モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル

Summary

穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。

Abstract

細胞内および細胞外の機械的刺激(または力信号)の両方に応答し、特別な形態変化を開発する植物は、チグモルフォジェネシスと呼ばれる。過去数十年にわたり、いくつかのシグナル伝達成分が同定され、メカノトランスダクション(例えば、カルシウムイオン結合タンパク質およびジャスモン酸生合成酵素)に関与していると報告されている。しかし、力シグナル伝達またはチグモルフォ形成の研究における研究の比較的遅いペースは、主に2つの理由に起因する:チグモルフォジェネシスの手で操作されたタッチ誘導の面倒な人間の要求と力強度誤差人の手触りに関連付けられています。植物生物の外力負荷の効率を高めるために、自動タッチフォースローディングマシンを構築しました。このロボットアーム駆動ヘアブラシタッチは、省力で簡単に再現可能なタッチフォースシミュレーション、タッチ繰り返しの無制限のラウンドと調整可能なタッチ強度を提供します。この毛髪タッチフォースローディングマシンは、タッチフォースシグナリング変異体の大規模スクリーニングと植物チグモルフォジェネシスのフェノミクス研究の両方に使用することができます。また、人間の毛髪などのタッチ素材は、動物の毛髪、絹糸や綿繊維などの他の天然素材と置き換えることができます。機械の自動移動腕は、それぞれ雨滴と風の自然な力を模倣するために、水振りノズルと空気送風機を装備することができます。この自動ヘアタッチフォースローディングマシンを手で行った綿棒タッチと組み合わせて、M AP KINASE KINASE 1(MKK1)とMKK2プラントの2つの力シグナリング変異体のタッチ応答を調べました。.タッチフォースロード野生型植物と2つの変異体のフェノームを統計的に評価した。彼らはタッチ応答に大きな違いを示した。

Introduction

植物チグモルフォジェネシスは、1973年1月にJaffe、MJによって造られた用語です。これは植物のトロピズムですが、太陽光や重力^の刺激によって引き起こされるよく知られた光トロピズムや重力とは異なります 2,³.これは、初期の時間4、5で植物学者によって頻繁に観察されている周期的な機械的刺激に関連する表現力学的変化について説明する。雨滴、風、植物、動物および人間の接触、動物咬傷であっても、植物4、5における力シグナル伝達を引き起こす異なるタイプのメカノ刺激であると考えられている。植物のチグモルフォジェネシスの特徴は、ボルト締めの遅れ、より短い茎、草本植物におけるより小さいロゼット/葉のサイズ、および木質植物6、7、8の厚い茎を含む。これは、ミモザ植物または他のメカノ感受性ブドウによく見られるチグモナスチックまたはチグモトロピック応答とは異なり、これらの急速なタッチ応答は1、9、10を観察することが容易である。一方、チグモルフォジェネシスは、成長応答が遅いため観察が比較的困難である。チグモルフォジェネシスは、通常、数週間または連続的な力負荷刺激の後に観察されます。植物のタッチ応答のこのユニークな性質は、強い方法でタッチフォースシグナリング耐性変異体を分離するために、人間の手のタッチ刺激を使用して前方遺伝スクリーンを実行することが困難になります。

チグモルフォジェネシス6、11の根底にある力信号伝達経路および分子機構を解明するために、過去6、^{分子および細胞生物学的実験が行われてきた。12,13,14}.これらの研究は、植物力シグナル受容体が主にメカノ感受性イオンチャネル(MSC)と膜スパンタンパク質の多重体複合体によって構成されるテザリングMSC複合体で構成することを提案している^11,14,15.最初のタッチの数秒以内に生成された細胞質Ca²⁺過渡スパイク。風、雨、または重力刺激は、下流のカルシウムセンサと相互作用して、力信号を核イベント14、16、17、18に伝達してもよい。分子および細胞の研究に加えて、植物の手動指触りを持つ前方遺伝スクリーンは、植物ホルモンおよび二次代謝産物が、その後のタッチ誘導性(TCH)遺伝子発現に関与していることを発見した。タッチフォースローディング^13,19.例えば、aosおよびopr3 ²⁰変異体は、遺伝的研究から遠く離れて同定されている。しかし、チグモルフォジェネシスの研究における前方遺伝学の適用に関連する主な問題は、タッチ応答のレベルを定量化し、遺伝的に変異した多数の集団に触れるのに必要な集中的な労働である。個々の植物。時間のかかる問題は、手触りベースの変異スクリーン14、20にも持続します。例えば、タッチフォース刺激の1ラウンドを完了するには、人は個々の植物で30〜60回(毎秒1タッチ)に触れる必要があります。統計的表現型解析に十分な数の植物を持つためには、通常、タッチフォースローディングプロセスには、同じ遺伝子型の20~50個の植物が必要です。このタッチフォースローディング体制は、人が選択した1つの遺伝子型に対して600-3,000タッチを繰り返し実行する必要があることを意味します。このタイプのタッチは通常、1日に3〜5ラウンド繰り返す必要があり、これは植物の遺伝子型ごとに1日あたり約1,800〜15,000本の指または綿棒のタッチに相当します。十分な訓練を受けた人は、通常、力と強度の大きな変動を避けるために、1日の繰り返しの多くのラウンドを通じて、望ましい範囲内で複数のタッチの強さと力を維持するために必要とされます。チグモルフォジェネシスが飽和性および用量依存性プロセス6、21であることがよく知られているように、タッチ力/強度は、植物のタッチ応答をトリガすることに成功するために重要になります。

人依存のタッチフォース負荷を除去し、許容^{誤差範囲内で}機械的な適用を維持するために、我々は、したがって、手操作タッチを置き換えるために自動タッチフォースローディングマシンを設計しました。機械に4つの動く腕が造られて、それぞれ1つの人間の毛のブラシが装備されている。このバージョンは、人間の髪のタッチフォースローディングの特徴を指定するためにモデルK1と名付けられています。1台の機械下でのチグモ形態形成またはタッチ応答に対して4つの遺伝子型を定量的に測定すれば、遺伝子型当たり40~48個個体を測定することができます。タッチ繰り返しの各ラウンド(植物あたりのタッチの60回未満)は、移動速度調整可能なロボットアームを使用して5分未満持続します。したがって、モデルK1タッチマシン上の植物は、最初にプログラムされた一定のタッチフォース負荷または異なるレベルの強度を持つ1日に複数のラウンドのために機械的に刺激することができます。

したがって、モデル植物生物であるアラビドプシス・タリアナは、全自動ヘアタッチフォースローディングマシンアプリケーションをテストするためのターゲット植物種として選ばれました。変異体の様々な胚芽と開花の大きさを取り出すために利用可能ないくつかの大きな種子バンクがあるので、アラビドプシスは、モデルK1タッチマシンに取り付けられた成長棚で利用可能なスペースによくフィットします。

モデルK1自動タッチマシンは、(1)2つのベルト駆動リニアアクチュエータで構成されるH字型金属ラック、(2)ヘアブラシを装備したロボット金属アーム、(3)コントローラーの3つの主要コンポーネントで構成されています。カスタマイズされたモデルK1タッチマシンの場合、各X/Y軸モジュールは、1つのベルト駆動ガイドレール、2つのスライドブロック(赤)、1つの57ステッパーモータ(プリインストールおよび取り外し可能)で構成されています(図1A、B)。上部の水平アクチュエータは、ロボット金属アームを左右水平に動かすことを可能にし、下部垂直ベルト駆動の線形アクチュエータは、ロボット金属アームを垂直に上下に動かすことを可能にします(図1B、図2 A)).垂直アクチュエータには4本の取り外し可能なロボットアームが取り付けられました(図1C、図2B)。4本のヒト毛ブラシをそれぞれ4本のロボットアームに結合した(図1C、図2B)。下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを構築するすべての機械部品は、図1Cにマークされています(また、材料の表を参照してください)。

Protocol

1. 種子の準備

注:野生型(Col-0)とmkk1およびmkk2機能喪失変異体の両方のアラビドプシス種子は、アラビドプシス生物資源センター(ABRC、https://www.arabidopsis.org、コロンバス、オハイオ州)から購入した。

1. 信頼性の高い統計分析に使用される各遺伝子型の植物個体数を計算します。各ラインの発芽率に基づいて十分な数の種子を準備し、通常は実験に必要なものよりも4〜5倍多く。健康で均一なサイズの植物の十分な数をタッチ応答アッセイに使用できることを確認します。このプロトコルによれば、遺伝子型当たり300〜500種子は、通常、同様のサイズの80〜90植物を生産するために使用される。
2. 冷たい水に種子を浸し、種子浸漬のために4 °C(暗く保つためにアルミ箔で覆われた)にそれらを保存します。浸漬の5-7日後に種子をまきます。

2. 植物の成長

1. 植物の成長に適した土壌を選択します(材料表を参照)。大きな塊を避け、均質にそれらを混ぜます。
2. 24個のプラスチックカップを準備する:保持容量は207 mLで、上部の縁の直径は7.4センチメートルです。
3. 混合土壌でこれらのプラスチックカップを埋めます。カップリムより1~2cm高く積み重ねて、積み重ねた土の表面を柔らかく平らにしましょう。
4. 24カップをプラスチックトレイ(21インチ×10.8インチ×2.5インチ)に移し、一定の光条件下にトレイを置きます(下記参照)。
5. 種子播種の2時間前に各トレイに2.5Lの水を加えます。カップの底にある穴から水を吸収し、土の表面がカップリムレベルに落ちるのを待つために土壌をしましょう。
6. 3-4種子を単一の場所に種をまき、カップ内に4つの均等に分散したスポット。
7. 各トレイの上に透明なプラスチックカバーを置き、種子を1週間発芽させます。その後、カバーを削除し、苗が別の週のために成長できるようにします。
8. 間引きによって余分な植物を削除し、種子播種後9-10日、各カップで同様のサイズの4植物の個体を保ちます。
9. 種子が発芽した後、1日おきに1.5Lの水で植物を灌漑します。

3. 成長条件

1. 成長室の温度を23.5±1.5°C、湿度35~45%に設定します。
2. 180 ~ 240 μE∙m-2°S^-1 (IL 1700研究放射計、国際光)¹⁴の間の光強度を設定します。光合成活性放射は90~120 μE∙m-2°S-1です。
3. 光条件を 24 h 定数に設定します。

4.タッチフォースローディングマシンの構築

注:このロボットヘアタッチフォースローディングマシン(モデルK1)は、タッチフォースシグナリング変異スクリーニングと植物チグモルフォジェネシス生成の両方の目的を果たすように設計されています(図1、図2)。

1. プレインストール モジュール (マウント解除、図 1C)
   1. 2 つのスライド ブロック (I)と 1 つの57 ステッパー モータ (II)を X/Y 軸ガイド レール モジュール(III/V)に取り付けます。
   2. X/Y 軸補助桁(IV/VI)に 2 つのスライド ブロック (I)を取り付けます。
2. その他の機械部品の取り付け (図 1C)
   1. ガイドレールの両端に2つのジャンクションプレート(VII)を組み立て、X軸ガイドレールモジュール(III)とX軸補助桁(IV)を一緒に固定します。
   2. Y軸ガイドレールモジュール(V)を2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。
   3. Y軸補助桁(VI)を他の2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。
   4. ロボットアーム(IX)のホルダーを2つのスライドブロック(Y軸)の前面にジャンクションプレート付きの交差位置に組み立てます(図2A)。
   5. クランプ付きロボットアーム(IX)に4本のヘアブラシ(X)を組み立てます(図2B)。

5.タッチフォースローディングマシン設定

注:下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを設定するための制御パラメータはすべて、コントロールパネル(図2F)に示されています。

1. ロボットアームにタッチヘアブラシを取り付けます。330 mm の長さのスチール ルーラーをホルダーとして使用して、人間の髪の 1 つの層(3,600~4,600 本のヘア/ブラシ)を均等に固定します。髪の長さは126mm(図1C)です。
2. これらのスチールルーラーを 2 つの金属クランプでロボットアームに固定します。
3. 最初に垂直寸法(Y軸)に沿ってマシンアームの高さを設定します。ジョグ F+を押して上げ、ジョグ R-を押してロボットアームとブラシを下げます。ヘアブラシの先端をカップリムより0.5cm低くします。ゼロセットを押します。すべての植物の個人が触れていることを確認するためにマシン1-2サイクルを事前に実行します。タッチ期間中、ブラシとヘアチップを毎日同じ高さに調整し、調整します。
4. 電子スケールを使用してタッチフォース(垂直ローディング)を測定し、タッチフォースレベルを1-2 mN¹⁴で維持します。
5. 水平寸法(X軸)に沿った機械アームの開始位置を手動で設定します。ヘアブラシを各トレイの端に掛け、触れる実験が始まる前に植物が触れていないことを確認します。ジョグF+/ジョグR-を押して、マシンアームを少しずつ水平に動かして開始位置を設定します。
6. 移動ボタンを押して、ヘアブラシの移動距離を水平寸法(X軸)で365mmに設定します。プレス株式会社F+/Inc. R-は、完全な移動距離を取得し、すべての処理された植物が全体の接触実験中に触れていることを確認するために、マシンアームを移動します。
7. 自動速度ボタンを押して、マシンアームのX軸に沿った移動速度を5,000mm/minに設定します。タッチ実験全体で同じ移動速度を維持します。
8. マイナーサイクルボタンを押して、20回のトライアルでタッチタイムを設定します。タッチ実験全体の間にラウンドあたりのタッチ数を同じにしてください。
   注:1マイナーサイクルは2つの移動距離に等し、マシンアームが開始位置から終了位置に移動し、開始位置に戻ることを意味します。1つのマイナーサイクルは2つのタッチを生成します。ヘアブラシは20回の試行内で植物に40回触れる(2タッチ×20トライアル=40タッチ)。40タッチは、タッチフォースローディングの1ラウンドであると定義されています。
9. メジャー期間ボタンを押して、タッチラウンドの繰り返し間隔を1日あたり480分に設定します。タッチ実験全体の間、タッチラウンドの同じ頻度を維持します。
   注:これは、ヘアブラシが1日3ラウンドの植物に触れ、各ラウンド間の間隔時間は480分(8時間)です。表示される青色の数字は、各タッチラウンドの間隔時間を表します。マシンは、下のカウントダウン(赤い数字)が0000に変わると、自動的にタッチの新しいラウンドを開始します。
10. メジャーサイクルを12回のトライアルで設定すると、機械は4日間以内に12ラウンドのプラントに自動的に触れます。この 12 の試行の設定は、タッチの日をスキップする人為的なエラーを回避するために使用されます。
11. 開始ボタンを押して、あらかじめ設定されたプログラムを開始します。モデルK1タッチマシンは、自動的に設定に応じてタッチフォースロードを実行します。

6. 生理学的データ収集・分析

1. ボルト締めまでの日数: 触れる実験の中で、各プラントのボルト締結日を個別に記録します。ボルト締めは、植物が成長期を栄養相から生殖段階に変化させるシンボルです。アラビドプシスでは、ボルト締結日は、植物が最初の花序の茎の長さが1cmに達するために使用される日数として定義されます。
   注:上記の成長条件下では、野生型植物のボルト締めは通常、種子播種後19日から23日に開始し、28-32日で終了します。
2. ロゼット半径:ロゼットの中心から最も長い葉の先端までの距離を測定します。
   1. 上からトレイ全体の写真を撮ります。対照群とタッチ処理グループの写真を別々に撮ります。
   2. 適切なソフトウェアをダウンロードします。たとえば、無料でダウンロードしたソフトウェアImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) を使用します。
   3. 写真ファイルを開き、ズーム機能を使用して写真を適切なサイズにズームします。
   4. ロゼットの中心と最も長い葉の先端の間に直線を描画するには、[直線]ツールを選択して、ロゼット半径を測定します。
   5. 1つのプラントを選択し、左ボタンを押して、ロゼットの中心から最も長い葉の先端に直線を描きます。
   6. 分析測定機能を選択するか、Ctrl + Mキーを押して線の距離を分析します。
   7. 1 つのカップを選択し、前の 2 つの手順を繰り返して、各プラスチック カップの直径を同時に分析します。これらのデータを使用して計算を実行し、写真撮影によるバイアスを排除します。
      注: 方程式は次のとおりです。
      R_a/D_a = R_m/D_m
      (R_a, 植物の実際のロゼット半径;D_a, プラスチックカップの実際の直径;R_m, ソフトウェアによって決定された同じプラントの測定ロゼット半径;Dm、同じ植物を栽培するために使用されるプラスチックカップの測定直径)
3. ロゼット面積:ロゼットの葉の水平2次元表面積を測定します。
   1. ロゼット器官の残りの部分に影響を与えることなく、花序を削除します。
   2. 近くに配置されたスケール定規と一緒に各植物の上部から写真を撮ります。
   3. ImageJ、ロゼットトラッカーの1つの無料プラグインを使用し、以前に公開されたプロトコルに従ってください^22.

Results

自動ヘアタッチフォースローディングマシン
植物の形態変化を観察するためには、再現可能な成長条件と治療方法の両方が反復可能な結果を得るための鍵となります。このハイスループットと自動タッチフォースシグナリング変異スクリーニングは、新たに構築されたヘアタッチフォースローディングマシン、モデルK1(図1、図2)によって達成されます。これらのヘアブラシは、同時に植物の最大4トレイに触れることができます。トレイに24杯入れられ、12カップの植物が対照植物と処理植物の両方として使用されたグループ(図2C,D)。各カップで、4つの植物が栽培され、合計48以下の植物の個体が同じヘアブラシに触れられ、後の統計分析に十分な植物を保証します。植物の最大4つのゲノムタイプは、1つのモデルK1タッチマシンで同時にタッチ処理することができます。チグモルフォジェネシスは用量依存性6、21であるため、重要なポイント

Discussion

チグモルフォジェネシスは、細胞シグナル伝達と植物ホルモンの作用のネットワークを含む機械的摂動に対する複雑な植物成長応答である。それは望ましくない環境条件の下で生き残るために植物の適応進化の結果である^25,26.機械的な接触、特に人間の指のタッチおよび手持ち型綿棒タッチは、以前のチグモ形態遺伝学的研究14、20におけるこの形態学的変化を研究するために選択されている。植物の接触応答をトリガするタッチフォースローディングのこの簡素化されたバージョンは、制御し、適用することが容易です。さらに、このタイプのタッチフォースローディング方法は、自然環境19で生成される風および雨滴滴刺激力信号を何らかの方法で模倣することができる。タッチ力は、カルシウムスパイクを引き起こすことができる、タンパク質リン^酸化14および下流遺伝子発現...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4本のヘアブラシカスタマイズ
1つのホルダー			長さ1000mmのホルダーと長さ560mmのロボットアーム
57ステッピングモーター57HS22-A
万能培養土	プランメイト、香港
シロイヌナズナ植物種	シロイヌナズナ生物資源センター、オハイオ州		コロンバスシロイヌナズナの種子購入
のために、BIO-MIX培養土層	Jiffy Products International BV、オランダの	1000682050	2つの土壌を混ぜてシロイヌナズナを育てました。すべての目的の培養土と BIO-MIXは、1:2
IL 1700研究用放射計	International Light, Newburyport, MA		全波長と光合成活性放射の両方の光強度を測定することができます。
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/download.html		無料でダウンロードできるソフトウェア
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited	Shenzhen, China		ベルト駆動リニアアクチュエーターやその他の機械モジュールを購入
スライドブロック			スライドブロックの背面にYガイドレールモジュールまたはY補助ガーダーを固定するには
X軸のジャンクションプレートカスタマイズされたモジュール			XガイドレールモジュールとX補助ガーダーを接続するには
スライドブロック
WDT4045 X軸ガイドレールモジュール		843mm、カスタマイズ	2つのスライドブロックと1つの57ステッピングモーターがプリインストール
WDT4045 Y軸ガイドレールモジュール		1038 mm、カスタマイズ	2つのスライドブロックと1つの57ステッピングモーター
がプリインストールされていますX軸補助桁		843mm、カスタマイズ	スライドブロック2個付き
Y軸補助桁		1038mm、カスタマイズ	スライドブロック2個付き