落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

Summary

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いたマウス心臓の開発を検討するプロトコルを提案します。このメソッドでは、心室形成労働集約的な組織化学的方法なしマウス心臓の発達過程の各段階を直接可視化することが出来ます。

Abstract

このプロトコルの目的は、マウス胚の郭清とマウス萌芽期の心室の部屋心室固有蛍光レポーター ノックイン マウス (MLC 2 v tdTomato マウス) を使用して心臓の発達過程の可視化方法の説明です。リニア心臓管形成、ループ、心臓の管および 4 室中隔、心臓の開発が含まれます。これらの複雑なプロセスはすべての脊椎動物で非常に節約されます。マウス胚の心臓は、心の発達研究のため広く使用されています。ただし、彼らの非常に小さなサイズのためマウス胚心を解剖するは、技術的に挑戦的なです。さらに、しばしば心臓室形成の可視化には、in situ ハイブリダイゼーション、β-ガラクトシダーゼ LacZ レポーター マウス、または断面胚心の免疫染色を使用して染色が必要があります。ここでは、マウスの胚中心を細かく分析し、全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いた MLC 2 v tdTomato マウス心室形成を直接可視化する方法をについて説明します。この方法では、心臓管形成とループ、およびマウス胚のさらなる実験的操作なしの 4 つの商工会議所形成を直接調査することが可能です。MLC 2 v tdTomato 記者ノックイン マウス ラインは、例としてこのプロトコルで使用されますが、このプロトコルは、他の心臓特異蛍光レポーター トランスジェニック マウスのラインに適用できます。

Introduction

心臓の発達過程室形成は、複数胚の形態的に異なる段階^1,2と移り変わり複雑なプロセスです。心臓前駆細胞の三日月形リニア心臓の管を形作るし、伸長と成長の中心のスパイラル形状を形成するループを経る。その隔プロセスの後、心臓の開発は 4 chambered 中心に変換されます。これらのプロセスのいずれかの中断は、発達心臓の欠陥で結果します。したがって、心臓の発達過程室形成の分子機構を理解することが重要です。心臓の開発で多数の先行研究、にもかかわらずこの複雑なプロセスの私達の理解は限られています。

In situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および β-ガラクトシダーゼは、LacZ レポーター マウスを用いた染色を広く心臓特定または商工会議所特定構造遺伝子の分類によってマウス心臓開発中に商工会議所の形成を研究に使用されているまたはタンパク質 (例えば、Nppa クーデター TFII Irx4、MLC 2 a、MLC 2 v)^3,4,5,6,7

Protocol

動物のすべてのプロシージャは、ヴァンダービルト大学医療センター機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行った。

1. マウス胚のコレクションおよび郭清

1. チームメイトの 8-10 週齢雌 MLC 2 v tdTomato^+/-マウス 8-10 週古い男性 MLC 2 v tdTomato^+/-マウスと MLC 2 v tdTomato を取得する^+/+、MLC 2 v tdTomato^+/-と MLC 2 v tdTomato^-/-胚。
2. 毎朝膣にプラグのダムをチェックします。膣にプラグ検出の日の正午が E0.5 として考慮されます。
   注: 膣にプラグを検出するために膣の検査は (内 8-24 h を性行後) 朝実行必要があります膣にプラグが 1 日を通して失われるので。
3. 別の日のポストの coitum (例えば、E8.5、E10.5、E12.5) で妊娠中のダムを安楽死させる頚部転位続いて CO₂吸入を使用しています。
4. 仰臥位のマウスを置き、解剖時にマウスの頭髪汚染度を避けるためにマウスの腹部に 70% エタノールをスプレーします。
5. 皮膚外科はさみと、鉗子を使用して腹壁の切開による腹腔内を開きます。
6. 腹腔の背の部分で両側の子....

Results

心の開発中に MLC 2 v は心室仕様¹⁷の最も早いマーカーと見なされます。図 1に示すように我々 は MLC 2 v tdTomato 記者式心臓の発達過程を検討し、マウス胚と MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスからの萌芽期心を解剖しました。MLC 2 v tdTomato レポーター ノックイン マウスの心臓の開発で構成 tdTomato 式は落射蛍光全台紙の画像を用いて可視化 E8.0¹² (図 2) で早くも。E8.0 でリニア心臓の管で tdTomato の比較的弱い式も E8.5 で強くなります。E10.5 で MLC 2 v tdTomato 記者式全体マウス胚から切り裂かれたループ心臓の心室部分で示された一方、流入管、流出管または将来アトリアで示されていません。E12.5 E13.5、MLC 2 v tdTom.......

Discussion

ここで説明する方法は心室または心臓固有の構造遺伝子または蛋白質のラベルに手間のかかる実験を行わず心室の開発を検討する比較的簡単です。したがって、このメソッドは、immunostained 中心部のセクションで発見された多くの場合技術的な変動を最小限に抑えます。

マウスの萌芽期の年齢・胚の心の解剖の正確な推定を含むこのメソッドを正常に実行するための 2 つの重要な手順があります。膣に識別することによってマウスの萌芽期の年齢の雌マウスのプラグを事実上推定します。しかし、膣にプラグの存在、必ずしも妊娠。それだけ性行為がおおよそ 8 ~ 24 時間期間内に発生したことを示します。膣にプラグがある場合でも多くの場合マウスが実際に妊娠しているまたは雌マウスの腹部を調べることによってポストの coitum 定め 10-11 日までないかどうかを決定することは困難です。雌雄マウスの複数のペアを飼育マウスの予想される年齢に胚を得るための安全な繁殖戦略では。その構造に著しい損害なしマウス中心の開発を分離する正確に調べる心臓チャンバー過程中のマウス胚発生の図 1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
解剖顕微鏡	Leica	MZ125
DNA ladder (100 bp)	Promega	G2101
落射蛍光解剖顕微鏡	Leica	M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
PCR machine (master cycler)	Eppendorf	6336000023