Method Article

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

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ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

Abstract

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中枢神経系のニューロンのペアはしばしば複数のシナプスの連絡先および/または機能神経伝達物質のリリース サイト (シナプス多重度) を形成します。シナプスの多様性は開発中とされているシナプス伝達の有効性の重要な決定要因、さまざまな生理的条件で変化とプラスチック。ここでは、我々 は終了急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して指定されたシナプス後ニューロンにシナプスの多様性の程度を推定するための実験を概説します。具体的には、自発性興奮性シナプス電流 (sEPSCs) の振幅とミニチュア興奮性シナプス電流 (mEPSCs) の違いを比較する電圧クランプ記録がされます。このメソッドの背後にある理論は、多様性を示す求心性入力は各シナプスの接触時に発生する同期のリリースのための大きい、電位依存性 sEPSCs を表示すること。対照的に、活動電位に依存しないリリース (これは非同期) 小さい振幅 mEPSCs が生成されます。この記事は一連の実験とシナプスの多様性の存在を特徴付けるための分析の概要し、要件と技術の限界について説明します。この手法は、生体に影響を与える異なった頭脳区域でシナプスの連絡先の組織でどのように異なる行動、薬理学的または環境介入を調査に適用できます。

Introduction

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シナプス伝達機構はニューロン間のコミュニケーションのため、したがって、脳の機能。シナプス伝達は、不安定なも、変調信号1への応答ようにも活動に依存した方法でその効果を変更できます。したがって、シナプス機能を調べると、神経科学研究の主要な焦点がされています。全細胞パッチ クランプ電気生理学は私たちを案出する実験デザインとデータ解析によるシナプス伝達の詳細な生物物理・分子機構を理解することができる汎用性の高いテクニックです。一般的なアプローチ、おそらく技術とコンセプトのシンプルさ、ためにミニチュア興奮性/抑制性シナプス後電流の測定は (私/Ips) 電圧クランプ構成2,3,4,5,6個々 Mpsc は、それぞれ神経伝達物質シナプス前ターミナル7 から解放の結合への応答のイオン型シナプス後受容体 (例えば AMPA とギャバA受容体) を介してイオンの流れを表す。.電位依存性 Na+チャネル ブロッカー テトロドトキシン (TTX) の存在下で記録を取得するとため、リリースの活動....

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Protocol

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すべての動物実験は、動物のケア委員会のウェスタン オンタリオ大学動物ケアのガイドライン (AUP #2014-031) のカナダの評議会に従ってによって承認されます。

1. ソリューション

  1. ソリューションをスライス
    1. スライスの溶液組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 1 x スライス ソリューション NaHCO3, グルコースおよびスクロースを ddH2O を溶解し、20 x の在庫を追加します。浸透圧は 315 320 mOsm の間を確保し、4 ° C で 1 週間以上のソリューションを保存
    4. 100 ml のソリューションをスライスの 2 つのビーカーを記入し、パラフィルムで覆います。ソリューションは部分的 (-80 ° C のフリーザーで約 20 分) をフリーズになるまで冷凍庫でソリューションを冷やします。氷の上の 95% O25% CO2 20 分のソリューションをスライスの両方のビーカーをバブル ガス分散管を用いたします。

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Results

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上記のプロトコルでは、例としてマウス視床下部ニューロンを用いたシナプスの多様性の度合いを調べる細胞パッチ クランプ電気生理学を使用する方法について説明します。このスライスの準備方法は、腫れ膜または核 (図 1) を持っていない健康な生菌を得られるはず。プロトコルの各ステップは組織や録音の質の健康のために重要です。

figure-results-1
図 1: 次の正常および異常な組織スライスの準備。40 倍の倍率で差動干渉の対照の光学 [PVN の電気生理学の準備にスライスします。健康な細胞を示す赤い矢印と黒い矢印は、不健康な細胞を示します。

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Discussion

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成功したパッチ クランプ電気生理学実験のための重要な要件の 1 つが健康的なスライス/セルを取得します。ご説明されているプロトコルは、PVN ニューロンを含む視床下部のスライスに最適です。他の脳領域が必要があります変更・ スライス方法21,22,23,24。録音だけ膜抵抗などセルのプロパティを常に監視することにより安定した録音を受け入れることが重要です容量とアクセス抵抗。抵抗の増加する EPSC 振幅が低下し、したがって振幅測定を混同します。したがって、20 MΩ を超えると、録画中に 20% 以上増加するアクセス抵抗値を持つセルは破棄されます。同様の減少 (または低い) の膜抵抗は貧しい空間クランプにつながるし、したがって、振幅を減少させることができます。ターゲット システム (併せもつ PVN ニューロン) ニューロン 500 MΩ と 1 GΩ の高い膜抵抗、500 MΩ の下.......

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Disclosures

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著者がある何も開示するには

Acknowledgements

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J. s. は、オンタリオ州の大学院の奨学金を受け取った。ウィスコンシン. は、精神的な健康の研究のカナダから新しい研究者フェローシップを受けた。この作品は、健康の研究 (PJT 148707) 自然科学と工学研究会のカナダ (06106-2015 RGPIN) およびカナダの研究所から W.I に運営費交付金によってサポートされます。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mLシリンジBD309659
10 ブレードFisher Scientific/others35698
22 bladeVWR/others21909-626
22 μMシリンジフィルターミリポア09-719-000
アドソン・フォレセップス ハーバード・インスツルメンツ72-8547
斜め鋭ハサミハーバード・インスツルメンツ72-8437
クランペックス分子デバイスpクランプ 10
両刃刃VWR74-0002
濾紙シグマ・その他1001090
ファインペイントブラシフィッシャー/各種15-183-35/各種
ガス分散チューブVWRLG-8680-120
イソフルランフレゼニウス カビ/その他M60303
クレイジー接着剤各種
ミニ分析SynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor Incモデル5600
パラフィルムシグマPM-996
ツールピペットVWR14672-200
phメーターラートレドFE20-ATC
ゴム電球
メスハンドルNo.3ドインスツルメンツ72-8350
ハンドルNo.4ドインスツルメンツ72-8356
片刃刃 VWR55411-050
ビブラトームスライサーライカVT1200S
浄水システムミリポアミリQ アカデミック A10
ウェルプレート蓋フィッシャー/各種07-201-590/各種
<強力>化学薬品/試薬
4-APシグマ275875
BAPTA分子プローブB1204
CaCl2*2H2OΣC7902
CdCl2σ202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
グルコースΣG5767
HEPESΣH3375
K2-ATPΣA8937
KClΣP9333
K-グルコン酸ΣG4500
MgCl2*6H2OΣM2670
分子生物学グレード水ΣW4502-1L
Na3GTPΣG8877
NaClBioshopSOD001.1
グルコン酸Na-グルコン酸ΣS2054
NaH2PO4Σ71504
NaHCO3ΣS6014
ピクロトキシンシグマP1675
SrClグ255521
スクロースバイオショップSUC507.1
TTXアラモンラボT-550
yDGGトクリス6729-55-1
パスメトVWR82024-550ハーバーメスハーバーシマ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

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Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

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