台湾におけるコウモリ集団のリッサウイルスサーベイランスに関する標準的な手術手順

サマリー

このプロトコルは、台湾のコウモリにおけるリッサウイルス抗原の診断試験のための標準的な実験室操作手順を導入する。

要約

リサウイルス属内のウイルスは人獣共通病原体であり、少なくとも7種のリサウイルス種がヒトの症例に関連している。コウモリはほとんどのリサウイルスの自然貯蔵所であるため、コウモリのリッサウイルス監視プログラムは、コウモリのこれらのウイルスの生態を理解するために2008年から台湾で行われています。このプログラムでは、非政府のコウモリ保護団体と地元の動物病対策センターが協力して、衰弱や病気で死んだコウモリやコウモリを集めました。コウモリの脳組織は壊死を介して得られ、リッサウイルス抗原および核酸の検出のための直接蛍光抗体試験(FAT)および逆転写膜ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行った。FATの場合、少なくとも2つの異なる狂犬病診断コンジュゲートが推奨されます。RT-PCRの場合、2組のプライマー(JW12/N165-146、N113F/N304R)を使用して、リッサウイルスヌクレオタンパク質遺伝子の部分配列を増幅します。この監視プログラムは、コウモリのリッサウイルスや他の人獣共通性を監視します。台湾コウモリのリサウイルスは、2016年から2017年にかけて日本のピピストレルス・アブラムス(ピピストレルス・アブラムス)の2例で発見された。これらの知見は、コウモリや他の野生動物と接触する潜在的なリスクについて、一般市民、医療専門家、科学者に知らせるべきである。

概要

リサウイルス属内のウイルスは人獣共通病原体である。ヒト^症例1に関連する少なくとも7つのリサウイルス種がある。この属1、2、3、台湾コウモリリッサウイルス(TWBLV)4およびコタラチコウモリリサウイルス5の16種に加えて、最近コウモリで同定されているが、彼らの分類状態はまだが決定されます。

コウモリは、モコラ・リッサウイルスおよび生駒リッサウイルスを除いて、ほとんどのリッサウイルスの自然宿主であり、まだどのコウモリ1、2、3、6でも同定されていない。アジアのコウモリのリサウイルスに関する情報はまだ限られています。アジアのコウモリ(インドとタイで1つ)7、8の特徴のないリサウイルスが2つ報告されています。中国では2002年にコウモリ咬傷に関連する1例の狂犬病例が報告されたが、診断は臨床^観察9によってのみ行われた。中央アジアでは、1991年にキルギスのマウス耳の小さいコウモリ(ミオティス・ブリチ)でアラバン・リッサウイルスが同定され、2001^年10月にタジキスタンのひげ付きコウモリ(ミオティス・ミスタチヌス)でクジャンド・リサウイルスが同定された。南アジアでは、2015年3月^にスリランカのインドのフライングキツネ(プテロプス・メディウス)でガンノールワコウモリのリサウイルスが確認された。東南アジアでは、フィリピン、タイ、バングラデシュ、カンボジア、ベトナムのコウモリに関するいくつかの血清学的研究が、可変血清原性11、12、13、14を示した。 ¹⁵.イルカト・リッサウイルスは、2012年16年に中国吉林省の大きな管鼻コウモリ(ムリナ・ロイコガスター)で同定されたが、東アジアのコウモリ集団におけるリッサウイルスの正確な種と場所は不明のままである。

台湾のコウモリ集団におけるリッサウイルスの存在を評価するために、直接FATとRT-PCRの両方を用いた監視プログラムが開始された。台湾コウモリのリサウイルスは、2016~2017年に日本ピピストレルス・アブラムス(ピピストレルス・アブラムス)4例の2例で同定された。本論文では、台湾におけるコウモリ集団のリサウイルス監視に関する実験室標準手術手順を紹介する。本研究室におけるコウモリリサウイルス診断のフローチャートを図1に示す。

プロトコル

1. リサウイルスの取り扱い時の安全上の注意

1. コウモリの標本を扱うすべての実験室労働者が事前暴露狂犬病^予防17を受け取ることを確認してください。あらかじめ労働者の狂犬病抗体レベルを監視し、6ヶ月ごとに再検査^17.抗体レベルが0.5 IU/mL¹⁷より低い人には、狂犬病の予防接種が必要です。
2. 研究室がある国のバイオセーフティ規制に応じて、適切なバイオセーフティレベルのラボ(例えば、台湾のBSL-2研究所およびオーストラリアのBSL-3研究所)で以下の手順が実行されることを確認し、労働者は現在資格を有し、適切な個人用保護具^{を着用しています 18.}
   注:狂犬病のワクチン接種は、フィログループIIおよびIII¹⁸に属するリサウイルスからの保護をほとんどまたは全く提供しない。労働者は、いくつかの動物性病原体が^{コウモリ19}で同定されたことを知らされなければならず、適切な個人用保護具を用いて適切なバイオセーフティレベルの実験室条件下でサンプルを処理する必要があります。

2. サンプルコレクション

1. 弱いまたは病気のコウモリや死体を使用してください。
   注:弱いコウモリや病気のコウモリは、獣医のケアや研究のために台北のコウモリ保護協会に届けられ、死体は動物衛生研究所に直接提出されます。この監視プログラムでは、健康なコウモリは安楽死させられていない。
2. コウモリの生態学者が形態学的^特性20を通じてコウモリ種を同定する。
3. リッサウイルス陽性が診断されたときにコウモリ種のDNAバーコードを行い、以前に公表された^手順21を用いて。
4. 各コウモリの死体(採取部位、種、臨床徴候など)の情報シートを提出する。

3. コウモリ標本の壊死

1. 材料を準備します。
   1. きれいな解剖板を準備し、壊死のための滅菌吸収パッドを置きます。
   2. コウモリの臓器を収集するための収集チューブを準備します。
   3. 使い捨てピンセットと壊死のためのメスを準備します。各コウモリの壊死の間にツールを変更します。サンプリング中にピンセットとメスを洗浄するために70%エタノールで湿らせた綿玉を準備します。
   4. FAT用の2つの顕微鏡スライドを準備します。新鮮な標本を収集し、病理学的検査のためのホルマリン溶液でそれらを固定します。
2. 壊死の前にすべての外部オリフィスを調べます。コウモリの外的特徴、特に頭、耳、翼を写真に撮り、種分化を行います。
3. 経口綿棒サンプルを収集します。ボード上の腹部の直立にコウモリを置き、ピンセットでバットの頭を固定します。メスでカルバリアの中線に沿って皮膚をカットし、側面に皮膚を引っ張ります。メスでカルバリアの中線に沿って頭蓋骨をカットし、脳組織を露出させるためにピンセットでそれを開きます。
4. 頭蓋骨から脳組織を取り出し、無菌舌圧下に置き、脳組織から印象を塗り付けます(ステップ4.2参照)。新鮮な脳組織の小片を収集し、組織病理学的検査のためにホルマリンでそれを修正します。核酸抽出のためのチューブ内の残りの脳組織を含む。
5. 70%のエタノールで湿った綿のボールできれいなピンセットとメスは、標本コレクション間の保持された組織を除去します。
6. 後部の直行でボード上にバットを置き、軸索と尾かかとの両側に針でボード上に固定します。
7. 体の中間線に沿って皮膚をマンディブルからアナスに切開します。ピンセットで皮膚と下の筋肉組織を持ち上げ、分離します。顎骨の近くにある唾液腺を採取する。
8. ピンセットでわずかに胸骨を持ち上げ、メスで中間線に沿って胸骨と腹壁をカットします。メスで鎖を切る。左右の肋骨ケージを針でボードに固定し、胸腔を開きます。
9. 総病変と死後変化の程度を記録します。
10. ピンセットとメスを使用して死体から内臓組織(すなわち、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸)を取り除きます。将来の研究のために必要に応じて内臓標本を収集します。
    注: 重複するサンプルのコレクションをお勧めします。一方は分子診断のために収集されるべきであり、もう一方はウイルス培養用のウイルス輸送培地の有無にかかわらず-80°Cで凍結^{されるべきである22。}

4. 直接蛍光抗体検査(FAT)

1. FAT の脳組織の印象の塗りつぶしを作成します。前述の^18,23に従って FAT を実行し、次の変更を行います。
2. ピンセットで接続された神経組織から脳組織を穏やかに分離し、脳組織を無菌舌圧下器に移す。脳幹と小脳を含む脳の断面を切る^18,23.脳組織の切断面に軽く触れることで脳組織の印象を塗り、レンズ組織のスライドを押して余分な組織を取り除きます。
3. -20 °Cでスライドを30分間アセトンで固定し、コンジュゲートで染色する前に、テストしたスライドと正と負のコントロールを乾かします。
4. リサウイルス抗原を染色するための2つの市販のFITC結合抗狂犬病抗体のそれぞれを使用することは強く推奨23。最初の染色の前に商業コンジュゲートの作動濃度を決定する。希釈したコンジュゲートを0.45 μMシリンジフィルターを通してスライドに落とし、湿ったチャンバー内で30分間37°Cでスライドをインキュベートします。
5. スライドから余分なコンジュゲートを排出し、インキュベーション後にリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でスライドを洗浄します。
6. スライドに少量の10%グリセロールをドロップし、カバースライドでカバー.
7. 蛍光顕微鏡でスライドを調べます。

5. 核酸抽出

1. 脳組織にMEM-10(10%の胎児ウシ血清を補充した最小必須培地)の適切な体積を脳組織に加える(10%w/v)。
2. ホモジナイザー器具で5mmのスチールビーズで脳組織をホモジネートし、遠心分離機を825 x gで10分間使用します。
3. 核酸を抽出し、そのうち最終体積は50μLであり、市販の全核酸抽出キットを器具で用いて上清の200μL以内に抽出する。

6. RT-PCRと系統解析

注:いくつかのプライマーセットは、すべての既知のリサウイルスまたは特定のリサウイルスを検出するために公開されています。ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室が使用し、すべての実験ニーズに適合しない場合があります例です。実験室の必要性に従って適切なプライマーを選びなさい。

1. 1ステップRT-PCR試薬を以下のように準備する:10倍の反応バッファーの2.5 μLを含む反応混合物に抽出された核酸の5 μLを加え、フォワードとリバースプライマーの0.5 μL(各々10 μM)、4 μLの1.25mM dNTP、0.3 μLのRNase阻害剤(40 μL)を追加します。、逆転写酵素の0.3 μL(10 U/μL)、DNAポリメラーゼの0.4 μL(5 U/μL)、およびDEPC処理水の11.5 μL。
   注: このプロトコルで使用されるプライマー セットは、JW12 (5'-ATGTACACCYCTACAATG-3') および N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTTATACTATA-3')²⁴です。使用するプライマーセットに従って試薬およびサイクリング条件の調製を修正する。
2. 次の条件下でサイクリングを実行します: 42 °C でのインキュベーション 40 分;10分間94 °Cで初期退化;30 s のための 94 °C の 35 サイクル、 30 s のための 55 °C、30 s のための 72 °C;そして最後に、10分間72°Cでさらに延長する。
3. 別のプライマー・セットを使用して、診断の感度を高める。
   1. N113F(5'-GTAGGATATGGG-3')とN304R(5'-TTGACGAAGATCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCATCAT-3')25、26を使用して、次のように1ステップRT-PCR試薬を調製する:5 μLの混合物を含む反応に5 μLを添加し、5μL μLμLを含む反応に添加する。フォワードおよびリバースプライマー(各4μM)、1.25mM dNTPの5μL、RNase阻害剤の0.5 μL(40 U/μL)、0.2 μLの逆転写酵素(10 U/μL)、1μLのDNAポリメラーゼ(5 U/μL)、および23.3 μLのDEPC水処理量。
   2. 次の条件下でサイクリングを実行します: 42 °C でのインキュベーション 40 分;5分間95 °Cで初期退化;1分のための95 °Cの35サイクル、1分と20sのための55 °C、および1分のための72 °C;そして最後に、10分間72°Cでさらに延長する。
      注:実験室の必要性に応じて、診断のための適切なプライマーを選ぶ。N113Fはもともと狂犬病ウイルス増幅用に設計されましたが、他のリッサウイルスにはうまく機能しない場合があります。N113FおよびN304Rのセットは狂犬病ウイルス(台湾フェレットバガー変異体)および台湾のコウモリのリサウイルスのためによく働く。ライサウイルスが上記の2つのプライマーセットの両方によって増幅された場合、JW12およびN304Rプライマーのセットを使用して、全核タンパク質配列を得ることが容易になります。
4. 2%アガロースゲル電気泳動のPCR製品を分析し、紫外線照光で可視化します。
5. 商用シーケンシング サービスによって PCR 製品を順序付けします。
6. ヌクレオチド基本ローカルアライメント検索ツール(BLAST)のウェブページにシーケンスを入力またはアップロードします。「その他(nrなど)」データベースを選択し、生物をリサウイルスとして入力します。メガブラストアルゴリズムを選択し、BLASTを実行します。

7. ウイルスの隔離

注: 1) FAT または 2) RT-PCR が陽性を示す場合は、ウイルスの単離を実行します。

1. MEM-10で10%(w/v)懸濁液で脳標本を均質化する。825 x gで 10 分間遠心分離機。
2. MEM-10の1 mLで3 x 10⁶ MNA(マウス神経芽細胞腫)細胞の懸濁液を用い、200μLの上清を1%CO2で37°Cで1時間接種する。脳ホモジネート細胞懸濁液を25cm²フラスコに移し、MEM-10の6 mLを加える。
3. 直径6mmの4ウェルテフロン被覆ガラススライドで脳ホモジネート細胞懸濁液の1mLを同時に栽培する。
4. 1%CO₂で37°Cでインキュベーションの3〜4日後、100%アセトン(v/v)で4ウェルスライド上の細胞を固定します。
5. ステップ4.4-4.7に続く2つのFITC結合抗狂犬病抗体でスライドを汚します。細胞は、細胞内包含物を調べると感染する。感染した細胞の割合を記録します。
6. スライドが陰性として染色された場合、接種細胞培養のトリプシン化およびサブ培養を行います。
   1. 培地を取り出し、5 mLのPBSでフラスコをすすいで下します。
   2. フラスコに1mLのトリプシンを加え、フラスコの底をしっかりと打ちます。
   3. MEM-10の6 mLを追加し、細胞を再中断します。
   4. 細胞懸濁液を新しい組織フラスコ(6 mL)に入れ、4ウェルスライド(1 mL)に入れておきます。
7. 100%の感染率に達するまで、手順7.4~7.6を繰り返します。
8. インキュベーションの24時間後に上清を収集します。

結果

2014年から2017年5月まで、13種から332種のコウモリの死骸が監視対象として収集されました。2つのテストは陽性でした。第1打席では、市販のFITC結合抗狂犬病抗体(図2)を用いてFATを用いて負の脳印象をテストし、RT-PcRは2つのプライマーセット(JW12/N165-146、N113F/N304R)をそれぞれ採用した。肯定的な結果 (図3)アンプリコンの428bp配列(N113F/N304Rで増幅し、部分核タンパク質遺伝子を含有する)が得られた。そのシーケンスは、GenBankデータベースによるBLASTクエリを行いました。その結果、この配列は79%未満のアイデンティティを有するリサウイルスに類似しており、検出されたリサウイルスのアイデンティティを支持することが示された( 図4)。

その後、2つのライサウイルスをこれら2つの脳から正常に単離し、FAT(...

ディスカッション

この実験室の標準的な操作手順(SOP)は台湾のリッサウイルス抗原の存在のためのコウモリのサンプルをテストするためのシリアルプロセスを提供する。重要なステップは、FATとRT-PCRの雇用が含まれます。適切なサンプルの選択とウイルスの正常な単離も重要です。さらに、コウモリのリサウイルスのモニタリング中にいくつかのトラブルシューティングが行われました。主な違いは、ターゲット動物でした。当初(2008-2009年)、コウモリのリッサウイルス監視の対象動物は生きたコウモリで、台湾の金門島に閉じ込められ、安楽死後にリッサウイルスの検査を受けた。閉じ込められたコウモリのほとんどは健康で、リッサウイルスを運ぶ可能性は低く、監視へのこのアプローチは人道的ではありませんでした。そのため、3年目には死んだコウモリだけが集められ、監視エリアを地域から全国に広げました。8年間の連続モニタリングの後、台湾で最初のコウモリのリサウイルス症例がついに検出された。

FATは狂犬病の診断に最も広く使用されている方法であり、OIEおよびWHO¹⁸によって推奨されているが...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.5% トリプシン (10x)	Gibco	15090046	トリプシン
25 cm2 フラスコ	Greiner bio-one	690160
アセトン	Honeywell	32201-1L
アガロース I	VWR ライフサイエンス	97062-250
アルコール	日本薬薬試薬	NS-32294
AMV 逆転写酵素	プロメガ	M5101
抗生物質-抗真菌薬(100X)	Gibco	15240-062	MEM-10
ブレード	ブラウン	BA215
遠心分離機	ッペンドルフ	5424R
化学発光システム	TOP BIO CO.	MGIS-21-C2-1M
コレクションチューブ	キアゲン	990381
コレクションチューブ	SSI	2341-SO
カバースライド	武藤純薬(株)	24505
DNA分析装置	Applied Biosystems	3700XL
ウシ胎児血清	Gibco	10437028	MEM-10
FITC 抗狂犬病モノクローナルグロブリン	Fujirebio Diagnostic Inc.	800-092	FITC標識抗狂犬病抗体:試薬B
4ウェルテフロンコーティングガラススライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	30-86H-WHITE
ゲル電気泳動システム	メジャーサイエンス	MJ-105-R
HBSS (1x)	Gibco	14175095	Trypsin
Incubator	ASTEC	SCA-165DS
倒立顕微鏡	Olympus	IX71
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	A2916801	MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS 狂犬病 FAT試薬	EMD Millipore Corporation	5100	FITC標識抗狂犬病抗体:試薬
A MagNA Pure Compact Instrument	Roche	03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1	Roche	03730964001
MEM (10x)	Gibco	11430030	MEM-10
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140050	MEM-10
MEM ビタミン溶液	Gibco	11120052	MEM-10
NaHCO3	Merck	1.06329.0500	MEM-10
針	テルモ	NN*2332R9
PBS	Medicago	09-8912-100
プライマー合成	Mission Biotech
RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤	Promega	N2111
シーケンシングサービス	Mission Biotech
Slide	Thermo Scientific	AA00008032E00MNT10
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)	Gibco	11360070	MEM-10
ステンレススチールビーズ	QIAGEN	69989
滅菌吸収パッド	3M	1604T-2
シリンジフィルター	Nalgene	171-0045
Taqポリメラーゼ	JMRホールディングス	JMR-801
サーマルサイクラー	Applied Biosystems	2720
TissueLyser II	QIAGEN	85300
舌圧子	HONJER CO., LTD.
ピンセット	テニソン医療機器開発株式会社	A0601
酒石酸タイロシン	シグマ	T6271-10G	MEM-10