間かかることがあります)。この溶液は-20°Cで最大1年間保存できます。
5. 15 mLの円錐遠心管で1.9928 mLの凍結乾燥粉末(DMSO)を溶解し、溶液が透明になるまで37°Cビーズ(または水)浴で温めます。アリコットを1.8mLマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで最大1年間保存します。
6. ROCK阻害剤であるY-27632(ROCKi)の10mMストックを作成し、15mLのコンフィカル遠心管で3.1225mLの凍結乾燥粉末(DMSO)を溶解し、溶液が透明になるまで37°Cビーズ(または水)浴で温めます。アリコットを1.8mLマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで最大1年間保存します。
7. エッセンシャル8(E8)培地を調用し、冷凍サプリメントを解凍し、基底培地の500mLボトルに加え、殺菌を濾過する。この溶液は、最大2週間4°Cで保存することができます。
   注意:培地製剤中のタンパク質が長時間の使用で劣化する可能性があるため、この培地を37°Cで温めないことは非常に重要です。代わりに、この媒体を室温で15~30分間使用してください。
8. ソートバッファーを調剤するには、DPBSに7.5%のウシ血清アルブミン(BSA)の1.33mL、0.5mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)の200 μLをDPBSの48.5mLに加え、0.5%BSAおよび2mMMEDTAの最終溶液を作成します。
9. LaSR基底を調製するには、100mg/mLのアスコルビン酸マグネシウム-2リン酸と5mLのグルタマックスを500mLのアドバンストDMEM/F12に加えます。この溶液は、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
10. 内皮細胞増殖培地-2(EGM-2)を調製し、サプリメントを解凍し、基底培地の500mLボトルに添加する。この溶液は、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
11. ブロッキングバッファーを調剤するには、凍結乾燥牛血清アルブミン(BSA)500mg、乳化試薬の50μLをDPBSの48mLに加えます。 BSAが凝固し、その後溶液から分離しないことを確認するために、少なくとも15分間37°Cでインキュベートします。

2. iPSCの解凍、メンテナンス、継ぎ取り

1. 凍結保存されたiPSCバイアルを解凍する前に、1mLのビトロネクチン溶液で6ウェルプレートの単一のウェルを塗ります(ステップ1.1に記載されているように調製)。室温で1時間インキュベートする。プレートにE8培地を加える前に、このコーティング空気を乾燥させないようにしてください。
2. iPSCを解凍するには、液体窒素貯蔵容器からiPSCの凍結保存バイアルを取り出し、氷の小さな結晶が残るまで37°Cで解凍します。解凍したバイアルの含有量を、8 mLの氷冷DMEM/F12を含む15 mLの円錐遠心管に慎重に(滴下)移します。解凍したバイアルを氷冷DMEM/F12の1mLで洗浄し、細胞の損失を最小限に抑えてください。遠心分離機 300 x gで 5 分.
3. 遠心分離機を待っている間、ビトロネクチン溶液を吸引し、ウェルにE8培地(ステップ1.6で説明するように調製)の1 mLを加える。次いで、遠心円錐管からDMEM/F12上清を取り出し、E8培地の1mLでペレットを再度サスペンドする。細胞を新しくコーティングしたプレートに移し、凝固が播種時に凝固するのを防ぐために懸濁液を攪拌することを確認する。
4. 通常、解凍後に実質的な細胞死がある。翌朝、培地を取り外し、新鮮なE8培地に置き換えます。
   注:最適な条件下でも、iPSCは凍結保存から回復が不十分である傾向があります。単一の6ウェルに将来の種子のために近いコンフルエント6ウェルを凍結保存することをお勧めします。細胞破片の存在は、細胞回収中の最初の2〜3日間正常である。
5. 細胞が通過する準備ができるまで、E8培地を毎日交換します(70%~80%の合流性)。
6. 通路を通すために、まずビトロネクチンコーティングウェルを調製する(ステップ2.1に記載されているように)。
   1. ビトロネクチンコーティングされたウェルが準備ができたら(約1時間)、E8培地をよく通行し、DPBSの1 mLで2回洗浄する。0.5 mM EDTAの1 mLで37°Cで5〜7分間インキュベートします。インキュベートしながら、新たにコーティングしたビトロネクチン溶液をよく取り出し、E8培地の1-2 mLに置き換えます。
   2. 通行するウェルからEDTA溶液を取り出し、E8の1mLで1回または2回静かに洗浄してコロニーを取り外します。75-200 μLの細胞懸濁液を新たにコーティングされたE8含有ウェルに移し、プレートを攪拌して均一なカバレッジを確保し、インキュベーターに直ちに入れます。
      注意: iPSC 剥離のインキュベーション時間は細胞線に依存します。このプロトコルのユーザーは、受信/生成された iPSC 回線を十分に拡張したときに、さまざまな回数をテストすることをお勧めします。75 μLの細胞懸濁液は、一般に、通過間4日間で生じます。150 μL 以上は、通路間の 2 ~ 3 日につながります。

3. iPSC由来の内皮前駆器の生成(図1)。

1. iPSCを維持する場合は、コロニーが十分に圧縮され、培養中の分化細胞の数が少ないことを確認してください。コロニーが互いに接触し始める場合、細胞はあまりにもコンフルエントである可能性が高く、直ちに通過する必要があります。
2. iPSCが70%~80%のコンフルエントである場合は、ゼラチン状タンパク質混合物で24ウェルプレートを塗ります(1.2/1.3に記載されているように調製)。この混合物のピペット250 μLを各井戸に入れ、室温で1時間保持します。
3. 上記の1-hインキュベーションの間に、それぞれ冷蔵庫と冷凍庫からE8培地とY-27632を取り出します。E8培地とY-27632が室温に達したら、15 mLの円錐遠心管にE8の13 μLを10 μM Y-27632~13 mLを加えてE8+ROCKiを調製します。
4. iPSCウェルからE8培地を取り出し、1mLのDPBSで2回洗浄し、0.5mM EDTAで37°Cで5~7分間インキュベートします。インキュベーション期間の後、EDTAを取り出し、E8+ROCKi培地の1 mLを持つP1000ピペット先端を用いて細胞を単細胞懸濁液に急速にせん断する。
5. 血球計で細胞を数えます。何百万ものiPSCを含む懸濁液の場合は、20 μLのセル懸濁液を180 μLのトリパンブルーに加えます。単一セル懸濁液内のセルの総数を決定します。
6. 0.432 x 10⁶から 1.296 x 10⁶セル (10⁴ ~ 3 x 10⁴セル/cm²⁾を残りの E8 + ROCKi 培地に転送します。新たにコーティングされた12ウェルプレートからゼラチン状の混合物コーティングを取り除き、各ウェルに500μLの細胞懸濁液を加え、細胞が十分に分布し、小さな塊を形成しないことを保証します。
   注:この密度の範囲は、CD34陽性細胞の分化に最適です。ただし、これらのシード密度はセルラインに依存するため、このプロトコルのユーザが最適化する必要がある場合があります。
7. 培養の24時間後、新鮮なE8培地の500 μLで培地を交換してください。同じ条件下でさらに24時間インキュベートします。
8. E8培地を取り外し、CHIR99021の6-12 μMを補充したLaSR基底に置き換えます。このタイムポイントは、差別化の D0 として定義されます。24時間培養後、同じ細胞培養培地に置き換える。
   注: 前述のように、この媒体に追加される CHIR99021 の量は、使用される iPSC 回線によって異なります。最適な結果を確認するために、CHIR99021濃度の範囲をテストしてください。
9. CHIR99021で48時間のインキュベーションを行った後、LaSR基底の1mLで交換してください。
10. 2-3追加の日のためのLaSR Basalの2 mLで毎日媒体を交換します。この時点で(分化のD5)、これらの細胞のかなりの割合はCD34を発現し、内皮前駆体として特徴付けることができる。このプロトコルの概略図は図1の代表的な結果と概説され、この方法11,19を最初に公開した研究者によって完全に説明される。
    注:これらの内皮前駆子は、内皮系統に沿ってさらに分化することができる(35%-99%)または平滑筋系統(1%-65%)。分化効率は、分^化20の間に使用されるECMコーティングおよび細胞培養培地の種類によって異なる。

4. 内皮前駆器のFACS

1. D5/D6分化細胞を解離する前に、ステップ1.8で説明したソートバッファを準備し、氷の上に保管してください。
2. 分化した細胞をウェル当たり250μLの細胞剥離液でインキュベート(材料の表を参照)を37°Cで10分間インキュベートします。
3. P1000ピペット先端で細胞を細胞剥離液中の単一細胞懸濁液に解離する。15 mLの円錐遠心管と遠心分離機でセル細胞剥離溶液混合物を300 x gで5分間統合します。
4. 上清を取り外し、200 μLの氷冷選別バッファーで再中断します(ステップ1.7で説明したように調製)。濃縮CD34-PE抗体の5μLを細胞選別バッファー懸濁液に加え、4°Cで10分間インキュベートする。
5. 氷冷ソーティングバッファの5 mLで再中断します。ソーターに置く前に、40 μmキャップを持つセルストレーナーを通してこの懸濁液をフィルタリングします。
6. 適切な蛍光チャネル上で、蛍光抗体で標識されていない10,000細胞をソートする。これらの10,000細胞のいずれも含まない高い蛍光強度で領域をゲートする(図1D)。これは負のコントロールとして機能します。
7. 蛍光溶液で標識されたiPSC-EPを含むサンプルを実行し、ソートを開始します。CD34は、これらの内皮前駆体において高度に発現され、主要集団から容易に分離される。ソート後、溶液を15mLの円錐遠心管と遠心分離機に300 x gで5分間移します。上清を取り除く。
   注:溶液がマイクロ遠心管よりも大きいチューブ(例えば、多くのFACプロトコルで一般的に使用される5 mLポリスチレンチューブ)にある場合は、ソートバッファーの1 mLでソートされたセルペレットを再中断し、この溶液をマイクロ遠心管に移します。300 x gで5分間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。
   1. オプション:さらなるiPSC-EP特性化が望ましい場合は、CD34-PEと同時に他の一次抗体(例えば、CD31-APC)を添加する。異なる蛍光チャネル間のクロストークが最小限に抑えられるようにします。

5. iPSC-EPを含むコラーゲンヒドロゲルの封入と長期培養

1. 10x培地199~400μLの内皮増殖培地(EGM-2)の40μLを1.8mLマイクロセントリフュージに添加し、チューブを氷上に置いて種分培地を調製する。
   注:幹細胞培養や分化細胞の維持には抗生物質の使用はお勧めしませんが、選別環境での無菌性を保証することは困難であるため、選別後にPen/Strepを投与することをお勧めします(これはより多くのです。ソーターが多くのラボ間で共有されている場合は必須です)。
2. 細胞懸濁液からすべての上清を取り除き、10 μM Y-27632を補充したEGM-2の200 μLを追加します。細胞懸濁液を播種培地に移し、激しく混ぜる。
3. ステップ5.2で調製した溶液に350μLのコラーゲンを加え、よく混ぜます。溶液は淡い黄色になります。
   注:コラーゲンの最終的な濃度は、毛細血管叢の形成に大きな影響を与えることができます。このプロトコルは、コラーゲンが10mg/mLで供給され、ヒドロゲルの最終濃度が3.5mg/mLであることを前提としています。最終的なコラーゲン濃度を達成するために、これらのボリュームを調整します。最終的なコラーゲン濃度を 2 mg/mL から 4 mg/mL に制限することをお勧めします。
4. 5.3で調製した溶液に1M NaOHの5 μLを加え、気泡の導入を避け、よく混ぜます。解決策は明るいピンクになります。
5. 96ウェル超低アタッチメントU-ボトム細胞培養プレートの個々のウェルに5.4で調製した中和コラーゲン細胞溶液のピペット56μL。37 °Cで30分間インキュベートします。培地を追加する前に、明視野顕微鏡でサンプルを調べることで、細胞が均等に分布していることを確認してください。
6. マイクロ遠心管に各ストック溶液の1μLを添加することにより、10 μM Y-27632および50 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)を添加したEGM-2からなる培養培地の1mLを調製する。よく混合した後、この細胞培養培地のピペット100μLを細胞積み重ねヒドロゲル上に置く。長期間培養するためにプレートを37°Cに移します。
7. 培養培地を毎日置き換え、研究の目的に従って血管新生成長因子または低分子阻害剤を追加する。メディアを最適に取り外すには、プレートを傾け、P100チップを使用して、ヒドロゲルを邪魔することなく、穏やかに媒体を吸引します。

6. EPベースの血管ネットワークの固定、免疫染色、可視化

1. 1週間培養後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の250 μLを48ウェルプレートに加えます。ヒドロゲルがあるのと同じくらい多くの井戸を埋めます。ヒドロゲル(PFA)から培地を取り出し、細かいピンセットを使用して、ウェルを含むPFAにヒドロゲルを移します。室温で10分間インキュベートし、PBSで速く洗浄してPFAを除去します。
2. 室温で5分間、ニオニオニック界面活性剤(材料の表を参照)の0.5%の250 μLを加えて透過化する。300 mMグリシンを補充したPBSの250 μLで2回洗浄します。余分な洗剤の除去を確実にするために、各洗浄工程のために室温で5分間インキュベートします。ヒドロゲルを250μLのブロッキングバッファーに30分間浸漬してブロックする。
3. 所望の一次抗体を4°Cで一晩ブロッキングバッファーで希釈してインキュベートする。例えば、ファロイジンおよびVE-カドヘリンによる免疫染色の場合、それぞれ1:40および1:200を希釈するバッファー内で。
4. 翌日、一次抗体溶液を取り出し、DPBSで0.5%乳化試薬で2回洗浄する。アルミホイルで覆い、種特異的二次抗体(例えば、PBSで1:200 Alexa Fluor 488)で2時間室温でインキュベートします。
5. 二次抗体溶液を取り出し、DPBSで0.5%乳化試薬で2回洗浄します。各洗浄工程で室温で5分間インキュベートし、フリー蛍煙の除去を確保します。
6. 細胞核を可視化するには、4'、6-ジアミド-フェニリンドール(DAPI)1:10000をPBSで希釈し、試料に添加する。
   1. 室温で2分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します。各洗浄工程で室温で5分間インキュベートし、フリー蛍煙の除去を確保します。
7. 微細なピンセットを使用して、血管新生μ-Slideまたはガラス底ペトリ皿にサンプルを転送します。ヒドロゲルの下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。
8. サンプルの下部から上部に伸びるZスタックを取得することにより、共焦点顕微鏡上の画像。検出器が飽和状態で、使用可能な最小倍率が使用されていることを確認します(大きな視野が望ましい場合)。
   注: 将来の処理では、Z スタックが最小限の圧縮 (.czi など) で保存されていることを確認してください。

7. 計算パイプラインを使用して血管ネットワークトポロジを分析および比較する

1. 各 Z スタックを検査して、スライスに容器のみが含まれていることを確認します。ImageJ で Z スタックを開き、[イメージ>調整>明るさ/コントラスト]をクリックしてコントラストを高めます。船舶の境界線が明確に区切られ、背景レベルが最小化されました。多くの場合、Z ディメンションは x/y ディメンションと一致しません。これを修正するには、[イメージ>サイズを調整し、Z スライスの数を変更して、各スライス間の距離が x/y. ImageJ の 1 ピクセルに相当するように変更します。 この手順が正しく実行されない場合、最後の 3D ボリュームは圧縮されたように表示されます。
   注意:ICはゲルの端に向かって移動し、小さな石畳のコロニーを形成します。これらはヒドロゲルの境界を推定するのに有用であるが、それらは最終的な画像分析を妨げ、削除されるべきである。
   注:ImageJは、国立衛生研究所と光学・計算計測研究所が共同で開発したJavaベースのオープンソース画像解析ソフトウェアです。単に便利なプラグイン(https://fiji.sc/)にバンドルされたImageJであるフィジーをダウンロードすることをお勧めします。
2. ImageJ では、3 次元クリックで画像をぼかし、[プロセス>ガウス ブラー 3D]をクリックし、3 次元すべてでシグマ値を 2.0 に設定します (この値はエンド ユーザーが調整する必要がある場合があります)。
3. ImageJ で、[プロセス>バイナリ>バイナリを作成]をクリックし、適切なしきい値アルゴリズムを選択します。Liらによって開発されたクロスエントロピー閾値アルゴリズムは、^{バックグラウンド21}から血管を分離するのに有効である。各画像のしきい値を計算し、背景を「デフォルト」に設定します。
4. ImageJ では、[プロセス>ノイズ>外れ値の削除] をクリックして、スプリアスノイズを削除し、ルーメンの「穴」を埋めます。
   注:「明るい」外れ値を削除すると、接続された容器の小さな穴が埋まる。「暗い」外れ値を削除すると、死んだ細胞が削除されます。除去半径のサイズは、容器の拡大とサイズに応じります。512 x 512 ピクセルの広視野目標で取得された画像の場合、半径は通常 4 ~ 6 ピクセルの範囲になります。
5. ステップ 7.6 に進む前に、すべての生のファイル (czi 拡張子など) を処理し、.tif ファイルに変換します。この処理を支援するために、ImageJ スクリプト "Binarize and Filter.ijm" がこの原稿に添付されています。
6. 処理された .tif ファイルを、原稿でダウンロードできるファイル "BatchProcessSkeleton.m" と同じフォルダーに保存します。著者によって開発されたこのスクリプトは、フィリップ・コルマンス^{バーガー22}によって公開された関数を呼び出し、いくつかの追加のファイル操作を行います。
7. 2つの主要な機能「Skel2Graph3D」(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d)と「スケルトン3D」(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d)に関連するすべてのファイルをダウンロードして解凍します。開いた処理済み z スタックと同じフォルダーにすべての関数を保存します。
8. マルチパラダイム数値計算環境(「材料の表」を参照)を開き、上記のすべてのファイルが保存されているフォルダに移動します。
9. コマンド ウィンドウでBatchProcessSkeletonを入力するか、スクリプトを開き、エディタで実行ボタン (右向きの緑色の矢印) を押して "BatchProcessSkeleton.m" を実行します。
   注: 単一のコマンドで大きなデータセットを分析するには、6 行線のdir関数内の文字列にアスタリスク ('*.tif' など) が含まれていることを確認します。それ以外の場合は、単一のファイルの分析が必要な場合は、アスタリスクをファイル名に置き換えます。
10. このスクリプトの実行にかかる時間は、使用可能なコンピューティング能力によって大きく異なります。スクリプトの実行中にユーザーが他のプログラムにアクセスできるように、少なくとも 8 GB の RAM を搭載したコンピュータでこの分析を実行することをお勧めします。
    注意: 厳密には必要ではありませんが、元の共焦点集録 (灰色) をグラフ化し、このイメージ マトリックスをスケルトン マトリックス (赤色) でオーバーレイすると、スケルトン化アルゴリズムのパフォーマンスを評価するのに役立ちます。さらに、読者は、Kollmannsbergerらによって実装された節点グラフを作成して、ネットワーク解析の精度を評価することができる。両方のグラフを作成すると便利ですが、スクリプトの実行時間が大幅に増加し、追加のメモリが必要になります。ユーザーが単に最終的なトポロジ分析を必要とし、データ セットを視覚化したくない場合は、単に行 44 から 61 (スケルトン グラフ) と行 104 から 143 (トポロジ グラフ) をコメントアウトします。
11. 完了すると、ワークスペースに表示されるデータマトリックスに処理されたデータが含まれるようになりました。[データ]をダブルクリックし、変数エディタでこのセルを開きます。
    1. このマトリックスには、左から右へ:1)ファイル名、2)ノード数(分岐点+終点)、3)ブランチポイント、4)リンク(船舶)、5)ネットワーク長(隔離容器を含む)、および6)Zスタックに含まれるスライスの数が含まれます。このデータを .csv ファイルとして保存し、任意のソフトウェアにさらに分析をエクスポートします。

結果

分化(図1)、FACSおよびコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化後、細胞は通常、移行し、初期ルーメンを形成し始める前に24時間丸みを帯びたままになります。約6日間の培養後、ブライトフィールド顕微鏡で見ると、原始毛細叢がヒドロゲルに見える(図2)。共焦点顕微鏡(ムービー1、補足ムービー1)で固定された染色された細胞を含むヒドロゲルをイメージングした後、前処理された画像は、ネットワークの全体的な長さと接続性の分析を可能にする骨格に変換されます。これらの定量的測定を使用して、堅牢な血管ネットワークを生成するために最適な条件セットを決定できます。

このプロトコルは、局所的な物理的および化学的手がかりに応答する堅牢な3次元毛細叢の開発を可能にする。前の研究では、このネットワーク形成は、マトリックス...

ディスカッション

このプロトコルは、E8、LaSR基底、およびEGM-2の3種類の細胞培養培地における細胞の長期培養を含む。したがって、すべての材料を適切に殺菌するために細分注意する必要があります。さらに、ラボコートとエタノール洗浄手袋は、実験室の層流フードで作業する場合は常に着用する必要があります。マイコプラズマ汚染を頻繁にテストすることをお勧めします。iPSC培養中に大量の破片が観測されたり、分化効率が急激に低下したりすると、マイコプラズマ汚染が原因と考えられます。このプロトコルで生成されたiPSC-EPは、解離時間を長くし、単一細胞懸濁液を小さな塊に分離させるECMのかなりの量を堆積する傾向があります。溶液がiPSC-EP上のCD34エピトープを破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTA(0.25%)を使用しないでください。しかし、コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液による治療は、沈着したECMを除去し、標準的な細胞剥離溶液で解離を容易にする。広範な解離後、細胞およびECMのいくつかの小さな塊が残る。彼らは細胞ストレーナーを詰まらせるか、FACSを妨害する可能性が高いので、P100ピペット先端でこれらの塊を削除します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µ-スライド血管新生	同上	N/A	側壁を備えた平坦なガラス底組織培養プレートは、容易な共焦点イメージング
96、丸底、超低アタッチメントマイクロプレート、無菌	コーニング	7007	への細胞含んだコラーゲンハイドロゲルの結合を防ぎます
			穏やかな細胞剥離ソリューション。FACSに不可欠な細胞外エピトープを分解しない
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	iPSC-EP分化のためのベース培地。
バーンステッド GenPure xCAD Plus	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50136165	純水製造システム; その他は容易に置換できる
ウシ血清アルブミン溶液、7.5% DPBS、滅菌ろ過、BioXtra、細胞培養に適しています	フィッシャーサイエンティフィック	A8412	FACs ソーティング
CD34-PE、ヒト (クローン: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	iPSC-EPs
の FAC 単離に使用される抗体CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem
cells コラーゲン I ラットテール 高タンパク質 100 mg	VWR	354249	3D 微小環境の主成分
円錐形遠心チューブ (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	比較的大量の試薬と細胞培養培地
の保存と混合に使用DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306	細胞核の対比染色と可視化
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320-082	マトリゲルの希釈および多能性幹細胞の融
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	サーモフィッシャー	14190-250	単層培養物EDTA
	の洗浄Sigma-Aldrich	E8008	多能性幹細胞コロニーの継代およびFACが内皮細胞増殖培地を選別する際の細胞凝集防止用
	PromoCell	C-22011	内皮細胞の生存率と増殖を促進する
エッセンシャル 8 培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1517001	多能性幹細胞のメンテナンスに
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	残留界面活性剤を中和
L-アスコルビン酸 2-リン酸 sesquiマグネシウム塩水和物,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	iPSC-EP 分化媒体の成分
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	マルチパラダイム数値計算環境 (ほとんどの学術機関で無料)
マトリゲルマトリックスGFRフェノールRFマウス10mL(ゼラチン状タンパク質混合物)	フィッシャーサイエンティフィック	356231	DMEM/F12で希釈してiPSC-EP分化用プレートをコーティングします
Medium-199 10X	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1825015	最終的なヒドロゲル浸透圧とpHのバランスをとるために使用されます
微量遠心チューブ(1.7mL)	VWR	87003-294	の試薬を保存します
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	免疫染色溶液の主成分
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	FACS装置から汚染の可能性を除去するために選別後に使用される抗生物質
組換えヒトVEGF 165タンパク質	R&D Systems	293-VE	内皮細胞の増殖と尿細管形成を刺激するマイトジェン
ローダミンファロイジン	テモフィッシャーサイエンティフィック	R415	F-アクチン沈着を特定し、血管ネットワークの境界を概説するために
Triton X-100 (非イオン性界面活性剤)	Sigma-Aldrich	X-100	細胞を穏やかに透過処理するために使用される洗剤
Tween-20 (乳化試薬)	フィッシャーサイエンティフィック	BP337	結合特異性を高めます
サンタ	クルス	バイオテクノロジーsc-9989	コラーゲンハイドロゲルの3D内皮内腔の同定
ビトロネクチン	サーモフィッシャー	A14700	多能性幹細胞の維持用
Y-27632	セレック ケミカルズ	S1049	解離および再播種時に多能性幹細胞と iPSC-EP の生存能力を維持