多重PCRと毛細血管電気泳動による魚病原性細菌エルシニアラッケリの多軌変動数のカンデム繰り返し分析

Summary

ここで提示されるマルチローカス可変数のたてがみ分析(MLVA)アッセイは、魚病原性細菌エルシニアラッケリの安価で堅牢でポータブルな高解像度ジェノタイピングを可能にします。純粋な培養から始まり、アッセイは多重PCRおよび毛細血管電気泳動を採用し、下流の適用のための10遺伝子座MLVAプロフィールを作り出す。

Abstract

ユルシニア・ラッケリは、世界中の養殖サケの重要な病原体であるが、この細菌の精巣学的調査(感染追跡等)に適した単純なツールが欠けている。したがって、マルチローカス可変数タンデムリピート分析(MLVA)アッセイは、回収された分離物の高解像度ジェノタイピングのための簡単にアクセス可能で明確なツールとして開発されました。ここで提示されるMLVAアッセイでは、培養Y.ラッケリサンプルから細菌細胞を水中で沸騰させることによりDNAを抽出し、続いてPCRのテンプレートとして上清を使用する。Y.ラッケリゲノム全体に散在する10個の可変数連動性(VNTR)遺伝子座を標的とするプライマーペアは、同一のサイクリング条件下で実行される2つの5プレックスPCR反応の間で均等に分布する。前方プライマーは、3つの蛍光色素のいずれかで標識されています。ゲル電気泳動によるアンプリコン確認に続いて、PCR製品を希釈し、毛細血管電気泳動を行う。得られたエレクトロフェログラムプロファイルから、VNTR遺伝子座のそれぞれを表すピークは、サイズと呼ばれ、シリコにおけるVNTRリピートカウントを計算するために使用される。結果として得られる 10 桁の MLVA プロファイルを使用して、クラスター分析によるエピゾーチロジー評価を可能にする最小スパニング ツリーを生成します。非常にポータブルな出力データは、数値 MLVA プロファイルの形式で、ラボ間で迅速に比較し、時空間コンテキストに配置できます。培養コロニーからエピゾチロジー評価までの全手順は、1営業日以内に最大48 Y.ラッケリ単離物で完了することができる。

Introduction

ヤルシニア・ラッケリは、グラム陰性細菌であり、ヤスニア科科のメンバーであり、世界中の養殖サケド魚でエルシニオシスを引き起^こす。多くの種類の寒天培地で培養することで感染魚から容易に診断されるが、最近まで、世界中のY.ラッケリの集団構造や上獣学について、また異なる生息地(宿主種など)についてはほとんど知られていなかった。Y.ラッケリのための既存の血清入力システムは一貫性がなく、相互互換性を欠き、低い疫学的分解能を提供する。細菌に関するいくつかの分子研究が行われており、マルチロカス配列タイピング(MLST)、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)または全ゲノム配列(WGS)解析2、3、4などの技術を用いて行われている。 ^、5.しかし、MLSTは日常的な感染トレースに十分な高分解能を提供しませんが、PFGEは手間がかかり、ラボ間で容易に移植できない結果を生み出します。WGS分析は、ほぼ究極の解決策を提供しますが、そのような分析の確立と実装は、比較的少数の研究所に制限されたままの技術的およびバイオインフォマティクス機能を前提としています。

マルチ遺伝子座変数数の連動分析(MLVA)は、WGS分析6、7とほぼ一致する場合に遺伝的分解能を提供する、シンプルで簡単にアクセス可能な分子タイピングツールを表します。この手法は、選択した変数番号の連動性 (VNTR) 遺伝子座の繰り返し数の変動に基づいており、転送性の高い出力データが得られ、オンライン データベースやラボ間でのプロファイリングされた分離の比較が簡単になります。MLSTは、多くの細菌病原体の疫学的タイピングのゴールドスタンダードのままですが、研究の増加は、MLVA8、9、10の有意に高い判別力を識別^します。また、フランセシエラ・ノアチュネンシス、エドワージエラ・ピシチダ、レニバクテリウム・サモニナラム11、12などの魚病原性細菌を標的にしたいくつかのプロトコルも発表されている。 ¹³.

ここで提示された10遺伝子座MLVAプロトコルは、最近広範なY.ラッケリ集団研究14の基礎を形成し、寒天栽培コロニー、多重PCRおよび毛細血管電気泳動(CE)からのDNAの抽出を含む。シリコアプリケーションで下流に続きます。各調べた単離物について、2つの多重PCRは、それぞれ個々のVNTR領域を標的とする5つの蛍光標識プライマーペア(6FAM、NEDまたはVIC)を含み、同一の条件下で並列に実行される。ゲル電気泳動(GE)によるPCRアンプリコンの検証に続いて、PCR産物はCE分析の前に希釈され、それぞれのVNTR遺伝子座を表すピークは、得られたエレクトロフェログラムファイルからサイズ呼び出されます。CE の渡り点パターンの小さなシーケンス固有の不一致を考慮した軌跡固有の数式と共に、VNTR CE サイズ呼び出しは、10 桁の MLVA プロファイルに連結された VNTR 繰り返しカウントを計算するために使用されます。これらは、エピゾーチロジー評価の入力として使用されます(例えば、最小スパニングツリー(MST)ダイアグラムにおけるクラスター解析による)。

Protocol

注意:プロトコル全体について、ラボコート、使い捨て手袋、滅菌試薬および機器を使用して、すべてのウェットラボ手順を無菌で行うことをお勧めします。また、PCR製品(ポストPCR)のPCR増幅および/または取り扱いに使用されない別の部屋(PCR前)でPCR反応を調製することをお勧めします。製造元の推奨どおりにすべての試薬を保管してください。使用する試薬、機器、ソフトウェアの詳細については、材料の表を参照してください。

1. 細菌培養とゲノムDNAの抽出

1. 任意の適切な寒天タイプにY.ラッケリ純粋な培養物を種まき(著者は5%ウシの血寒天を使用)、1〜2日間、または3〜4日間15°Cでインキュベートします。
2. 各寒天プレートから、接種ループを持つ単一の代表的なコロニーを選択し、50 μLの超精製水を含む1.5 mL遠心管に移します。100°Cの加熱ブロックで7分間中断、渦、インキュベートします。
3. 3分間16 000 x gの遠心分離機を使用し、ピペットを使用して上清を空の1.5 mL遠心管に慎重に移します。テンプレートDNAとして上清を用いて次の工程に進むか、そのような時まで-20°Cで保存する。

2. 多重PCRセットアップとサイクリング条件

注:各多重PCR反応(Y.ラッケリ単離物につき2個)は、2x多重PCRプラスマスターミックスの12.5 μL、各適切なプライマーペアの0.1〜0.2 μM(表1)およびテンプレートDNAの3μLを含むべきであり、25 μLの最終反応体積に調整する。RNaseフリー水の添加。蛍光ラベルのフォワードプライマーの光暴露を最小限に抑えることを目指します(例えば、貯蔵チューブをアルミホイルで包むことによって)。

1. 2つの多重PCRアッセイ(表1)のそれぞれについて、サンプル数にプラス1つの陽性および1つの負の対照に従って、上記のように(テンプレートDNAを含まない)マスターミックスを調出す。さらに、10%の余剰ボリュームを許可します。調製されたマスターは、低速で穏やかに混合する渦。
2. 各マスターミックスの22 μLを、サンプル数に応じてPCRストリップまたはプレート上の個々のウェルに別々に分配し、各ウェルに3μLのテンプレートを追加します(正対照および陰性コントロールの場合は、それぞれ検証済みのY.ラッケリのDNAを使用します)ひずみと超精製水)。シールと遠心分離機を簡単に。
3. 次のプログラムでPCRサーマルサイクラー上のすべてのサンプルを実行します:(i)95°C(ii)で0.5分、60°Cで1.5分、72°Cで1分、(iii)68°Cで60分、次に4°Cに冷却します。プログラムは3時間未満で完了します。

3. ゲル電気泳動によるPCRアンプリコン確認

1. メーカーの勧告に従って、テストされるPCR反応の数に適した1xトリスボレートEDTA(TBE)バッファーに1.5%(w/v)のアガロースゲルの体積を調製する。鋳造する前に、ゲル溶液の50μLあたりの蛍光核酸色素の5μLを加え、混合する。鋳造に適したトレイと櫛を使用し、適切な数の井戸をDNAリファレンスラダーに自由に残します。
2. 設定後、GEシステムの1x TBEバッファにゲルを沈めます。PCR製品の5 μLを2μLの荷重色素と一緒に混合し、ゲルウェルに移します。参考のために空の井戸に5 μLのDNAはしごを追加します。
3. 約 15 cm あたり 110 V でゲルを約 1 時間実行し、UV ベースのゲルイメージング/視覚化システムを使用して、PCR アンプリコンを表す複数の (最大 5 つ) バンドの存在を確認します (図 1の例を参照)。ゲルを捨てます。次の工程に進むか、残りのPCR製品を4°Cで保存し、さらに処理します。

4. 毛細血管電気泳動セットアップと実行条件

1. PCRアンプリコンの確認後、精製水中のPCR製品1:10(v/v)を希釈する。シール、ミックス、遠心分離機を簡単に。
2. ヒューム食器棚で作業し、PCR製品あたり9 μLのホルムアミドと0.5 μLのサイズ標準からなるマスターミックスのボリュームを準備します(10%の余剰容積を可能にします)。渦は、希釈されたPCR製品の0.5 μLを追加する前に、利用可能なCEシステムに適したプレート上のウェルに9.5 μLを簡単に分配します。シール、ミックス、遠心分離機を簡単に。
   注意:取り扱いは注意して。ホルムアミドと水を混合すると、有毒であるギ酸が生成されます。
3. PCRサーマルサイクラーを使用して、4°Cに無期限に冷却する前に3分間95°Cでサンプルを変性させます。遠心分離機を簡単に取り付け、製造元の指示に従って校正されたCEシステムにプレートをロードします。
4. 選択した装置および次の設定のために適当に試薬を使用してフラグメント分析CEを実行する:60 °C;1.6 kV(cmあたり32 V)で5 s注射。15 kV(cmあたり300V)で32分の走行時間。24毛細血管(50 cm)上の24ウェルのCE断片分析は、通常、約50分かかります。

5. VNTRサイズの呼び出し、繰り返しカウント計算とMLVAプロファイリング

注:ステップ 5.1 では、材料の表に記載されている特定のソフトウェアを使用して、エレクトロフェログラム ファイルから呼び出すY. ラッケリVNTR CE サイズについて説明します。その他の詳細とトラブルシューティングについては、ソフトウェアマニュアルを参照してください。その他のソフトウェアを使用する場合は、適切なマニュアルを参照してください。

1. CE 結果ファイルをインポートします(Y. ラッケリ分離ごとに 2 つ)。分析方法をマイクロサテライトデフォルトに設定し、[分析]ボタンを押す前に、サイズ標準で適切な製品選択を選択します。サイズ一致エディターを使用してサイズ標準フラグメントを正しく識別し、目に見える誤った割り当てを修正します。
   1. 読み取るサンプルを選択した後、[プロットの表示]ボタンを押し、Ctrlキーを押しながら Aキーを押して、サイズ変更テーブルの表示を有効にします。トップパネルで、VNTRアンプリコンを表す5つのピークをクリックしながらCtrlを押したままにします(必要に応じてズームツールを使用します)。
      注:多重PCR産物のそれぞれについて、エレクトロフェログラムは、採用された3つの染料の間に分布する5つのピークを示します(表1のフォワードプライマーの5'色素標識と図2の2つの例を参照)。
   2. Ctrl キーを押しながら G キーを押して、5 つのハイライト表示されたピークの特性のみを表示するサイジング テーブルをフィルタリングし、ダウンストリーム アプリケーションの各 VNTR 軌跡 (表1を参照)の CE サイズコールを記録します。
2. CE中の偏ったアンプリコン移動パターンを考慮するために、以下に示す式に従って正確なVNTR繰り返しカウントを計算し、軌跡特異的変数と共にVNTR CEサイズ呼び出しを採用する(表1参照)。効率を上めるには、このプロセスを自動化することをお勧めします (例えば、スプレッドシートテンプレートを使用して)。
   
3. ラウンド計算された VNTR 繰り返しは、最も近い整数にカウントされ、10 桁の文字列に連結され、それぞれが単一の Y.ラッケリ分離の MLVA プロファイルを表します。

6. MLVAデータの最小スパニングツリークラスタ分析

注:ステップ 6 では、材料の表に記載されている特定のソフトウェアを使用して、Y.ラッケリMLVA データから MST ダイアグラムを作成する方法について説明します。その他の詳細とトラブルシューティングについては、ソフトウェアマニュアルを参照してください。その他のソフトウェアを使用する場合は、適切なマニュアルを参照してください。

1. 新しいデータベースを作成し、MLVA プラグインをアクティブにすることを選択します。
2. Y. ラッケリMLVA プロファイルとメタデータをインポートする文字タイプのデータを選択し、その後にインポート フィールドと文字が続きます (ストレージ形式に応じてさらにサブ選択します)。プロンプトが表示された場合は、インポート ファイルの内容に従ってインポート ルールを指定します:宛先タイプ列で、VNTR 繰り返しを文字値として分類します: VNTR、およびその他のメタデータをエントリ情報: エントリ情報フィールド.
   注:比較およびコンテキストについては、現在の MLVA プロトコル¹⁴を採用した元のペーパーと共に、パブリッシュされたデータセット全体 (オープン アクセス) をインポートすることもできます。Y.ラッケリ分離物(n = 484)の多様なコレクションに関するMLVAプロファイルとメタデータは、その研究で精査され、その補足材料(表S1およびS2)から次のリンクを通じて入手可能https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
3. 実験タイプパネルで、VNTRエントリを開き、各VNTR軌跡の最小値と最大値をそれぞれ0と100に設定します。[全般設定]で、小数点以下の桁数を0に設定し、[データ型]で[数値]を選択します。不在値をゼロと見なすように確認します。
4. MST クラスター分析用にインポートされたサンプルを選択し、[新しい比較の作成] ボタン (比較パネル) をクリックします。
   1. MST の視覚的な表示が必要な場合は、[グループ] パネルで使用できるさまざまなオプションを使用して、サンプルを色付きのグループ (特定のメタデータ特性に従ってなど) に割り当てます。
      注:グループは、次の手順の後に遡及的に作成または変更することもできます。
   2. 選択したサンプルに基づいて MST ダイアグラムを生成するには、カテゴリ データの [高度なクラスター分析]と[MST]を選択します。
   3. さらに、MST の視覚的な表示を優先として変更します (例えば、パーティションパラメータ、ノード/ブランチ ラベリング、架面、凡例などを追加するなど)。図 3の例を参照してください。
      注:クラスター(クローン複合体)のパーティション分割しきい値 ≤4/10 非同一VNTR lociは、>5/10 非同一VNTR lociを表す分岐接続の隠蔽に加えて、以前に生成されたMLVAデータに基づくMSTクラスター分析に採用されていた。このプロトコル^{14 を}使用します。前述の 484 Y. ラッケリMLVA プロファイルのデータセットがインポートされた場合、これらのサンプルは MST クラスター分析 (前述のように) に含めて、グローバルおよび履歴コンテキストを提供することもできます。これは、例えば、前述のクローン複合体と関連するサンプル、ならびにまだ説明されていない系統を表すサンプルの同定を容易にする。使用可能なメタデータに応じて、結果として得られる MST ダイアグラムは、特定の特性 (地理、ホスト、時間など) にリンクされた最終的なクラスタリング パターンを検出するなど、さまざまな方法で精査できます。
   4. 必要に応じて、[画像のエクスポート] 選択を使用して、ファイナライズされた MST を必要な形式でエクスポートします。

Results

ここで説明するマルチプレックス PCR に続いて、各 PCR 反応から複数のアンプリコンの存在を検証する典型的な GE イメージを図 1に示します。検証済みPCR産物に対して行われた下流CEフラグメント解析は、検査したY.ラッケリ分離液ごとに、それぞれのVNTR遺伝子座のサイズ呼び出しに使用される2つのエレクトロフェログラムファイルをもたらす(図2)。484種のY.ラッケリ単離物の分析から、同じ多重反応で同じ色素で標識されたVNTR遺伝子座間でアンプリコンサイズ範囲の重複は認められなかった(表1)14。したがって、各電気泳動ピークは、色によって明確に識別することができます。

MLVAプロファイルと関連メタデータを優先ソフトウェアにインポートした後、MSTダイアグラムは、材料に関心のある疫学的パターンを精査するために記述されているように構築することができます。それぞれのソフトウェアで利用可能な追加オプションについては、適切なマニュアルを参照してください。例として、図3は、ノルウェーの5つの異なるサケ農場に関連する魚から回収されたY.ラッケリ分離物のMLVAプロファイルのMSTによる比較を示しています。

10個のVNTR遺伝子座の一貫した繰り返しサイズ、ならびにそのインビトロおよび生体内安定性は、この^{プロトコル14}に基づく元の研究で以前に検証されている。簡単に言えば、これはサンガーシーケンシング(リピートサイズ)を使用して行われ、MLVAは、連続した通路(インビトロ)に続く複数の単離物をMLVAタイピングし、個々の疾患の発生内(インビボ)から行いました。さらに、大西洋サケの永続的に感染した淡水生産地から数年にわたって回収された複数の「ハウス株」を入力して、時間の経過とともに遺伝子座の環境安定性を調べた。

図 1:複数のPCR製品の存在を確認するゲル電気泳動。画像は、サンプルを含むすべての12レーンに複数のPCRアンプリコンの存在を確認し、使用されるDNAはしごを表す最初のレーンを使用しています。選択されたはしご断片のサイズは、PCRアッセイと歪みを持っているように示されています(Gulla et al. 2018¹⁴の表S1を参照)各レーンの所属。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: VNTRアンプリコンに対応するピークを示すエレクトロフェログラム。異なるVNTR遺伝子座の名前が示され、色素ラベル(VIC = 緑;NED = 黒;6FAM = 青) を括弧内に入れ。2つの電気フェログラム(PCRアッセイ1トップ;PCRアッセイ2ボトム)は、単一のY.ラッケリ分離のタイピングに由来する。オレンジピーク(色素LIZ)は、採用されるサイズ基準を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 疫学的評価のための最小スパニングツリーの例。この図は、5つの異なるノルウェーの農場(1-5;伝説を参照)で大西洋サケから回収されたY.ラッケリ分離物からのMLVAプロファイルに基づいており、再発性のイリニスオシスの発生を経験しています。農場の起源にリンクされた明確なクラスタリング傾向が観察される。架線は、≤1/10 非同一VNTR遺伝子座を含むすべての可能な接続を示しています(凡例を参照)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: スタッターとスプリットピークを可視化するエレクトロフェログラム。この場合、両方が同時に発生しますが、必ずしもそうであるとは限りません。YR1070 VNTR軌跡を表す長くて背の高いピークは、容易に区別することができる。ディスプレイは拡大され、青色染料のピークのみが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: VNTR イナカス特性.本MLVAプロトコルで標的とされた10 Y.ラッケリVNTR領域の関連特性。

Discussion

ここで提示される多重PCRはいずれも、テンプレートDNA品質が悪い面で比較的堅牢に見えたが、非常に高いDNA濃度のテンプレートを使用する場合、PCR増幅の欠如が時折観察された。これらの問題は、PCR の前にテンプレートを希釈することで容易に解決されました。ここで採用されるものよりもDNA抽出のための他の方法も使用されてもよい(例えば、市販キット)。

各多重PCR反応から5つのアンプリコンが期待されますが、同じ反応内の一部の(異なるラベル付き)VNTR遺伝子座はサイズ範囲が重複しているので、5つの視覚的に区別可能なバンドがGEから常に期待されるとは限りません。最終的なPCR延長時間は60分短縮される可能性がありますが、その後のCEエレクトロフェログラムにおける分割ピークの発生が増加する可能性があります(下記参照)。特に、GEステップの目的は純粋にPCRアンプリコンの定性検証のためであるので、ランタイム、電圧および/またはゲルレシピは好ましいように調整され得る。GEによって特に弱いバンドが観察される場合は、CEの前にそれらのサンプルの希釈係数を減少させるのが望ましいかもしれません。

ここで説明するCEプロトコルは、特定の市販の毛細血管電気泳動装置(材料の表を参照)上で実行されましたが、異なるCEシステムは異なるサンプル要件を有する可能性があり、プロトコルにいくつかの変更を促す可能性があります。.フラグメント分析の適切な試薬/機器、キャリブレーション等の説明については、各CEシステムメーカーのマニュアルを参照してください。また、CE中に観察される偏ったアンプリコン移動パターンは、他のMLVAプロトコル15、16について以前に文書化されているように、CEシステムおよび/またはマシン間で比較的異なる可能性があります。最終的な(丸められた)VNTR繰り返しカウントが影響を受ける程度に発生する場合、これは、VNTR繰り返しカウントを決定するために使用される軌跡特異的変数sおよびi(表1)を再キャリブレーションする必要があることを意味します。 これには、Gulla et al. 2018¹⁴で説明されているように、正確なシーケンス サイズと CE サイズ呼び出しを比較するプロットの線形回帰が含まれます。

スプリットピークおよびスタッターピークは、CEベースのMLVAタイ^ピング17における既知のアーティファクトの両方が、サイズ呼び出し中のエレクトロフェログラムで観察されてもよい(図4)。スタッターピークは無視する必要がありますが、単一のベースペアで区切られた分割ピークの場合、ダウンストリームアプリケーションでは長いピークを一貫して選択する必要があります。さらに、特定のVNTR遺伝子座の欠如を示す不存在のピークはまれであるが、その場合、繰り返しカウント'0'を割り当てる必要があります。DNAが抽出される開始培養物が純粋でない場合(すなわち、複数のY.ラッケリサブタイプを含む)、同じ遺伝子座/遺伝子座の異なるアレルに対応する複数の背の高いピークがCEの後に観察されてもよい。二次栽培は、再タイピングのための新しいDNA抽出の前に、単一のコロニーから行う必要があります。

プロトコルで述べたように、PCRのテンプレートDNAは、デフォルトでY.ラッケリの純粋な培養物から抽出されるべきである。しかし、いくつかのケースでは、qPCR(Ct値<27)によるY.ラッケリに陽性の卵液試料を試験し、事前培養を行わずに直接MLVAを直接入力し、増加量のゲノムDNA(市販キットで抽出)をテンプレートとして使用することに成功した。このアプローチは広範囲にテストも検証もされていないが、Y.ラッケリに加えて、様々な生物のDNAを含む複雑な生物学的マトリックスを調べるためのこのMLVAアッセイの可能性を示している。

ここで提示されるMLVAタイピング手順全体は、DNA抽出から精巣学的評価まで、1営業日で完了してもよい。しかし、検査されたサンプルの数は、DNA抽出、PCRおよびCEに必要な時間との線形関係にあり、したがって、複数のサンプルを同時に実行する場合、この方法ははるかに時間効率が高くなります。これは、ほとんどのラボベースの方法の場合であり、Y.ラッケリの疫学的サブタイピングのためのツールとして、高解像度、シンプルさと移植性の組み合わせとして、このMLVAアッセイは、以前に公開されたプロトコルよりも優れています^{4 、5}.また、Y.ラッケリ血清14の限られた疫学的関連性を検証するためにも使用されている。

484 Y.ラッケリ分離物を含む包括的なMLVAベースの人口調査を通じて、様々な時空間起源と生息地(宿主魚、環境など)から回収され、エピゾチオロジーと人口に関する我々の理解この重要な魚の病原体の構造は実質的^に14増加した。MLVAタイピングは、おそらく魚の輸送を通じて、おそらく数十年にわたって人類学的に広まったクローンのトレースだけでなく、局所的に限定された株の同定を可能にしました。さらに、細菌のいくつかのクローン複合体は、特定の魚の宿主(それぞれ虹マスと大西洋サーモン)の病気に明らかに関連している可能性がありますが、他のものは、環境源および/または臨床的に影響を受けていない魚からしか回収されませんでした。標本。したがって、この方法の適用性は感染トレースに限定されるものではなく、ワクチンの開発、リスク評価、国家バイオセキュリティの維持など、潜在的な関連性に関する情報を提供する可能性もある。現在、ノルウェーの水産養殖におけるY.ラッケリ診断を調査するためのツールとして、ノルウェー獣医学研究所で積極的に使用されています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22°CC/15&�;Cインキュベーター	お好みで。
5' 標識プライマー、10K PMOL、脱塩、乾燥	サーモフィッシャーサイエンティフィック	450007	配列および標識を表 1 に示します。TEバッファーで作業用アリコートを調製します。
アガロース、ユニバーサル、peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	ゲル電気泳動中に使用されます。
Avant 3500xL 遺伝子分析装置	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A30469	キャピラリー電気泳動フラグメント分析に使用されます。
BioNumerics7モジュール	応用数学NA		MLVAデータから最小スパニングツリーを生成するために使用されます。
遠心分離機(s)	お好みで。
Custom DNA Oligo、25N、脱塩、乾燥	モフィッシャーサイエンティフィック	A15612	配列を表 1 に示します。TEバッファーで作業用アリコートを調製します。
DNA ゲルローディング色素 (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611	ゲル電気泳動中に使用されるローディング色素。
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	DNA抽出時に使用される遠心分離チューブ。
冷凍庫	お好みで。		NA
ヒューム食器棚	お好みで。
ゲル電気泳動システム	好ましいものとして。
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water	Biotium	41003	ゲル電気泳動中に使用される蛍光核酸色素。
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	キャピラリー電気泳動からのエレクトロフェログラムの読み取りに使用されます。
GeneRuler 50 bp DNA ラダー、すぐに使用できる	Thermo Fisher Scientific	SM0373	DNA ラダーは、ゲル電気泳動中に使用されます。
GeneScan 600 LIZ 色素サイズ標準 v2.0	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4408399	キャピラリー電気泳動中に使用されるサイズ標準。
ヒーティングブロック	お好みで。
Hi-Diホルムアミド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4311320/4440753	キャピラリー電気泳動中に使用される脱イオンホルムアミド。作業用アリコートを準備します。
Milli-Q水	NA		NA PCRおよびキャピラリー電気泳動で使用される精製水。標準レシピ;自社生産。
マルチプレックスPCR プラス キット	Qiagen	206151/206152
PCRサーマルサイクラー	お好みで。
NA POP-7 3500 Dx/3500xL Dx用ポリマー Dx遺伝子分析装置	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26077/4393713/4393709	キャピラリー電気泳動中に使用される分離マトリックス。
純粋培養 Yersinia ruckeri	NA	NA	例:冷凍保存または新鮮。
RNaseフリー水	Qiagen	NA	In: マルチプレックスPCR プラス キット
トリスホウ酸EDTA(TBE) バッファーNA		NA	標準レシピ;自社生産。
トリプシン大豆寒天/牛血液寒天		NA	標準レシピ;自社生産。
UVベースのゲルイメージング/視覚化システム	お好みで。		NA
ボルテクサー	お好みで。		NAの