Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

Summary

汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、すべての既知の lyssaviruses を特異的に検出するために開発されました。異なる動物種の狂犬病脳サンプルを用いたバリデーションは、この方法が、金標準蛍光抗体検査と同等の感受性および特異性を有し、日常的な狂犬病診断に使用できることを示した。

Abstract

ファミリー Rhabdoviridae内のオーストラリアコウモリリッサウイルス属の狂犬病ウイルスおよび他のメンバー種を検出するために、汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (入れ子型 RT − PCR) を開発し、保存領域を検出した。lyssaviruses の核タンパク質 (N) 遺伝子の。この方法は、ウイルス RNA を鋳型として用いた逆転写 (RT)、およびオリゴ (dT)₁₅およびランダム hexamers を、ウイルス相補 DNA (cDNA) を合成するためのプライマーとして適用する。次いで、このウイルス cDNA を、外部プライマーを用いた第1ラウンド PCR で 845 bp N 遺伝子断片を増幅させる鋳型として使用し、その後、第2ラウンドのネスト化 PCR を行い、内側のプライマーを用いて最終 371 bp フラグメントを増幅する。この方法は、狂犬病ウイルス (RABV) の異なる遺伝的クレードを検出することができます。この検証により、中国での臨床狂犬病診断およびサーベイランスの10年間における8つの家畜種からの9624の脳標本を用いて、その方法が直接蛍光と比較して 100% の感受性および 99.97% の特異性を有することを示した。抗体検査 (FAT) は、世界保健機関 (WHO) と世界動物衛生機構 (OIE) が推奨する金本位法です。さらに、この方法は、合成の模倣検出によって評価される、ウイルスの分類に関する国際委員会 (ICTV) の第10の報告書において、15件の他の承認された、および2つの新規オーストラリアコウモリリッサウイルス種の標的 N 遺伝子断片を特異的に増幅することもできる全ての lyssaviruses の N 個の遺伝子プラスミド。この方法は、狂犬病診断のための脂肪に代わる便利な手段を提供し、中国の国家標準 (GB/T36789-2018) として承認されています。

Introduction

狂犬病は、オーストラリアコウモリリッサウイルス属¹内のウイルスによって引き起こされる世界的な人獣共通病である。Lyssaviruses (ファミリー Rhabdoviridae) は、5つのタンパク質 (N、エピレギュリンタンパク (P)、マトリックスタンパク質 (M)、糖タンパク質 (G)、および大タンパクまたはポリメラーゼ (L) をコードする約 12 kb のゲノムを持つ単一陰性鎖 RNA ウイルスです。N 遺伝子、遺伝的距離、および抗原パターンのヌクレオチド配列に基づいて、lyssaviruses は、16種に分けられ、古典的な狂犬病ウイルス (RABV) および狂犬病関連ウイルス (RRV) を含む: ラゴスバットウイルス (LBV)、Duvenhage ウイルス (DUVV)、Mokola ウイルス (MOKV)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 1 (EBLV-1)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 2 (EBLV)、オーストラリアバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (ABLV)、Aravan ウイルス (ARAV)、生駒ウイルス (IKOV)、Bokeloh バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (BBLV)、Gannoruwa バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (GBLV)、Irkut ウイルス (IRKV)、ホジャンドウイルス (KHUV)、西コーカサスバットウイルス (WCBV)、シモニバットウイルス (SHIBV)、およびリェイダバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (LLEBV)².最近、2つの追加の lyssaviruses が同定されている: フィンランドのブラントのバット (Myotis brandtii) から分離した 2017³と台湾バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (TWBLV) から孤立した KOTALAHTI バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (KBLV) は、日本の pipistrelle (Pipistrellus abramus) 2016 年に台湾、中国で-2017⁴.

すべての哺乳類は狂犬病に感染しやすい。しかし、総病的病変または特定の臨床徴候はその同定を許可せず、診断は実験室⁵でのみ行うことができる。狂犬病診断のための最も広く使用されている方法は、WHO と OIE^5,6によって金本位として考えられている脂肪である。それにもかかわらず、脂肪は、劣化/autolyzed 脳組織サンプルで信頼性の低い結果を生成することができます。さらに、それは脳脊髄液 (CSF)、唾液および尿のような生物的液体の標本を測定するのに使用することができないそれにより antemortem 診断⁷の雇用を主に排除。代替の従来の診断試験は、狂犬病組織培養感染検査 (RTCIT) およびマウス接種試験 (MIT) など、数日⁶を必要とし、迅速な診断が必須である場合の大きな欠点である。

種々の分子診断試験 (例えば、RT-PCR によるウイルス RNA の検出、PCR −酵素結合免疫吸着アッセイ、「PCR − ELISA」、インサイチューハイブリダイゼーション、およびリアルタイム PCR) は、狂犬病診断のための迅速かつ高感度な技術として使用されている⁸.ルーチン狂犬病診断には OIE が推奨しており、heminested (hn) PCR は、地上動物が lyssaviruses⁵をすべて検出するための診断検査とワクチンの oie マニュアルに記載されています。ここでは、オーストラリアコウモリリッサウイルスネストされた RT-PCR を説明し、脂肪によって得られたものと同等またはそれを超えるすべての18オーストラリアコウモリリッサウイルス種の特異的および高感度検出を可能にする。この方法の原理は、標的 RNA の RT (オーストラリアコウモリリッサウイルス N 遺伝子の保存領域) を cDNA に、続いて2ラウンドの PCR による cDNA の増幅である。CDNA は、845 bp フラグメントを増幅するために、外部プライマーを含む第1ラウンド PCR を行います。次いで、第2ラウンド PCR は、第1ラウンド PCR 産物を鋳型として使用して、内部プライマーを有する 371 bp フラグメントを増幅する。PCR の2つのラウンドは、アッセイの感度を有意に増加させる。

Protocol

このプロトコルでのマウスの使用は、軍事獣医学研究所の動物福祉に関する管理委員会によって承認されました, 軍事医学アカデミー, 中国 (実験動物のケアと使用委員会の承認, 許可番号 JSY-DW-2010-02)。実験動物のケアと使用のためのすべての制度的および国家的ガイドラインに従った。

1. RNA 抽出

1. 狂犬病の疑いのある脳組織から RNA を抽出し、皮膚生検、唾液、または CSF または RABV 感染細胞培養から、グアニジニウムイソチオシアナート-フェノール-クロロホルムベースの抽出方法または市販のウイルス RNA 抽出キットを使用した。調製した RNA をすぐに使用するか、必要になるまで-80 ° c で保管してください。

2. ウイルス RNA の逆転写

1. 表 1に記載されている RT 試薬を冷凍庫から取り出し、氷上に保管し、使用前にそれらを解凍し、渦を止めます。
2. 表 1に記載した試薬で 0.2 mL PCR チューブに12μ l の RT 反応混合物を調製します。マスターミックスのボリュームを必要以上に少なくとも1つの反応サイズを作成することによって、ピペットで変化させることができます。
3. テンプレートルーム内の PCR ワークステーション内の RT 反応ミックスに、8μ l サンプル、ポジティブコントロール RNA、またはネガティブコントロールを追加します。RT 陽性対照は、固定 RABV 株 CVS-11 (チャレンジウイルス標準-11) で感染した細胞培養物から抽出した RNA を-80 ° c で保存した。ネガティブコントロールには、RNase フリーの ddH₂O が含まれています。
4. ボルテックスによって RT チューブの内容を混ぜる;その後、簡単に遠心分離する。
5. サーマル・サーマルサイクラーにリアクションチューブをロードします。CDNA 合成プログラムを設定するには、42° c で90分、95° c を5分間、4° c 保留状態にします。反応量を20μ l に設定します。 RT 実行を開始します。

3. 第1ラウンド PCR

1. 表 2に記載されている PCR 試薬は、使用するまでクリーンルームで氷上に保管してください。その後、それらを解凍し、渦。
2. 表 2に記載されている試薬を使用して、0.2 mL pcr チューブに1回戦の pcr ミックスを準備します。
3. CDNA またはプラスミドの2μ l サンプルを、テンプレートルーム内の PCR ワークステーション内の第1ラウンド PCR ミックスに追加します。PCR 陽性コントロールは、上記の RT 法のステップ2.3 で述べたように、CVS-11 cDNA を準備したものです。PCR 陰性コントロールは ddH です。
4. 表 3に記載されているパラメータを使用して、密封されたチューブを PCR サーマルサイクラーに移し、サイクルします。

4. 第2ラウンド PCR

1. 表 4に記載されている試薬を使用して、0.2 mL pcr チューブ内に2回戦の pcr ミックスを用意します。
2. 第2次 PCR ミックスに、第1ラウンド PCR 製品の3μ l を加えます。また、第2ラウンドPCR のネガティブコントロールとして ddH を含む。
3. ステップ3.4 で示されているのと同じパラメータを使用して PCR 熱循環を実行します。

5. アガロースゲルでの電気泳動による PCR 産物の分析

1. 1.5% のアガロースゲルに 1.5 g のアガロースを 100 mL のトリス-アセテート-EDTA (テコンドー) に添加し、電子レンジで加熱して徹底的に溶解させることによって準備します。
2. 臭化エチジウム (EB) を追加 (最終濃度は 0.01%)または別の商業的 EB 置換。ゲルを鋳型に注ぎ、周囲温度で少なくとも30分間固化させるようにしておきます。
3. 各 PCR 製品の5μ l を1μ l のローディングバッファと混合して、ローディングサンプルを準備します。
4. サンプルと適切な DNA マーカーをウェルに別々にロードし、120 V で約30-45 分間ゲルを泳動し、染料のラインがゲルの約 75%-80% になります。
5. 電源を切り、電源から電極を取り外し、ゲルボックスからゲルを慎重に取り外します。
6. UV ゲルを文書化したデバイスを使用して、DNA 断片を視覚化して撮影します。

6. ネスト型 RT-PCR の特性評価

1. 6.1のlyssaviruses プラスミドの検出に対する特異性と感度
   1. PCR のための各オーストラリアコウモリリッサウイルス (16 ICTV 種および2つの新規種) の完全な N 遺伝子を含む18の商業的プラスミドを注文する。
   2. アボガドロの数 (N_A) と次の式を用いてプラスミドのコピー数を計算します。
      [(g/μ l プラスミド DNA)/(bp x 660 のプラスミド長) x 6.022 x 10²³ = 分子数/μ l
   3. DdH₂O のすべての18のプラスミドの原液 (2.24 x 10⁹分子/μ l) を調製します。
   4. DdH₂o における全18プラスミドの 9 10 の連続希釈を行い、ddH₂o の90μ l の各プラスミドストックの10μ l を希に希釈します。
   5. セクション3-5 で説明されているように PCR 増幅を行います。
   6. 一連のオーストラリアコウモリリッサウイルスプラスミドを検出することにより、入れ子になった PCR の特異性と感度を分析します。
2. D の決定etectionlimit
   1. 狂犬病ウイルス株 CVS-11 細胞培養の力価を 10^5.5 TCID₅₀/mL (OIE マニュアルに従って決定されたウイルス力価)⁵に調整してください。
   2. ステップ6.1.4 で説明されているように CVS-11 (原液は 10^5.5 TCID₅₀/mL) の 5 10 の連続希釈を行います。
   3. セクション1-5 に記載されているように、すべてのウイルス希釈物の RNA 抽出および枝分かれ RT-PCR 増幅手順を実行します。
3. 示の isonはネストされたRT-PCR「ゴールドスタンダード」の脂肪
   1. 入れ子になった RT-PCR によってすべての臨床サンプルを試験し、次いで、脂肪⁵および N 遺伝子配列⁹を用いて結果を確認する。
   2. SAS 9.1 の統計分析には、正規化されたデータを使用します。診断テスト (SAS コマンド: proc 周波数、テーブル/同意) の統計的比較のためのκテストとマクネマーのカイ二乗検定を使用します。Abinomial 分布を仮定して信頼区間を計算します。
4. 劣化サンプルの試験における有効性の評価
   1. 37° c で狂犬病になった犬の臨床脳組織サンプルを2つ明らかにします。
   2. アッセイは、ネストされた RT − PCR、脂肪、および MIT⁵によって37° c での曝露の各日に2つのサンプルを測定する。

Results

18個のオーストラリアコウモリリッサウイルス種を検出するための枝分かれ RT-PCR の結果を図 1に示す。すべての PCR 陽性コントロールは、第2ラウンド増幅の第1および 371 bp で予想される 845 bp を示し、ネガティブコントロールにはバンドがありませんでした。全ての 18 lyssaviruses が予想された845および/または 371 bp バンドを生産し、入れ子になった RT-PCR が全 18 lyssaviruses を検出したことを示した。16の lyssaviruses プラスミドは PCR の2つのラウンドで効率的な増幅を有していましたが、2、すなわち ARAV および IKOV は、第1または第2ラウンド PCR のいずれかで増幅していました。この方法の感度は、表 6に示すように、異なるオーストラリアコウモリリッサウイルスプラスミドの検出において変化し、2.24 x 10⁰から 2.24 x 10⁵分子/μ l までの範囲である。これらの違いは、ウイルス配列の多様性...

Discussion

現在、RABV は、中国、および他の国でほぼすべての人間と動物の狂犬病に責任を負う主要なオーストラリアコウモリリッサウイルスです。さらに、IRKV 変異体は 2012¹⁰年に中国北東部の吉林省のMユリナテスター leucogasterバットから最初に同定され、2017¹¹年に遼寧省で犬の死亡を引き起こすことが報告されています。最近では、2017年に中国台湾の日本の pipistrelle バットから、TWBLV の小説オーストラリアコウモリリッサウイルスも確認された。これらの結果は、他の lyssaviruses の効果的な検出が、コウモリが媒介する lyssaviruses の流出を防ぐためにも重要であることを示唆している。この点において、最も保存された N 遺伝子領域を標的とする汎オーストラリアコウモリリッサウイルスネスト RT-PCR は非常に有用なツールであり、その結果から、これまでに同定した16個の ICTV と2つの新規オーストラリアコウモリリッサウイルス種をすべて効果的に検出できることが示され...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ×TAE	Various	Various
6 × ローディングバッファ	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright®株式会社	A-2015-100g
ddH2O	各種
DL 2,000 マーカー	タカラ	3427A
dNTPs (10 mM)	タカラ	4019
dNTPs (2.5 mM)	タカラ	4030
電気泳動システム	タノン	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
ゲルイメージングシステム	UVITEC	ファイヤーリーダー
マイクロセンティフュージチューブ	各種
M-MLV逆転写酵素 (200 IU/µL)	タカラ	2641A
NanoDrop 1000 分光光度計	サーモサイエンティフィック	ND1000
オリゴ (dT)15	TakaRa	3805
PCRマシン	BIO-RAD	T100
PCRチューブ	各種
フュージョン ハイフィデリティDNAポリメアラーゼ	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNaseフリーddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10回)	TakaRa	9152A
のヒント	各種
各種ボルテックスミキサー	各種