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方法論記事

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

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DOI：

10.3791/59437

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2019年5月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

この記事について

サマリー

本論文では、免疫エリミターへの曝露後のアラビドプシス・タリアナにおける防御応答を定量化する2つの方法について、一過性酸化バーストと苗増殖の抑制について述べた。

要約

植物は病原体を知覚し、病気から保護するために堅牢な免疫システムを進化させてきました。本論文では、エリクティター分子による治療後のアラビドプシスタリアナにおける免疫活性化の強度を測定するために使用できる2つのアッセイについて述べた。最初に提示されるのは、急速に誘発され、動的酸化バーストを捕捉する方法であり、これはルミノール系アッセイを用いて監視することができる。第2に提示されるのは、苗増殖の免疫誘発阻害を測定する方法を説明する方法である。これらのプロトコルは、高速かつ信頼性が高く、専門的なトレーニングや機器を必要とせず、植物免疫の遺伝的基礎を理解するために広く使用されています。

概要

病原体を知覚し防御するために、植物は微生物関連分子パターン(MAMP)1として知られている細胞外の保存された微生物分子を検出する膜結合パターン認識受容体(PRR)を進化させました。彼らの認知PRRへのMAMPの結合は、広いスペクトル疾患耐性2をもたらすタンパク質キナーゼ媒介免疫シグナル伝達を開始する。PRR活性化後の最も初期の応答の1つは、細胞外活性酸素種(ROS)の産生を触媒する一体型血漿膜呼吸バーストオキシダーゼホモログ(RBOH)タンパク質のリン酸化と活性化である3,4.ROSは、疾患耐性を確立する上で重要な役割を果たし、免疫シグナル伝達を伝播する二次メッセンジャーとして作用するとともに、直接抗菌剤5.免疫誘発性酸化バーストの最初の観察は、フィトフソラインフェタン接種6に続くcv.リシリのジャガイモ塊茎を用いて説明した。ROS産生は、葉ディスク7、細胞懸濁培養物8、およびプロトプラス6を用いていくつかの植物種で評価されている。ここで説明する、アラビドプシス・タリアナ(アラビドプシス)の葉ディスクでパターントリガROS産生をアッセイするための簡単な方法である。

MAMP知覚に対する応答として、活性RBOHタンパク質は、過酸化水素(H2 O)に変換されるスーパーオキシドラジカル(O2-)、ヒドロキシルラジカル(•OH)、およびシングルト酸素(1O2)の産生を触媒する。2)細胞外空間9中。H2O2は、酸化剤ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)10の存在下でルミノール系ケミルミネッセンスにより定量することができる。 HRPは、光10の光子を放出する不安定な中間体を生成するためにルミノールと反応する水酸化イオン(OH−)および酸素ガス(O2)を生成するH2O2を酸化する。 光子の放出は、ほとんどの分子実験室で標準的な装置となっている発光を検出することができるマイクロプレートリーダーまたはイメージャーを使用して相対光単位(LLU)として定量することができる。40〜60分間隔で生成された光を測定することにより、一過性酸化バーストは、エリキシーター処理後2〜5分後に早くも検出することができ、10〜20分でピークに達し、〜60分後に基底レベルに戻る。この時間コースで生成された累積光は、RBOHタンパク質12の活性化に対応する免疫強度の尺度として使用することができる。便利なことに、このアッセイは、特殊な機器や面倒なサンプル調製を必要としません。

MAMP検出直後にピークを迎え、酸化バーストはMAPK活性化およびエチレン産生5と共に早期免疫応答と考えられる。その後の免疫応答には、転写リプログラミング、腹腔閉鎖、およびカロース堆積2、5が含まれる。MSPへの長期暴露は、エネルギー的に高価な免疫シグナル伝達を継続的に活性化し、植物の成長の阻害をもたらし、開発と免疫13との間のトレードオフを示す。パターン誘発苗増殖抑制(SGI)は、アラビドプシスにおける免疫出力を評価するために広く使用され、PRR14、15を含む免疫シグナル伝達のいくつかの主要成分の同定に不可欠であった、16.したがって、本論文はさらに、アラビドプシスにおけるパターントリガSGIのアッセイを提示し、それによって苗は、標準的な媒体または免疫エリケータを8〜12日間補充したマルチウェルプレートで成長し、その後計量した。分析スケールを使用します。

ROSおよびSGIアッセイを使用してPRR媒介シグナリングを監視する方法を実証するために、様々な免疫出力を表す3つの遺伝子型が選択されました:(1)野生型アラビドプシス加盟コロンビア(Col-0)、(2)優勢陰性bak1-5 多機能PRR共受容体BRASSINOSTEROID無感受性1-関連キナーゼ1(BAK1)が免疫シグナル伝達17、18、および(3)劣性cpk28-1変異体において非機能である変異体は、調節タンパク質カルシウム依存性タンパク質キナーゼ28(CPK28)および高められた免疫誘発応答19,20を表示する。ROSおよびSGIアッセイは、細菌伸長因子Tu(EF-Tu)の合成産生elf18ペプチドエピトープに応答して提示され、PRR EF-Tu受容体(EFR)15によってアラビドプシスで認識される。これらのプロトコルは、細菌運動性タンパク質フラゲリン14または内因性植物エリシエータタンパク質(AtPeps)16などの他の免疫エリケータと共に使用することができるが、植物の応答性は、引き出し器21.ROSおよびSGIアッセイを組み合わせることで、PRR媒介応答の早期および後期の迅速かつ定量的評価に使用できます。

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プロトコル

1. 免疫引き出し後のアラビドプシス葉ディスクにおけるROSバーストの検出

  1. 植物の成長とメンテナンス。
    1. 発芽を同期させるには、無菌0.1%寒天[w/v]の1mLで約50種を懸濁し、3〜4日間4°C(光なし)に保存してアラビドプシス種子を層化します。
      注: 野生型のバックグラウンド コントロール (Col-0 など) と、免疫出力が高く低い遺伝子型(cpk28-1とbak1-5など) を内部制御として使用できます。
    2. 土壌に種をまき、標準的な短日条件(22°C、10h光、150mE/m2/s光強度、および65-70%相対湿度)の下で発芽します。
    3. 約7日後、鉗子を使用して個々の苗を新しい鉢に移植し、少なくとも4cmで分離して完全なロゼットの開発を可能にする。遺伝子型ごとに6-12の苗を移植し、標準的な短日条件に戻す。定期的に水と植物を受精(2週間ごとに20-20-20肥料の1グラム/L)。
  2. 一晩の回復のための96ウェルプレートで葉ディスクを収集します。
    1. 発芽後4~5週間(図1A)では、鋭い4mm生検パンチを使用して植物ごとに1枚の葉ディスクを除去し、中静脈を避け、創傷を制限するように注意する(図1B)。乾燥を防ぐために、100 μLのddH2 Oを含む未使用の96ウェル照明メータープレートに葉ディスクを上向きにして、アダクシャル側を上向きに配置します(図1C)。複数のイレータを評価する場合は、各エレータ処理のために同じ葉から1枚の葉ディスクを取り出します。
      注:サンプルの葉は、ロゼットの上部から3番目から5番目に完全に拡大され、変動性を制限するためにほぼ同じサイズと年齢です。可能であれば、一晩回収する前にかみそり刃を用いて葉ディスクを半分に切断し、これにより、引出液23に曝露される表面積が増加する。
    2. 葉ディスク収集中に傷によって生成されるROSの干渉を防ぐために室温で一晩回復する。蒸発を防ぐためにふたで板をカバーします。
  3. エライシャター処理を行い、ROS産生を測定します。
    1. これはROSバースト開始と記録された最初の測定値との間の時間を短縮するように、反応溶液を追加する前にプレートリーダーをプログラムします。プレート リーダーに適した商用ソフトウェアを使用します。この場合 (目次を参照)、[設定]をクリックし、LUM96 カートリッジとキネティック読み取りタイプを選択します。 [読み取り領域]カテゴリをクリックし、ドラッグして、読み取る井戸またはプレート全体のサブセットを選択します。[PMT] タブと [オプティクス]タブで、[タイミング] タブで積み込み時間を 1,000 ミリ秒に設定し、[合計実行時間]を 40 ~ 60 分に設定し、[間隔]を 2 分に設定します。
    2. マルチチャンネルピペットを使用して、各井戸から水を取り除きます。
      注:これは傷のストレスを引き起こし、より可変的なROS出力をもたらす可能性があるため、葉ディスクを穿刺しないでください。
    3. 100 μMルミノール、10 μg/mL HRP、および必要な濃度のエライケータ(例:1nMでelf18、10nM、100nM、または1,000 nM)を1つの96ウェルプレートに対して10mLの溶液を用いて無菌ddH2Oで含む反応溶液を調製する。
      注:低結合チューブに凍結乾燥性ペプチドを溶解し、10mMストックを作り、液体N2でフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。使用する準備ができたら、無菌H2 Oで在庫を希釈し、100μMの作業在庫を生成し、-20°Cで保存します。
    4. マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルに反応混合物の100 μLを分配し、同時に同じ処理のすべての葉ディスクに溶液を添加する22。各遺伝子型の対照反応(エリケータなし)を含め、引き出しがない場合に基底ROSレベルを評価する。マイクロプレートリーダーを使用して、可視スペクトル内のすべての波長の発光を即座に測定します。
      注:ルミノールおよびHRPは光感受性試薬であるので、低光の下で反応溶液を準備し、適用する。試薬は氷の上または-20°Cに保管してください。
    5. マイクロプレートリーダー内の40~60分の期間で2分間隔で1,000ミリ秒の積分時間で発光を測定し、動的酸化バーストを捕捉します(図1D)。
      注:アッセイ感度11を改善するために、より長い積分時間を使用して、96ウェルプレート内のすべてのサンプルを1つの間隔内で測定できることを保証します。
  4. データ解釈。
    1. 各遺伝子型について、スプレッドシート アプリケーションを使用して、各時点における平均フォトン数と標準誤差を計算し、散布図を使用して ROS 生産を時間の関数として表示します。
      figure-protocol-1
      t = 各タイム ポイント
    2. または、各リーフ ディスクのフォトン数を合計し、標準の誤差バーまたはボックスとウィスカープロットを含む棒グラフを使用して、各遺伝子型のこれらの値の平均を提示します。
      figure-protocol-2

2. 苗成長抑制アッセイ

  1. 種子を殺菌し、ムラシゲとスコウグ(MS)プレートに種をまきます。
    1. 0.8%寒天[w/v]を含む無菌半強度(0.5倍)MS培地(2.16g/L)を調製します。層流フードのプレート(90 x 15 mm)にメディアを注ぎます。
    2. 70%エタノールの1mLで2分間洗浄し、吸引により除去することにより、マイクロ遠心管で約100種を殺菌します。40%漂白剤の1 mLを追加し、室温で17分間穏やかに岩を加えます。吸引で漂白剤を取り出し、無菌水の1mLで3回5分間洗う無菌0.1%寒天の1mLで再懸濁する。
      注:または、塩素ガス種子殺菌プロトコル24を使用する。
    3. ピペットを使用してMS寒天プレート上の遺伝子型当たり約100種を種まき、層流フードにマイクロポアテープでシールします。
      注:これは後で苗を移植するのが困難になりますので、近くに種子を配置することは避けてください。
    4. 発芽を同期させるために3〜4日間4°C(光なし)にプレートを置くことによって種子を層状にする(図2A)。
  2. 免疫エライケーターペプチドを含む48ウェルプレートに苗を移植する。
    1. 階層化後、短い日の条件(22°C、10 h光、150 mE/m2/s光強度、および65-70%の相対湿度)の下でプレートを光に移動し、発芽を可能にします。
    2. 層流フードでは、1%のスクロース[w/v]を含む無菌0.5x MS液媒体中に、48ウェルプレートごとに25mLのMSを用いて、滅菌0.5x MS液媒体中にエレキターペプチド希釈(0nM、1nM、10nM、100nM、および1,000nM)を調製する。ウェル当たりのペプチドを含むMS液培地またはMS培地の500μLをピペッティングしてプレートを調作する。可能な場合は、プレートの調製にリピートピペッタを使用して、プロセスを迅速化します。
      注:各遺伝子型について、苗の成長に固有の違いを説明するために、引き出しを行わずにMSで苗を育てる。
    3. 無菌鉗子を使用して、同じ大きさと年齢の各井戸に1本の苗を慎重に移植し、根に苗や破損が生じないようにし、根が媒体に沈むことを保証する。各遺伝子型について、各ペプチド希釈に最低6~8個の苗を移植する(図2B)。
      注:短い根が操作しやすく、古い苗があまり最適な結果をもたらさないため、発芽後4日間の移植苗。
    4. マイクロポアテープでプレートをシールし、標準的な短日条件(22°C、10h光、150 mE/m2/s光強度、および65-70%の相対湿度)の下で光に戻ります。苗が8-12日間成長できるようにします。
  3. 成長率の増加抑制を決定します。
    1. 48ウェルプレートから苗を慎重に取り除き、ペーパータオルを手にして乾燥させます。分析スケールと記録値で苗の重量を量ります。使用可能な場合は、USB 出力を備えた分析スケールを使用して、スプレッドシートに新しい重量値を記録します。苗の計量を行う前に、成長抑制を視覚的に表示するために写真を撮る(図2C)。
    2. MSのみで栽培された苗と比較したエリケータ処理苗の増殖抑制率を次のように決定する(図2D)。
      figure-protocol-3
    3. 標準の誤差棒を持つ棒グラフを使用してデータをプロットするか、ボックスとウィスカープロットを使用して、実験的な分散をより良く表示します。

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結果

変異型cpk28-119、25およびbak1-517、18植物は、それぞれ酸化バーストおよびSGIにおいて、高および低免疫応答を有するゲノタイプの期待される結果を実証するために使用された。野生型のバックグラウンドコントロール(Col-0)に対するアッセイ。用量依存性効果を評価するために、elf18の10倍ペプチド希釈シリーズ(1〜1,000nM)を用いて使用した。予想通り、cpk28-1の機能喪失線はCol-0と比較して累積(図3A)と平均(図3B)ROSバーストが高かったのに対し、bak1-5は10nMの間の濃度でROS産生を減少させた。 1,00...

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ディスカッション

本論文では、アラビドプシスにおけるパターン誘発免疫応答をアッセイする2つの方法について述べ、特殊な装置を使用せずに免疫出力を評価する定量的アプローチを提供する。組み合わせで、パターントリガROSとSGIは、それぞれ微生物知覚に対する早期および後期の応答を評価するために使用することができる。

酸化バーストアッセイの主な制限は変動性です。完全に理解されていない理由から、絶対 LRL は実験間の大きさによって異なることがよくあります。実験間の変動性が高いため、野生型制御(Col-0など)に加えて、高い(例えば、cpk28-1)と低い(例えば、bak1-5)酸化バーストを含めるのが良い。しかし、実験間の再現性を高めるための対策を講じることができる。温度、湿度、光周期、光強度などの環境条件は、反復間で同一である必要があります。サンプリング時には、植物の年齢と健康も考慮する必要があります。葉ディスクは、短い日の条件(光の6〜10時間)の下で成長した年齢の4〜7週間の間にある植物から収集することができます。逸話的に,最も一貫...

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謝辞

私たちの研究室での仕事は、カナダの天然資源工学研究評議会(NSERC)ディスカバリープログラム、カナダイノベーション財団ジョンR.エバンスリーダーズファンド、クイーンズ大学を通じて資金提供されています。KSとISは、マスター学生のためのオンタリオ州大学院奨学金とNSERCカナダ大学院奨学金(CGS-M)によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20-20-20植物製品10529に1g / Lを混合し、最適な成長のために2週間ごとに植物に適用します。
4 mm Biopsy PunchMedical Mart232-33-34-P表面積 0.125 cm^2 のコルク穴あけ器セットも使用できます。
蓋付き48ウェル滅菌プレートSigma-AldrichCLS3548
ドラフト付き分析スケール SheidVWRVWR-225ACアッセイには、標準的な分析スケールを使用することができますが、コンピュータによる直接出力が最適です。
BioHit mLine メカニカル 12 マルチチャンネルピペット (30-300 uL)ザルトリウス725240任意のマルチチャンネルピペットが使用でき、必要に応じて1本のピペットでも使用できます。
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp721110 mM ストックペプチドを -80C で低タンパク質結合チューブに保存します。解凍後、100μMの作業用ストックを-20°Cで保管します。
鉗子フィッシャーサイエンティフィック22-327379
ワサビペルオキシダーゼSigma-AldrichP6782純水に溶解します。-20°Cで、光を避けて保管してください。
LuminolSigma-AldrichA8511DMSOに溶解します。-20°Cで、光を避けて保管してください。
Murisage and Skoog Basal SaltsCedarlane LabsMSP09-100LT4Cで保存します。
土壌SunGrow園芸サンシャインミックス#1他の土壌タイプもシロイヌナズナの栽培に使用できます。鍋に水を入れるときは水と混ぜてください。
SpectraMax Paradigm マルチモードマイクロプレートリーダー(LUMモジュール付き) 分子デバイスお見積りが必要です発光を検出できるプレートリーダーであれば、これらのアッセイに使用できます。
スクロースSigma-AldrichS0389-1KGで保存してください。
ホワイトポリスチレン96ウェルプレートフィッシャーサイエンティフィック07-200-589
肥料水 成長西洋は室温

参考文献

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