非拘束的な圧膜検査を通じた老化マウスの呼吸パターンの取得方法

サマリー

非拘束的な気圧胸膜造影は、目覚めたマウスの呼吸パターンを定量化するために使用される。標準化されたプロトコルの下の15のセグメントは、静かな呼吸の延長持続時間と同様の値を表示することを示しています。この方法論はまた、チャンバーの最初の1時間の間に無呼吸および拡張呼吸の定量化を可能にする。

要約

非拘束気圧プレチスモグラフィー(UBP)は、呼吸頻度、潮量、および微小換気が日常的に報告されているマウスの呼吸パターンを定量化する方法である。さらに、中央無呼吸や拡張呼吸の存在を含む呼吸の神経出力に関する情報を収集することができます。UBPにとって重要な考慮事項は、呼吸困難への対応を解明するために、不安な行動や活動的な行動の影響を最小限に抑えた呼吸セグメントを得ることだ。ここでは、静かな呼吸のより長い発作を待つことに匹敵する、老化したマウスで短く静かなベースラインを得ることを可能にするプロトコルを提示する。マウスの一部の株がますます興奮または不安であり、静かな呼吸のより長い期間が合理的な時間枠内に達成されない可能性があるため、より短い時間セグメントの使用は貴重です。生後22か月のマウスをUBPチャンバーに配置し、60~120分の間の静かな呼吸セグメントを、獲得までに2〜3時間かかった10分の静かな呼吸期間と比較しました。また、静かな呼吸セグメントの前に、30分の慣れ親しんだ期間に続いて、中央無呼吸と拡張呼吸の数を得ました。静かな呼吸の10分は、はるかに短い15の持続時間を使用することに匹敵することを示しています。さらに、これらの15の静かな呼吸セグメントに至るまでの時間は、中央起源の無呼吸に関するデータを収集するために使用することができます。このプロトコルは、研究者が一定の時間で呼吸パターンデータを収集することを可能にし、興奮性行動の増加量を示す可能性のあるマウスに対して静かなベースライン対策を実現可能にする。UBPの方法論自体は、呼吸パターンデータを収集するための有用かつ非侵襲的な方法を提供し、マウスをいくつかの時間ポイントにわたってテストすることを可能にする。

概要

UBP は、呼吸パターン¹、²、^3,、4の評価に共通する手法です。^,この方法では、マウスは、メインチャンバー(動物が収容されている場所)と参照チャンバーの間の圧力差が気胸管を通して濾過されて値を得る閉じたチャンバーに配置される。結果として生じるUBPのセットアップは非侵襲的で拘束されず、麻酔または外科の必要性なしで呼吸の処置を査定することを可能にする。さらに、この手法は、同じマウスでの複数の測定を必要とする研究に適しています。呼吸頻度、潮量、微小換気などの変数は、単一の試行中またはいくつかの試行の間に、この方法で定量化することができます。全身UBPはまたピーク流れおよび呼吸周期の持続時間の測定を提供する。これらのパラメータは、一緒に呼吸のパターンを定量化します。記録された呼吸痕はまたデータを確認し、一定期間内に表示される中央無呼吸の数を数えることを可能にする。このカウントは、呼吸のパターンにおける他の変化を測定するために、潮量および吸気時間の分析と一緒に使用することができる。

肺生理学的パラメータの直接評価のためにいくつかの非侵襲的なプレチスモグラフィー技術が存在するが、全身UBPは、マウスへの最小限の過度のストレスで呼吸機能をスクリーニングする方法を可能にする。逆流性流れ対策を利用し、非侵襲的でもあるヘッドアウトプレチスモグラフィーは、他の多くのタイプのプレチスモグラフィー(例えば、二重房胸膜造影)と同様に拘束に依存する。これらの方法は、気道応答性⁵を測定するためにげっ歯類モデルで使用されているが、首輪または小さな拘束チューブの使用は、マウス(対他の種)を慣れて休息レベルに呼吸を戻すために長くかかる可能性がある。

最適な空気呼吸セグメントを得ることは、ベースライン比較の重要な考慮事項です。市販のプレチスモグラフィーシステムの使用が増加し、多くの研究室で呼吸パターンデータの収集が可能になります。重要なことに、呼吸パターンは、特にマウスの採取期間を通して可変である。そうは言うが、実験者の訓練レベルが結果を混乱させないようにする手段として、ベースライン分析を標準化する必要がある。空気呼吸セグメントを収集する方法は数多くあり、実験計画間の変動の1つの領域として機能します。1 つの例としては、チャンバー¹内で事前に定義された時間のセットに従って、最後の 10 ~ 30 分のデータを平均化する方法が含まれます^。後者は、達成するために2〜3時間かかることがあり、場合によっては、マウスが十分に長く落ち着いていない場合、試練を放棄する必要があるかもしれません。この懸念は、観察された行動がより不安で興奮性の高いマウスの株に対する特に重要な考慮事項^である7。これらのマウスは、チャンバー環境に適応するのに時間がかかり、短い時間のバーストのためにのみ落ち着いている可能性があります。ベースライン収集に費やす時間を制限することで、各マウスのチャンバー時間を標準化します。

実験者は、マウスの安静時の動作値を包含する適切なベースラインを取得するが、タイムリーに発生することも重要です。したがって、このレポートの目的は、マウスの呼吸パラメータの短い静かなベースライン値を取得するために使用される方法の説明を提供することです。さらに、無呼吸と拡張呼吸は、チャンバーの最初の1時間の間に定量化することができることを報告する。

プロトコル

すべての手続きは、ル・モイン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。動物の使用はすべて、実験動物のケアと使用ガイドに記載されているポリシーに同意していました^。

注:(クリティカル)実験の前に、動物の使用に必要なすべての承認と訓練を受けます。実験者は、睡眠、苦痛、および/または運動アーティファクトの兆候と通常のスニッフィングと呼吸の兆候を含むマウスの行動と活動レベルに精通していることが重要です。

1. 全身気圧プレチスモグラフィーチャンバー

1. コネクタ、Oリングなどの気圧プレチスモグラフィーチャンバの適切なユーザーマニュアルを読み、ソフトウェアに固有のアナライザー(例えば、代謝)およびパラメータを定義するための標準プロトコルファイルを作成します。
2. すべてのホースとチューブがチャンバーに接続されていることを確認してください。気体流管(フローイン)と真空管(フローアウト)を気圧プレチスモグラフィーチャンバーに直接接続します。
   注:流入フローは、開始マークされたバイアスフローにアタッチする必要があります。
3. _{CO2、O2、N2}ガス₂タンクをガスミキサーに取り付けます。₂実験前に、すべてのガスタンクがオープン位置に位置していることを確認してください。

2. バロメトリックプレチスモグラフチャンバーの較正

1. 気圧プレチスモグラフィソフトウェアの[ハードウェア]タブで7700-アンプの設定を選択して、高いガスと低い流量を較正します。
2. 実験設計およびガス分析装置(約0.1 L/分)に適した真空(チャンバーから流れる)を設定します。
   注:アウトフローレートは、正確な代謝記録のためのキャリブレーションと実験を通じて同じままでなければなりません。
3. チャンバーから流れ管を取り外し、真空をオフにして空気の低流量を設定します。
4. 対応するチャンバのローユニットセルに0を入力してゼロフローを記録します。[低カロリー ]セルをダブルクリックし、時間を 3 s に変更して、[メジャー]を押します。
5. フローチューブを再取り付けし、ガスミキサーから気圧プレ₂チスモグラフィーチャンバーを通ってガス(20.93%O2、バランス_N2)を流れるようにします。
6. 流入量をリットル/分からミリリットル/秒に変換します。対応するチャンバの[高い単位]セルをクリックし、ミリリットル/秒単位で値を入力します。[高]をダブルクリックし、時間を 3 s に変更して、[計測] をクリックします。
7. 7700-アンプの設定タブを開いたままにして、代謝分析装置を気圧的プレチスモグラフィーソフトウェアにキャリブレーションします。

3. 代謝分析装置のキャリブレーション

1. ガスミキサープログラムでは、ガスミキサーを20.93%O2および79.07%N2を含むガスの流れを放出するように_{設定する。2}
2. 代謝分析計で_、O2キャリブレーションレベルを20.93%に_、CO2を0%に設定します。適切な値を入力したら、ダイヤルを[サンプル] に戻します。
3. 高い_O2パーセンテージを設定します。気圧プレチスモグラフィーソフトウェアのABCD-4タブをクリックし、C2ラインの高単位の下に20.93と入力します。[高いカル] で、時間を 3 s に変更し、[メジャー]を押します。
4. 低 CO₂の割合を設定します。C3 ラインの[低カロリー ] の下に0と入力し、時間を 3 s に変更し、[低カロリー] の [メジャー ] をクリックします。
5. ガスミキサープログラムで_、O2値を10%に_、CO2値を5%に変更します。ガスの流れがこれらの値に合わせるまで、数分間待ちます。代謝分析計で、調整ノブを回して_CO2を5%に調整します。値が調整されたら、必ずダイヤルを[サンプル]に戻してください。
6. 高い CO₂の割合を設定します。気圧プレチスモグラフィーソフトウェアの_O2とCO2に適切な₂値を挿入する前に、アナライザの測定値が安定していることを確認してください。C3 の下の[高い単位]をクリックし、「5」と入力します。高いカルを3 sに変更し、メジャーを押します。
7. 低いO₂パーセントを設定します。C2 オプションの下の[低単位]をクリックし、「10」と入力します。[低カロリー] をクリックし、入力 3 s をクリックし、[メジャー] をクリックします。
8. ガスミキサーのガス値を20.93%O₂と79.07%N2に戻₂します。チャンバーがこれらの値に調整されるまで数分待ちます。正しいキャリブレーションを行うために、代謝分析計が自動的に20.93%O₂と0%CO2を読み取らない場合は、手順₂3.1\u20123.7を繰り返します。認定ガスタンクで適切な校正を定期的に確認します。
9. 気圧プレチスモグラフィーチャンバに接続されている流量計を再確認します。チャンバの出入りする空気の流れを調整して、実験に適した速度(通常は0.1~0.3 L/min)します。
10. すべての設定が気圧プレチスモグラフィソフトウェアに適用されたら、[OK]をクリックして録音を開始します。

4. 拘束されていない圧膜プレチスモグラフィー

1. マウスの体重と初期体温を記録します。マウスをチャンバーに入れる前に10分待ち、空のチャンバーから_O2および_CO2データを収集する。マウスになじみのある静かな場所で作業するので、ノイズや匂いがデータ収集を妨げないようにします。ドアの開閉や、データ収集室の出入りなど、あらゆる混乱を避けてください。
   注:この特定のプロトコルは、22ヶ月齢の雄C57BL / 6Jマウスを採用しました。
2. 最初の1時間の間に、マウスの挙動を文書化し、チャンバーの流入/流出流れの特定の値を含む詳細なメモを取ります。
3. チャンバーの習慣の60分後、次の60分間静かな呼吸のセグメントを見てください。埋め込み式の装置を使用する場合は、10分ごとに体温測定を行ってください。
4. 実験の最後に、チャンバーからマウスを取り出し、ケージに戻します。すべての機器は、完全に洗浄し、拭き取る必要があります。水滴が残っている場合は、加圧空気を使用してそれらを除去します。

5. 呼吸と代謝のパターン解析

1. 気圧プレチスモグラフィーレビューファイルを開き、関心のある動物のために記録されたノートを参照してください。
2. ソフトウェアで代謝パネルを開き、チャンバーが空だったときにO_2とCO2の最初の₂10分の平均を取ります。これらの値を FiO₂および FiCO₂として記録します。
3. 気圧プレチスモグラフィソフトウェアのフローパネルを表示します。[属性の分析]を右クリックし、適切なパラメータを設定します。Meta 1タブで、ステップ 5.2 の FiO 2 と FiCO₂と、メタ₂の下のチャンバへの流れを入力して VO 2 と VCO₂を計算します。₂
4. 呼吸パターン解析では、動物の行動やフローパネルのトレースに関するメモを使用して、静かな呼吸の15秒間の時間を確認します。[データ パーサー ] タブの [データ パーサー ダイアログを開く]の下で、静かな呼吸の 15 の間隔の時間を入力します。
5. [解析された派生データの保存] をクリックします。スプレッドシートでデータ ファイルを開き、ビン分割されたデータを取得します。

6. 無呼吸と拡張呼吸の分析

1. 開いているレビュー ファイルで、パーサー表示モード を終了します。[設定]-[P3Setup設定] の下にある[グラフの設定] オプションに移動し、[種類]の下の[ページビュー ] を選択します。ペインの数として5を選択します。フローメジャーの場合は「低」とラベル付けされたボックスに-2、ミリリットル/秒の流量の場合は「高」とラベル付けされたボックスに「2」と入力します。変更を適用します。
2. フロートレーシングパネルの30分のマークまでスクロールします。
3. マウスがチャンバーに置かれた後、30〜60分間の無呼吸と拡張呼吸を数えます。無呼吸を示す0.5s以上続く中断呼吸の期間を定量化する。拡張呼吸は、1.25 mL/sを超える呼吸痕跡の急激な上昇に続いて、-0.75 mL/sを下回る急激な減少によって示されます。

結果

正常な空気ガス下で行われる16歳(22ヶ月齢)マウス(20.93%O2とバランス_N2)における呼吸パターンの評価₂としてのUBPの結果が報告されている。分析には、最初に、より長い10分静かな呼吸セグメント(得るのに2時間以上かかった)と4つの短い15 sセグメントの平均(60〜120分以内に定量化)の比較が含まれていました。呼吸がアクティブな呼吸行動と一致しない静かな呼吸の代表的な流れのトレースは図1Aに示されている。動物から同様のトレースが収集される場合、呼吸の100%はソフトウェアによって受け入れられるべきです。しかし、図1Bは、マウスがチャンバーを探索したり、スニッフィングしたり、グルーミングしたりする、よりアクティブなセグメントからの呼吸を表しています。図 1Bに示すようなトレースは、ソフトウェアで受け入れら...

ディスカッション

このプロトコルは、マウスの静かな呼吸ベースラインに関する情報を提供するだけでなく、中央無呼吸および拡張呼吸に関するデータを収集する。代表的な結果は、10分の静かなベースラインが、古いマウスのコホートに対する平均4つの15 sの発作と比較して同様の呼吸パターンを有することを示している。重要なことに、15の試合は統計的に異なっていないし、これらのグループは、Leveneのテストを使用して互いにばらつきの違いを持っていません。これらのデータは、静かな呼吸を監視するのに1つの短い試合でも十分であることを示しています。しかし、15分対10分でマウス内の個々の変動を分析すると、10分の試合が最小限のスニッフィングとグルーミング活動を含むことができるため、異なる所見が生じる可能性があります。ただし、個々のマウスベースラインセグメントの比較にLeveneの検定を使用すると、このプロトコルで説明したものとは異なる分析が可能になります。全体として、この方法論の設計では、チャンバー内で60〜120分の間に取得できる15の呼吸セグメントを使用し、各マウスが静かなベースラインの長い持続時間を達成するのを待たせます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
二酸化炭素分析計	AEI Technologies	CD-3A
二酸化炭素センサー	AEI Technologies	P-61B
コンピュータ			は、Ponemahの要件に準拠している必要があります
Drieriteビーズ	PermaPure LLC	DM-AR
フロー制御	AEIテクノロジー	R-1	真空
流量計	TSI	4100	は、チャンバーごとに1つ、真空
ガス	ミキサーMCQインスツルメンツ	GB-103
タンク	Haun		100% 酸素、100% 二酸化炭素、100% 窒素 - 食品グレード、または通常の室内空気およびガスの課題に対応するプレミックスタンク
酸素分析装置	AEI Technologies	S-3A
酸素センサー	AEI Technologies	N-22M
ポリウレタン チューブ	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah ソフトウェア	DSI
小型げっ歯類チャンバー	Buxco/DSI
温度計 (LifeChip System)	Destron-Fearing		任意のタイプの温度計が正確な体温を採取することが適切ですが、埋め込み型チップの使用により、動物への妨害を最小限に抑えることができます動物がまだUBPチャンバーにいる間の数回の体温測定
トランスデューサ	Validyne	DP45	はチャンバーごとに1つ必要です
全身プレチスモグラフィーシステム	Data Science International(DSI)		ACQ-7700、圧力/温度プローブなどが含まれます。