単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Summary

3D単分子局在顕微鏡は、生きた細菌細胞における蛍光標識タンパク質の空間位置および運動軌道をプローブするために利用される。本明細書に記載される実験およびデータ分析プロトコルは、プールされた単一分子軌道に基づいてサイトソリックタンパク質の一般的な拡散挙動を決定する。

Abstract

単一分子局在顕微鏡は、数十ナノメートルの空間的およびミリ秒の時間分解能を有する生細胞における個々の分子の位置と動きを調べた。これらの機能により、単分子局在顕微鏡は、生理学的に関連する環境での分子レベルの生物学的機能の研究に最適です。ここでは、単一分子トラッキングデータの取得と処理/分析の両方のための統合プロトコルを示し、目的のタンパク質が示す可能性のある異なる拡散状態を抽出する。この情報は、生細胞における分子複合体形成を定量化するために使用することができる。カメラベースの3D単一分子ローカリゼーション実験の詳細な説明と、個々の分子の軌跡を生み出すその後のデータ処理ステップについて説明します。これらの軌道は、数値解析フレームワークを使用して分析され、蛍光標識分子の一般的な拡散状態とこれらの状態の相対的な豊富さを抽出します。解析フレームワークは、任意のセル ジオメトリによって空間的に限定される細胞内ブラウン拡散軌道の確率シミュレーションに基づいています。シミュレートされた軌道に基づいて、生の単一分子画像が実験画像と同じように生成され、解析されます。このように、実験的に校正するのが難しい実験精度と精度の制限が、解析ワークフローに明示的に組み込まれます。一般的な拡散状態の拡散係数と相対母率は、シミュレートされた分布の線形組み合わせを使用して実験値の分布を適合することによって決定されます。我々は、細菌病原体のサイトソールにホモとヘテロオリゴマー複合体を形成する際に異なる拡散状態を示すタンパク質の拡散状態を解明することにより、我々のプロトコルの有用性を実証する。

Introduction

生体分子の拡散的な挙動を調べることは、その生物学的機能に関する洞察を提供する。蛍光顕微鏡ベースの技術は、生体分子をネイティブの細胞環境で観察するための貴重なツールとなっています。光漂白後の蛍光回収(FRAP)および蛍光相関分光法(FCS)1は、アンサンブル平均拡散行動を提供する。逆に、単一分子局在化顕微鏡は、高い空間および時間分解^能2、3、4を有する個々の蛍光タグ付き分子の観察を可能にする。目的のタンパク質が異なる拡散状態に存在する可能性があるため、個々の分子を観察することは有利です。例えば、大腸菌のCueRのような転写レギュレータがサイトゾルで自由に拡散したり、DNA配列に結合したりすると、2つの容易に区別可能な拡散状態が生じ、測定5のタイムスケールで固定化^される5.単一分子トラッキングは、これらの異なる状態を直接観察するためのツールを提供し、それらを解決するために高度な分析は必要ありません。ただし、拡散率が類似している場合は、複数の拡散状態とその母集団の割合を解決することがより困難になります。例えば、拡散係数の大きさ依存性のために、タンパク質の異なるオリゴマー化状態は、異なる拡散状態6、7、8、9として現れる

Protocol

1. 二重らせんポイントスプレッド関数キャリブレーション

注:本および以下のセクションで説明する画像は、Rocha et al.²³に記載されているように、カスタム構築された反転蛍光顕微鏡を使用して取得される。同じ手順は、単一分子局在化および追跡顕微鏡^{検査2、3、4}用に設計された異なる顕微鏡実装^に適用可能である。この資料に記載されている画像取得およびデータ処理用のすべてのソフトウェアが利用可能です (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git)

1. 顕微鏡下で見られるガラスカバースリップにサンプルを取り付けるためのアガロースパッドの準備。
   1. M2Gバッファーの5mLに重量低融点アガローズ1.5-2%を加えます(4.9 mM Na₂HPO 4、3.1 mM KH₂PO_4、7.5mM NH₄Cl、0.5 mM MgSO 4、10 μM FeSO_4、0.5

Results

ここで説明する実験条件(20,000フレーム、軌道長最小4局在)および蛍光標識融合タンパク質の発現レベルに応じて、約200〜3,000の局在化が10〜150を生み出す軌道は、セルごとに生成することができます (図 2a, b)。見かけの拡散係数の十分にサンプリングされた分布を生成するには、多数の軌道が必要です。ここで収集されるFOVのサイズは~55 x 55 μmで、実験ごとに10FOVを収集します。したがって、実験ごとに>5,000の軌道を得るためには、各FOVは少なくとも50個の細胞を含む必要があります。理想的には、細胞集団は可能な限り高密度にする必要がありますが、細胞が互いに接触し合うことなく。セル密度が高すぎる場合、データ後処理で説明されているように、セルに接触または重なり合うセルが存在すると、OUFTI(²⁸⁾を使用してセルを正常にセグメント化することが困難になります。セグメンテーションが不十分な場.......

Discussion

提示されたプロトコルの正常な適用のための重要な要因は、単一分子信号が互いに十分に分離されていることを確認することです(すなわち、それらは空間と時間内にまばらである必要があります(補足Mov. 1)。細胞内に複数の蛍光分子が同時に存在する場合、局在化が別の分子の軌道に誤って割り当てられる可能性があります。これをリンク問題³⁰と呼ぶ。タンパク質発現レベルや励起レーザー強度などの実験条件は、リンクの問題を回避するために選択することができる。しかし、代表的な結果を確実にするためには、野生型タンパク質発現レベルを得るために注意が必要です。ここでは、化学的に誘導可能な発現の代わりに天然プロモーターの制御下でアレリック置換を使用し、標識タンパク質のネイティブ発現レベルを確保しました。これにより、励起レーザー強度(eYFP点滅用)または活性化レーザー強度(光作動可能蛍光プローブ用)を使用して、時間内の活性エミッタの濃度を制御することができる。あるいは、化学色素標識がHALOおよびSNAP^{タグ31、32}<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-ジアミノピメリック酸	Chem Impex International	5411	Y. enterocolitica細胞の増殖に必要です。
4fレンズ	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm、2インチ
514nmレーザー	Coherent	Genesis MX514 MTM	蛍光励起
アガロース	Inivtrogen	16520100	顕微鏡に液体細菌サンプルを取り付けるためのゲルパッドを作るために使用されます。
塩化アンモニウム	グマアルドリッチ	A9434M2G	成分。
バンドパス	フィルターChroma	ET510/bp	起経路。
脳心臓注入	シグマアルドリッチ	53286	Y.エンテロコリティカの成長培地。
塩化カルシウム	シグマ アルドリッチ	223506	M2G成分。
カメラ	イメージングソース	DMK 23UP031	位相差イメージング用カメラ。
誘電体位相マスク	Double Helix, LLC	N/A	DHPSF信号を出力します。
リン酸二ナトリウム	シグマアルドリッチ	795410M2G	成分。
エチレンジアミン四酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	S311-100	キレートCa2 + < / sup>。T3SSに分泌を誘導します。
フリップミラー	ニューポート	8892-K	蛍光経路と位相差経路の切り替えが可能です。
fluospheres	Invitrogen	F8792	蛍光ビーズ. 540/560 励起および発光波長. 直径 40 nm.
ガラスカバースリップ	VWR	16004-302	#1.5、22mmx22mm
グルコース	Chem Impexインターナショナル	811	M2G成分。
イマージョンオイル	オリンパス	Z-81025	物レンズに載せます。
硫酸鉄(II)	シグマ・アルドリッチ	F0518	M2G 成分。
ロングパス	フィルターSemrock	LP02-514RU-25	発光経路。
硫酸マグネシウム	フィッシャーサイエンティフィ	ックS25414A	M2G成分。
顕微鏡プラットフォーム	Mad City Labsの	倒	立顕微鏡用カスタムプラットフォーム。
ナリジキシン酸	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica細胞はナリジクス酸に耐性があります。
対物レンズ	オリンパス	1-U2B991	60X, 1.4 NA
オゾンクリーナー	ノヴァスキャン	PSD-UV4	ガラスカバースリップの背景蛍光を除去するために使用されます。
リン酸カリウム	シグマアルドリッチ	795488	M2G成分。
赤色LED	Thorlabs	M625L3	、位相差イメージング用のサンプルを照らします。
sCMOSカメラ	浜松ホトニクス	オルカフラッシュ4.0 V2	カメラ。
ショートパスフィルター	Chroma	ET700SP-2P8	発光経路。
結像レンズ	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	ひずみ AD4442, eYFP-YscQ
ゼロ次 1/4 波長板	Thorlabs	WPQ05M-514	励起経路.