iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Summary

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。

Abstract

誘導多能性幹細胞(iPSC)は、任意の体細胞型に分化することができる患者特異的、増殖性細胞源である。二能性内皮前駆体(EP)は、成熟した機能的血管系を組み立てるのに必要な細胞タイプに分化することができ、胚性および誘導多能性幹細胞の両方から得られている。しかし、これらの細胞は3次元環境では厳密に評価されておらず、血管球電位の定量的尺度は依然として解明されていない。ここでは、蛍光活性化細胞選別によるiPSC-EPの生成と単離について最初に概説し、続いてコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化および培養の説明を行う。この細胞外マトリックス(ECM)模倣微小環境は、堅牢な血管学的応答を奨励する。血管ネットワークは、培養の1週間後に形成されます。オープンソースソフトウェアを利用してこの血管学的応答を定量化する計算パイプラインの作成を示す。このパイプラインは、キャピラリープレクサスの 3D アーキテクチャを維持し、ブランチの数、分岐ポイント、およびユーザー入力を最小限に抑えてネットワークの総長を堅牢に識別するように特別に設計されています。

Introduction

ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および他の一次内皮細胞型は、インビ^トロ1における血管の発芽および発達をモデル化するために20年間利用されてきた。このような血管プラットフォームは、心血管疾患の分子および組織レベルのメカニズムを照らすことを約束し、原始的な血管ネットワーク2,3の発達に生理学的洞察を提示しうる。血管モデリングの分野は大きな進歩を遂げましたが、生理学的血管の発達を定量的にモデル化し評価できる「ゴールドスタンダード」アッセイは依然として解明されていません。ほとんどの公表されたプロトコルは、成熟した機能的な血管の形成を奨励するために血管ニッチを十分に要約しないか、評価された細胞型の血管球電位を3次元で定量的に比較する方法を持っていない(3D)。

多くの現在の血管モデルは、生理血管ニッチを模倣する能力に制限されています。インビトロプラットフォームで最も一般的に採用されているのは、ゼラチン性タンパク質混合物系チューブ形成アッセイです。簡単に言えば、HUVECは、マウス肉腫細胞外マトリックス(ECM)から採取されたタンパク質からなるゲルの薄い層上の単一細胞として播種される。1〜2日以内に、HUVECは原始的な^管4に自己集合する。しかしながら、このプロセスは、このアッ....

Protocol

1. 培養培養剤・コーティングソリューションの調製

1. ビトロネクチンコーティング溶液を調製するために、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食べ物(DPBS)でビトロネクチン1:100を希釈する。
   注意: 一度希釈すると、将来の使用のためにこのソリューションを保存することはお勧めしません。
2. フェノールレッドフリー、成長因子還元ゼラチン状タンパク質混合物(材料の表を参照)をメーカーから受け取ると、混合物が透明かつ流体になるまで氷上で4°Cで融解する。層流フードで氷上に混合物を保持し、1.8 mLマイクロ遠心管に混合物のピペット75 μLを、すぐに-20 °Cで凍結します。これらのアリコートは、最大1年間保存することができます。
   注意:このゼラチン状タンパク質混合物は、室温で保つと非常に粘性になり、より高い温度で固化します。このソリューションは氷冷に保ちます。
3. コーティングのためにこの混合物を調製するには、氷上の75 μLアリコートを解凍し、6 mLの氷冷ダルベッコの改変イーグル媒体:栄養混合物F-12(DMEM/F12)で希釈します。この調製された容積は12ウェルプレートをコーティングするのに十分である。
4. 10mLガラスシンチレーションバイアルに500mgの粉末を5mLの水に加えて、超純水中のアスコルビン酸マグネシウム-2-リン酸(白色凍結乾燥粉末)の100mg/mLストック溶液を調製する。溶液が完全に透明になるまで....

Results

分化(図1)、FACSおよびコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化後、細胞は通常、移行し、初期ルーメンを形成し始める前に24時間丸みを帯びたままになります。約6日間の培養後、ブライトフィールド顕微鏡で見ると、原始毛細叢がヒドロゲルに見える(図2)。共焦点顕微鏡(ムービー1、補足ムービー1)で固定された染色された細胞を含むヒドロゲルをイメージングした後、前処理された画像は、ネットワークの全体的な長さと接続性の分析を可能にする骨格に変換されます。これらの定量的測定を使用して、堅牢な血管ネットワークを生成するために最適な条件セットを決定できます。

このプロトコルは、局所的な物理的および化学的手がかりに応答する堅牢な3次元毛細叢の開発を可能にする。前の研究では、このネットワーク形成は、マトリックス.......

Discussion

このプロトコルは、E8、LaSR基底、およびEGM-2の3種類の細胞培養培地における細胞の長期培養を含む。したがって、すべての材料を適切に殺菌するために細分注意する必要があります。さらに、ラボコートとエタノール洗浄手袋は、実験室の層流フードで作業する場合は常に着用する必要があります。マイコプラズマ汚染を頻繁にテストすることをお勧めします。iPSC培養中に大量の破片が観測されたり、分化効率が急激に低下したりすると、マイコプラズマ汚染が原因と考えられます。このプロトコルで生成されたiPSC-EPは、解離時間を長くし、単一細胞懸濁液を小さな塊に分離させるECMのかなりの量を堆積する傾向があります。溶液がiPSC-EP上のCD34エピトープを破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTA(0.25%)を使用しないでください。しかし、コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液による治療は、沈着したECMを除去し、標準的な細胞剥離溶液で解離を容易にする。広範な解離後、細胞およびECMのいくつかの小さな塊が残る。彼らは細胞ストレーナーを詰まらせるか、FACSを妨害する可能性が高いので、P100ピペット先端でこれらの塊を削除します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-スライド血管新生	同上	N/A	側壁を備えた平坦なガラス底組織培養プレートは、容易な共焦点イメージング
96、丸底、超低アタッチメントマイクロプレート、無菌	コーニング	7007	への細胞含んだコラーゲンハイドロゲルの結合を防ぎます
			穏やかな細胞剥離ソリューション。FACSに不可欠な細胞外エピトープを分解しない
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	iPSC-EP分化のためのベース培地。
バーンステッド GenPure xCAD Plus	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50136165	純水製造システム; その他は容易に置換できる
ウシ血清アルブミン溶液、7.5% DPBS、滅菌ろ過、BioXtra、細胞培養に適しています	フィッシャーサイエンティフィック	A8412	FACs ソーティング
CD34-PE、ヒト (クローン: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	iPSC-EPs
の FAC 単離に使用される抗体CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem
cells コラーゲン I ラットテール 高タンパク質 100 mg	VWR	354249	3D 微小環境の主成分
円錐形遠心チューブ (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	比較的大量の試薬と細胞培養培地
の保存と混合に使用DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306	細胞核の対比染色と可視化
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320-082	マトリゲルの希釈および多能性幹細胞の融
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	サーモフィッシャー	14190-250	単層培養物EDTA
	の洗浄Sigma-Aldrich	E8008	多能性幹細胞コロニーの継代およびFACが内皮細胞増殖培地を選別する際の細胞凝集防止用
	PromoCell	C-22011	内皮細胞の生存率と増殖を促進する
エッセンシャル 8 培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1517001	多能性幹細胞のメンテナンスに
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	残留界面活性剤を中和
L-アスコルビン酸 2-リン酸 sesquiマグネシウム塩水和物,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	iPSC-EP 分化媒体の成分
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	マルチパラダイム数値計算環境 (ほとんどの学術機関で無料)
マトリゲルマトリックスGFRフェノールRFマウス10mL(ゼラチン状タンパク質混合物)	フィッシャーサイエンティフィック	356231	DMEM/F12で希釈してiPSC-EP分化用プレートをコーティングします
Medium-199 10X	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1825015	最終的なヒドロゲル浸透圧とpHのバランスをとるために使用されます
微量遠心チューブ(1.7mL)	VWR	87003-294	の試薬を保存します
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	免疫染色溶液の主成分
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	FACS装置から汚染の可能性を除去するために選別後に使用される抗生物質
組換えヒトVEGF 165タンパク質	R&D Systems	293-VE	内皮細胞の増殖と尿細管形成を刺激するマイトジェン
ローダミンファロイジン	テモフィッシャーサイエンティフィック	R415	F-アクチン沈着を特定し、血管ネットワークの境界を概説するために
Triton X-100 (非イオン性界面活性剤)	Sigma-Aldrich	X-100	細胞を穏やかに透過処理するために使用される洗剤
Tween-20 (乳化試薬)	フィッシャーサイエンティフィック	BP337	結合特異性を高めます
サンタ	クルス	バイオテクノロジーsc-9989	コラーゲンハイドロゲルの3D内皮内腔の同定
ビトロネクチン	サーモフィッシャー	A14700	多能性幹細胞の維持用
Y-27632	セレック ケミカルズ	S1049	解離および再播種時に多能性幹細胞と iPSC-EP の生存能力を維持