質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

サマリー

このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。

要約

このプロトコルの目的は、マウス皮膚の表皮から単一細胞を用いて細胞周期依存的な方法でタンパク質発現変化を検出し、定量することである。7つの重要なステップがあります:真皮からの表皮の分離、表皮の消化、シスプラチンを用した表皮細胞集団の染色、サンプルバーコード、細胞周期マーカーおよびタンパク質に対する金属タグ付き抗体での染色質量サイトメトリーによる金属タグ付き抗体の検出、および様々な細胞周期相における発現の分析に関心を持つ。組織学的方法に対するこのアプローチの利点は、細胞周期の異なる段階で1つの細胞における>40の異なるマーカーの発現パターンをアッセイする可能性である。このアプローチはまた、組織学的/イメージング法よりも定量化可能なタンパク質発現の多変量相関分析を可能にする。このプロトコルの欠点は、単一細胞の懸濁液が必要であり、組織切片の染色によって提供される位置情報の損失をもたらす。このアプローチはまた、粗細胞懸濁液中の異なる細胞型を識別するために追加のマーカーを含めることを必要とする場合もある。このプロトコルの応用は、過形成性皮膚疾患モデルの分析において明らかである。さらに、このプロトコルは、系統特異的抗体の添加によって特定のサブタイプの細胞(例えば、幹細胞)の分析に適合させることができる。このプロトコルはまた、他の実験種における皮膚細胞の分析に適合させることができる。

概要

遺伝子発現と細胞周期段階との相関は、がんのような過形成性疾患の動物モデルの解析において依然として課題である。この課題の一部は、増殖のマーカーを用いて目的タンパク質(POI)の共検出です。増殖細胞は、G1、S、G2、およびM.Ki67を含む様々な細胞サイクル段階で見つけることができ、増殖の最も一般的に使用されるマーカーの1つであり、細胞周期のすべての段階で発現される。それはヒトおよびマウス組織の両方の分析で広く使用されている^1,2,3.しかし、他の一般的な増殖マーカーと同様に、Ki67は個々の細胞周期相を識別しない。より正確なアプローチは、ブロモデオキシリジン(BrdU)のようなチミジンヌクレオチド類似体を、ゲノムを積極的に複製している細胞(すなわち、S相)4、5を使用する。ヌクレオチド類似体の使用に対する欠点の1つは、分析の数時間前に生きた動物に投与する必要があることです。Ki67およびBrdUは、抗体の使用によって固定組織切片で一般的に検出される。このアプローチの1つの利点は、POIの位置が組織アーキテクチャ(例えば、皮膚表皮の基底層)内で確認できることである。このアプローチはまた、遺伝子発現の変化につながる可能性のある組織解離を必要としない。1つの欠点は、OCT凍結またはパラフィン断面に対する組織の固定または処理が抗体標的(すなわち、抗原)を閉塞しうる点である。抗原の検索は、通常、熱または組織の消化を必要とします。染色強度の定量化も困難な場合があります。これは、染色、断面厚、信号検出、および実験者バイアスの変動によるものです。さらに、限られた数のマーカーは最も典型的な実験室のセットアップで同時に検出することができる。しかし、新しい多重染色アプローチは、これらの制限を克服することを約束します。例は、質量サイトメトリーおよびチラミド信号増幅6、7をイメージングしている。

フローサイトメトリーは、増殖細胞を検出するもう一つの強力な技術です。それは同じ細胞のマーカーの多重検出を可能にするが、ほとんどの非血行細胞タイプのための組織の解離を要求する。増殖細胞の分析は、DNAを結合する染料(例えば、ヨウ化プロピジウム(PI))8を使用することによって日常的に行われる。フローサイトメトリーはまた、BrdU組み込み9の検出と組み合わせた場合、細胞周期相のより正確な決定を可能^にする。強力なアプローチですが、BrdU/PIフローサイトメトリーには欠点があります。相特異的抗体を含まないと、G2/MおよびG0/G1相を解決することができません。しかしながら、使用できる抗体の数は、細胞の自己蛍光、蛍光色素放出のスペクトル波及、および補償制御の使用によって制限される。この制限は、POI を使用して細胞サイクル マーカーの発現を共に検出するのがより困難で手間のかかることをマークします。より表面的なアプローチは、質量サイトメトリー10、11を使用することです。この技術は、より狭い検出スペクトルを持つ金属共役抗体を使用しています。細胞が金属タグ付き抗体で染色されると、それらは気化され、細胞メトリー飛行時間(CyTOF)質量分析によって検出された金属。これらの特性により、質量サイトメトリーは、既存のプラットフォーム10、11を使用して>40の異なるマーカーの多重検出を可能にします。さらに、サンプル間染色の変動を低減しながら、貴重な抗体の節約につながる金属でサンプルをバーコードすることが可能です。一方、質量サイトメトリーにはいくつかの欠点がある。非血液由来細胞に対して市販の金属タグ付き抗体の数は限られています。DNA含有量の定量化は、蛍光DNA色素および質量サイトメトリーの使用に比べて感受性が低く、蛍光流細胞メトリーと比較して信号検出のダイナミックレンジが低下している。

ここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚から新たに単離されたケラチノサイト(KC)からの細胞周期ダイナミクスを分析し、質量サイトメトリーを用いてこれらの細胞における細胞周期特異的タンパク質発現を特徴付けることを目的とした。このプロトコルは、培養細胞と共に使用することも、他の細胞型に適合させることもできる。

プロトコル

コロラド大学アンシュッツ医科キャンパスの施設動物ケアと使用委員会は、このプロトコルに記載されている動物実験を承認しました。

1. 準備

1. 金属タグ付き抗体パネルを設計します。無料のオンラインパネル設計^{ソフトウェア12}を使用し、127イオドデオキシウリジン(IdU)、164 Dy(ジスプロシウム)ラベル付き抗CCNB1(CYCLIN B1)、175 Lu(ルテチウム)ホスホ(p)-HISTONEH3 ^{Ser28(pHH3)、}および150を含みます。 Nd (ネオジム)-pRETINOBLASTOMAタンパク質^Ser807/811 (pRB)¹³.チャネル^信号14に重ならない金属タグ付き抗体を追加する。
2. IdU ストック ソリューションを準備します。IdU粉末を0.1N NaOHで10mg/mLで60°Cで溶解する。アリコートIdUストック溶液をマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで凍結し、長期保存します。
   1. 使用直前に 12 N HCl で IdU 溶液の pH を 7.5 に調整します。廃棄アリコート上のpHストリップでテストし、溶液がpH 7.5であることを確認します。
      注:pH 7.5でのIdUの長時間(>5分)は降水量になり、これが起こるときはIdUの新鮮なアリコートが必要になります。
   2. 適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネなど)を使用し、NaOHまたはHClソリューションを取り扱う際は安全キャビネットで作業してください。
3. 2xパラホルムアルデヒド(PFA)固定液を調用する。10x PBS(pH 7.5)の5mLと16%PFAの1mLを純粋な分子グレードdH₂Oの44 mL(3.2%最終濃度)と組み合わせます。
   注:PFAの在庫は、以前に公開^された15として準備したり、汚染された金属を含まない16%の株式を購入することができます。
   1. PFA粉末および溶液を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を使用し、安全キャビネットで作業してください。
4. バリウム(Ba²⁺⁾を5mLの金属フリー10x PBS(pH 7.5)と純粋な分子グレードdH2 Oの45 mLを組み合わせて、バリウム(Ba 2+)を自由に1x PBSを調製します。
   注:PBSおよび他の試薬の品質は、質量サイトメトリックデータの分析中にバックグラウンドノイズを引き起こす可能性のある金属を汚染しないように非常に重要です。
5. 100mMシスプラチンストック溶液を準備します。DMSOの10 mLにシスプラチン粉末の300.5mgを溶解します。アリコートで-80 °C.1d以上使用する実験用に10mMシスプラチン作動液を調融する。
6. 表皮/真皮分離液を準備します。HBSSまたはPBSの1 mLで30mgを溶解することにより、20倍のディスパーゼストック溶液を調調します。フィルターは0.22 μmフィルターを通して殺菌し、-20 °Cでアリコートに貯える。HBSSで1mg/mLで1x型IVコラゲナーゼストック溶液を調製し、0.22 μmフィルターを通して殺菌し、アリコートを-20°Cで保存します。

2. IdUの定款によるS相のラベリング

1. マウスの重量を量る。P1-P3新生児の子犬または8-10週齢の成人マウスを使用し、C57BL/6、FvB、または129の背景から雄または雌のマウスを使用する。0.1 mg IdU (pH 7.5)/g 体重で用量を決定します。.たとえば、25 g マウスには 0.25 mL の IdU が必要です。
2. 経皮注射によるIdUの用量を投与し、細胞を収穫する前に2時間待つ。新生児の子犬を注入するためにツベルクリン注射器を使用してください。
   注:IdUの2mg/mLの用量は、質量サイトメトリーの収穫および標識の前に37°Cで1時間インキュベーションを有する組織培養細胞と共に使用することができる。

3. 標識用細胞の分離

1. 解凍ディスパーゼとコラゲナーゼストックソリューション。20倍のジスパーゼストック溶液を無菌HBSSまたはPBSで1x(1.5mg/mL)に希釈します。使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。
2. 2巻のディスパーゼと1巻のコラゲナーゼを組み合わせ、肌が自由に浮かべるトータルボリュームで。例えば、5つの新生児マウススキンの消化は、100mmペトリ皿に4mLのコラゲナーゼを含む1xディスパーゼの8mLに浮かべることができる。
3. 実験マウスを安楽死させる承認された方法に従ってください(例えば、イソファラン過剰摂取/つま先ピンチチェックまたはCO2吸入/頚部転位)。ヨウ素溶液で成人の耳の皮膚をきれいにし(材料の表を参照)、単離された細胞を組織培養に使用する場合は滅菌水で洗い流します。
4. ベースの耳を外科的に取り外します(図1A)。単離された細胞が組織培養に使用される場合に無菌PBSで耳をすすいでする。乾燥した100mmペトリ皿の上に置きます。
5. 最初に細かい鉗子を使用してカット領域の中央または端にポケットを作成し、2つの皮膚フラップを引き離すことによって、後部皮膚から慎重に前部を分離します(図1B-D)。 前皮と後部スキンの両方を続行します。
   注:新生児マウスの皮膚を解剖するための詳細な指示は、Litchi et al.¹⁶によって提供されています さらに、解剖範囲の使用は、後部皮膚からの前部の分離および解剖の表皮/皮膚側の同定に役立つ可能性がある皮膚:毛髪は表皮側に見えるが、真皮はゼラチン状の外観を持つ。
6. 耳の前皮と後部の皮膚を、皮膚の真皮側がジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液に触れ、慎重に置きます(図1E)。12ウェル培養プレートのウェルあたりの単一耳の前部および後部皮膚の両方に1 mLを使用します。37 °Cで1時間インキュベートする代わりに、1x dispase溶液上の浮遊皮膚を4°Cで16-18 h.³
   注:細胞を培養する場合は、無菌技術を用いた組織培養フードで作業する。
7. 消化した皮膚を表皮側がきれいなペトリ皿の表面に触れて置きます。皮膚を平らにし、円形のパターンで中心から端まで働くことによって表皮から真皮をそっと滑り落とす。
8. 真皮を捨てるか、さらに消化して組織培養または分析用線維芽細胞を解放^する16.
   注:真皮は外観が暗くなり、ゼラチン状と粘着性の組成物を持ちます。真皮は簡単に抜け落ちるだろう。真皮を除去する障害または困難は、組織消化が不十分を示唆している。しかし、消化バッファー内の拡張インキュベーションは細胞生存率を低下させる。表皮はペトリ皿に残り、漂白された外観を持つことになります。
9. 端をつかんで表皮をそっと持ち上げ、ペトリ皿の表面から剥がします。予め温められた細胞剥離液(材料の表を参照)に表皮を慎重に置き、RTで37°Cまたは20分で5分間、500 μLの細胞剥離液を使用して、12ウェル培養プレートの井戸あたり500 μLの細胞剥離液を使用し、750 μLの細胞剥離を使用します。 6ウェル培養プレートの井戸あたりの単一の新生児表皮のための解決。
10. 無菌鉗子を使用して表皮をつかみ、細胞を解離するために皿の底に表皮をドラッグしてスクラブします。1% FBS (0.01 mL) を含む DMEM の 1 mL を追加し、40 μm セルのふるいを集採取チューブに通過します。DMEMの追加の2 mLでよくすすいで、セルサスペンションに追加します。
11. 120 x gで5分間遠心分離機を慎重に上清を吸引する。
12. 1%FBSを含むDMEMの1-2 mLで細胞ペレットを再ステースする。トリパンブルーとヘモサイトメーターまたは自動計数装置を使用して、細胞数と細胞数%を決定します。ステップ3.11に記載されているペレット細胞。
    注:細胞は、ステップ3.12の後に適切な組織培養培地で培養することができる。^17歳

4. 生細胞/死細胞を決定するシスプラチン標識

1. 25 μMシスプラチン(2.5 μLのストック/mL)を含むDMEMの1mL当たり1-3 x 10⁶セルを再中断します。1分間インキュベートし、同じ体積のFBS(例えば1 mL)でピペッティングしてクエンチします。
2. 120 x gで5分間120 x gの遠心分離機を希釈漂白剤を含むビーカーに入れ、チューブを反転させ、残りの溶液をペーパータオルに排出する。チューブのペレットとサイドウォールに残っている溶液を解放するために穏やかにタップします。
3. Ba⁺²-フリーPBSの2 mLで細胞ペレットを再ステースする。ステップ4.2で説明したペレット細胞。
   注:細胞がすぐに染色できない場合は、細胞を固定することをお勧めします。

5. シスプラチン標識細胞の固定化(オプション)

1. Ba^+2-フリーPBSの1mLで1-3 x 10⁶シスプラチン標識細胞を再中断する。連続的な低電力下の渦セルを、2x PFA固定バッファのドロップワイズ1 mL(1体)を追加します。ロッキングプラットフォームで10分間RTでインキュベートします。
2. ステップ4.2に記載されているペレット細胞は、5分間500xgで遠心分離する。
3. ステップ5.2に記載されているように、Ba⁺²-フリーPBSおよびペレット細胞の2 mLで細胞を洗浄する。手順 5.3 を 1 回繰り返します。
4. Ba⁺²-フリー PBS の 2 mL でペレットを再中断します。<3 d. FBS を 3% (例えば、セルの 0.3 mL) に追加し、>3 d を長く保存する場合は、-80 °C で混合して凍結します。
   注:固定は、特定のエピトープの検出に影響を与える可能性があります。抗体シグナルに対する固定の効果は、経験的に決定する必要があります。

6. サンプルのバーコード(オプションですが推奨)

1. ステップ5.2で説明したペレットセルを、1x固定バッファーの1mLで1-3 x 10^6細胞を再中断する(材料の表を参照)。ステップ5.2で説明するように、RTで10分間ペレット細胞をインキュベートする。
2. バーコード透過性バッファーの1 mLで細胞を洗浄する(材料の表を参照)。ステップ 5.2 で説明するペレット セル。手順 6.2 を 1 回繰り返します。
3. バーコードに100 μLのバーコード透過性バッファーを追加し(材料の表を参照)18を追加し、ステップ6.2の細胞がペレット化している間すぐに混ぜます。
4. 800 μLのバーコード透過性バッファーで細胞ペレットを再ステーペンドします。ステップ5.2で説明するように、細胞にバーコード溶液を追加し、RTで30分間ペレット細胞を混合してインキュベートします。細胞染色バッファーの2 mLで細胞を洗浄し(材料の表を参照)、ペレットを再び。
   注:最大20個のサンプルは、パラジウム^金属18の様々な組み合わせで標識することができます。その他のバーコード戦略については、他の場所^{で説明されています 15}.

7. 質量細胞メトリーのための細胞の標識

1. 核抗原染色バッファー作動溶液の1mLで1-3 x 10^6細胞を再中断する(材料の表を参照)。バーコードされたサンプルを使用する場合は、後続の手順のためにサンプルを単一のチューブに結合します。ステップ5.2で説明されているように、RTで30分間ペレットをインキュベートします。
2. 核抗原染色透過透過性バッファーの2 mLで1-3 x 10^6細胞を再中断する(材料の表を参照)。必要に応じてスケールします。たとえば、セル数が 9 x 10⁶セルの 10 サンプルの組み合わせサンプルには、6 mL のバッファーを使用します。ステップ 5.2 で説明したペレット。
3. 手順 7.2 を繰り返します。チューブに残った残留体積の細胞ペレットを穏やかに渦にする。
4. 1-3 x 10⁶細胞あたり50 μLの細胞内抗体カクテルを加える。必要に応じてスケールします。例えば、9 x 10⁶細胞の細胞数を持つ10の組み合わせサンプルに対して、150 μLの抗体カクテルを使用します。RTで45分間混合してインキュベートし、ステップ5.2に記載されているように、細胞染色バッファーとペレットの2 mLを追加します。
5. 細胞染色バッファーの2 mLで1-3 x 10⁶細胞ペレットを再中断する。ステップ 5.2 で説明するペレット セル。手順 7.5 を 1 回繰り返します。
   注:他の緩衝液は、細胞外膜または細胞質マーカーの染色に使用することができ、実験者は、異なる細胞位置でエピトープを検出する必要がある場合に染色を最適化する必要があります。細胞は、染色のために生細胞を使用する場合、ステップ7.5後にPFAで固定することもできる。
6. インターカレーション溶液の1 mLで1-3 x 10^6セルを再中断し、4°Cで1-3 d用に保存します。
   1. 細胞がインターカレーション溶液中にある場合は、ステップ5.2で説明したように>3 d. ペレット細胞の溶液を含むDMSOで-80 °Cで細胞を保管する。ステップ5.2に記載されているように、細胞染色バッファーおよびペレット細胞の1mLにおけるペレット(1-3 x 10⁶細胞)を再中断する。10%DMSO/90%FBS¹⁹の1mLでペレットを再サスペンドし、凍結に移し、イソプロパノール凍結容器に入れ、-80°Cで保存する。
7. ステップ 5.2 で説明するペレット セル。1-3 x 10⁶細胞を2mLの細胞染色バッファーで洗浄し、ステップ5.2に記載のペレット化する。ステップ 5.2 で説明したように、2 mL の水で 2 つの追加の洗い流しを実行します。
8. 希釈EQキャリブレーションビーズ1:9水中(ストック溶液3.3 x 10⁵ビーズ/mL)。
9. 希釈EQビーズ溶液で1 x 10⁶細胞/mLの濃度で細胞ペレットを再中断する。35 μmのストレーナーキャップフローチューブを通して細胞をフィルタリングします。
10. 質量サイトメーターでサンプルを実行し、データを取得します。データはフローサイトメトリー標準(FCS)ファイル形式でデポジットされます。

8. 大量サイトメトリーデータファイルの処理と分析

1. FCS ファイルを正規化します。^{20https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest}で利用可能な無料プログラムを使用してください
2. デコンボルトバーコードFCSファイル。プールされたバーコードの人口を別々のバーコードファイルに分け、18https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latestで利用可能な無料プログラムを使用します。
3. 正規化された FCS ファイルを分析します。商用21、22^またはフリーウェア プログラムを使用します (web.stanford.edu/group/nolan/resources.html参照)。

結果

表1は、成人マウス耳(図1)および非病理学的条件下での新生児皮膚からの期待される細胞収量および生存率を示す。この表は、混合C57/126の背景からの動物の代表的なデータも示しています。他の株の皮膚は、同様の細胞収率と生存率をもたらすことが期待されます。おおよその収量は皮膚の表面積に依存し、新生児の皮膚がより多くの細胞を必要とする実験のためのより良い選択であることを示す(表1)。低収率または生存率の低下 (<50%)皮膚の完全性を低下させるか、細胞死を誘発する消化または実験条件の問題を示すだろう.適切な培養剤およびサプリメントを用いて細胞を培養することは、KC^製剤17の品質を評価するのに役立つ。

FCSファイルの正規^化20および...

ディスカッション

このホワイト ペーパーで概説されているプロトコルは、約 8 時間で完了できます。その結果、細胞周期依存的な方法でタンパク質発現を分析できる、KCで濃縮された細胞の懸濁液が得られます。いくつかの以前の研究は、ヒトおよびマウスの皮膚からKCを分離する方法を概説している^16,25.これらの研究には、フローサイトメ^トリー26のためのKCの分離のためのプロトコルも含まれる。しかし、CSの単離と質量サイトメトリーを用いられたタンパク質発現および細胞周期ダイナミクスの分析を組み合わせた詳細なプロトコルは、これまで説明されていない。

このプロトコルで高品質の結果を得るための最大のハードルは、使用される生細胞の品質です。文献では、表皮/真皮分離のための推奨条件および酵素は、16、25、26、27と大きく異なる。^...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	Cell Treat	229512
Intercalator solution	Fluidigm	201192A	125 µM - Irインターカレーター溶液
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	30525-89-4	16 % PFA
ストレーナーキャップフローチューブFisher	/Corning	352235	35 & micro;m孔径
セルシーブ	フィッシャー	22363547	40 μm孔径
細胞除去溶液	CELLnTEC	CnT-ACCUTASE-100	アキュターゼ
ヨウ素溶液	ThermoFisher/Purdue	67618-151-17	ベタジン 7.5%-ヨウ素外科用スクラブ
バーコード透過化バッファー	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex PD バーコード
キット バーコード	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex Pd バーコード キット
pH ストリップ	EMD	9590	colorpHast
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Dulbecco's修正イーグルメディア
ファイン鉗子	デュモン&Fils	0109-5-PO	Dumostar #5
湾曲した精密鉗子	Dumont &Fils	0109-7-PO	Dumostar #7
Calibration Beads	Fluidigm 201078		EQ Four Element Calibration Beads
HBSS	Gibco	14175-095	Hank's Balanced Salt Solution
Water	Fisher	SH30538.03	Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine	Sigma	I7125	IdU
クライオバイアル	ThermoFisher	366656PK	内部スレッド
細胞染色バッファー	Fluidigm	201068	Maxpar 細胞染色バッファー
固定 &パーマバッファー	Fluidigm	201067	Maxpar Fix &パーマバッファー
フィックス I バッファー	Fluidigm 201065		Maxpar フィックス I バッファー
リン酸緩衝生理食塩水	ロックランド	MB-008	メタルフリー 10x PBS
イソプロパノール凍結容器	サーモフィッシャー	5100-0001	Mr.Frosty
水酸化ナトリウム	フィッシャー	BP359-500	NaOH
ペトリ皿	コード・バルマーク	2900	ジェネシー32-107 によって供給されます。
15 mL コニカル	Olympus/Genesee	28-101
50 mL コニカル	オリンパス/ジェネシー	28-106
6 ウェルプレート	Cell Treat	229506
シスプラチン	シグ	479306
ディスパーゼ II	Sigma/ロシュ	4942078001
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
塩酸	フィッシャー	A144-212
核抗原染色  透過化緩衝液	Fluidigm	201063
核抗原染色緩衝液	Fluidigm	201063
トリパンブルー		Sigma T8154
ツベルクリン注射器	BD	309626
IV型コラゲナーゼ	ワージントンバイオサイエンス	CLSS-4