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方法論記事

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

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DOI:

10.3791/59472

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2019年5月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。

要約

免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイド、多発性骨髄腫の治療のためのすべてのFDA承認薬は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロスのユビキチン化および分解を誘導する(IKZF3)プロテアソメ分解のためのセレブロン(CRBN)E3ユビキチンリゲスを介して。IMiDsは最近、CRBN E3リゲスによるユビキチン化およびプロテアソーム分解のための他のタンパク質を標的とするキメラ(PROTAC)を標的とする二機能性プロテオリシスの生成に利用されている。ポマリドマイドベースのホモビ機能PROTACを設計・合成し、CRBNの自己指向ユビキチン化と分解を誘導する能力を解析した。ここで、CRBNは、E3ユビキチンライゲスとターゲットの両方を同時に機能する。ホモ-PROTAC化合物8は、IKZF1およびIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、高い効力を持つCRBNを分解します。化合物8によるCRBN不活性化は、細胞生存率および異なる多発性骨髄腫細胞株の増殖に影響を及ぼさなかった。このホモ-PROTACは、多発性骨髄腫細胞におけるIMiDsの効果を損なう。したがって、当社のホモディメリックポマリドミド系化合物は、CRBNの内因性基質と生理機能を同定し、IMIDsの分子機構を調るのに役立つ可能性があります。

概要

免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイドは、すべて多発性骨髄腫の治療のために承認され、E3ユビキチンリゲスセレブロン(CRBN)、カリン4A-RING E3ユビキチンリゲスの基板アダプターに結合する(CRL4CRBN)1,2,3.IMiDsの結合は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロス(IKZF3)に対するCRL4CRBNの親和性を高め、そのユビキチン化と劣化を引き起こし(図1)4、5、 6,7,8.IKZF1およびIKZF3は多発性骨髄腫細胞に不可欠であるため、それらの不活性化は増殖抑制をもたらす。SALL4は最近、サリドマイド9、10によって引き起こされた1950年代のテラトジェニシティといわゆるコンテルガン大惨事の原因となる可能性が高いCRBNの追加IMiD誘発ネオ基板として発見された。対照的に、カゼインキナーゼ1α(CK1α)は、染色体5q欠失11を有する骨髄異形成症候群における治療効果に関与するCRBNのレナリドミド特異的基質である。

分解のために特定のタンパク質を標的とする低分子の能力は、現代の薬剤開発にとってエキサイティングな意味を持っています。サリドマイドとその類似体のメカニズムは、ヒトで初めて使用された後に発見されたが、いわゆるPrオテオリシスTaはCヒデラス(PROTAC)と呼ばれ、目的のタンパク質(POI)を特異的に標的にするように設計されている(図)2)12,13,14,15,16,17,18.PROACは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)18、19、20、CRBNのようなE3ユビキチンリガーゼのリガンドにリンカーを介して接続されたPOIのための特定のリガンドからなるヘテロビ機能分子である。 21、22。PROTACは一過性三項複合体の形成を誘発し、POIをE3ユビキチンリゲスに導き、そのユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらす。従来の阻害剤に比べてPROTACの主な利点は、POIへの結合がその阻害よりも十分であり、したがって、PROTACは、薬物使用不能と考えられていたものを含む、はるかに広い範囲のタンパク質を標的にする可能性があることです。転写因子15.さらに、キメラ分子は触媒的に作用するため、高い効力を有する。POIへのユビキチン転移後、三項複合体は解離し、新しい複合体の形成に利用できる。したがって、非常に低いPROTAC濃度は、標的タンパク質23の分解のために十分である。

ここでは、それ自体の劣化のためにCRBNを募集するポマリドマイド-ポマリドマイド共役ホモ-PROTAC(化合物8)の合成について説明する24.E3ユビキチン・リガーゼCRBNは、リクルーターとターゲットの両方を同時に務めます(図3)。データを検証するために、負の結合制御(化合物9)も合成しました。 我々のデータは、新たに合成されたホモ-PROTACがCRBN分解に特異的であり、他のタンパク質に対する影響が最小限であることを確認します。

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プロトコル

1. PROTAC分子の調製

注意:使用前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、有毒で発癌性です。適切な安全対策と個人用保護具をご利用ください。

  1. テルト-ブチルN-(2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物1)
    1. 1,1'-カルボニルジミダゾール(1.95g、12mmol)と触媒量4-(ジメチルミノ)ピリジン(5mg)をTHF(2.46g、10mmol)の混合物に加え、100mLのラウンドボトムフラスでフラスクを加えます。明確な溶液が形成されるまで攪拌しながら10時間還流で熱する。
    2. ロータリーエバポレータで減圧下の溶媒を取り出し、EtOAc(200mL)を加え、分離漏斗に移します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を洗浄し、Na2SO4の上に乾燥させます。
    3. シリカゲル(直径5cm、高さ5cm)の短いパッドを通して溶液を濾過し、EtOAcのさらなる容積(200 mL)で溶出します。
    4. 溶媒を蒸発させ、得られた無色固体を真空中で乾燥させる。
  2. テルト-ブチルN-(1-メチル-2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物2)
    1. 化合物1(2.28g、10mmol)と粉砕炭酸カリウム(2.76g、20mmol)とDMF(25 mL)を100mLの丸底フラスコに組み合わせます。 注射器を使用してヨードメタン(1.42g、0.62 mL、10 mmol)をドロップワイズに追加し、フラスコに穴あけゴム中隔を装備します。反応容器を超音波浴に2時間入れます。
    2. EtOAc(100 mL)で反応混合物を希釈し、分離漏斗に移します。有機層を1 N NaOH(2x 25 mL)、H2O(25 mL)、塩水(25 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させます。
    3. 溶媒を濾過し、蒸発させる。石油エーテル/EtOAc(2:1)を使用して、シリカゲル(6cmカラム直径と20cmの高さ)上のカラムクロマトグラフィーで製品を精製します。
  3. 2-(2,6-ジオキソピプリジン-3-yl)-4-フルオロイソインドリン-1,3-ジオン(化合物3)の調製
    1. 3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド1(1.14g、5mmol)、酢酸ナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で50mLの丸底フラスクに加え、バルフラスを含むフラスコを含みます。 混合物を120°Cで6時間加熱します。
    2. 冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。
  4. 4-フルオロ-2-(1-メチル-2,6-ジオキソピオリジン-3-yl)イソインドリン-1,3-ジオン(化合物4)
    1. 3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド2(1.21g、5mmol)、アセテートナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で100mLの丸底フラスクで凝縮します。 混合物を120°Cで6時間加熱します。
    2. 冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。
  5. テルブチルN-[2-[2-][2-[2-[2,6-ジオキソ-3-ピプリジル]-1,3-ジオキソ-イソインドリン-4-yl]アミノ[エトキシ]エトキシ[エトキシ]カルバメート化合物(7)
    1. 50mLの丸底フラスコをテルトで充電 -ブチルN -[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル[カルバメート(5,0.41g、 1.65 mmol)、化合物3(0.41g、1.50 mmol)、乾燥DMF(10 mL)およびDIPEA(0.39グラム、0.51 mL、3.0ミリル)。 攪拌棒と還流コンデンサーを装備します。アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。
    2. 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を塗り、フィルターを使用し、真空中に濃縮します。
    3. 石油エーテル/EtOAc(1:1~1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム径および高さ60cm)上のカラムクロマトグラフィーで粗質な製品を浄化します。
  6. ホモジマーの調製(化合物8)
    1. α、ω-ジアミンリンカー6(0.22g、0.22mL、1.50 mmol)、DIPEA(1.05mL、6.00mmol)、および50mLのラウンドボトムフラスクで3(0.83g、3.00 mmol)の溶液を50mLのラウンドボトムフラスクで組み合わせます。 アルゴン雰囲気下で18時間90°Cで熱する。
    2. 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を乾燥させ、フィルターを使用して真空中に濃縮します。
    3. EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。
  7. ヘテロダイマーの調製(化合物9)
    1. 乾燥CH2Cl2(10mL)に化合物7(0.83g、1.65mmol)を溶解する。 トリフルオロ酢酸(10mL)を加え、黄色の混合物を40°Cで2時間、閉じた50mLの丸底フラスコでかき混ぜます。
    2. 揮発性物質を除去し、CH2Cl 2(4x 5 mL)で凝ババポレートします。残渣を真空で10時間乾燥させます。
    3. 乾燥したDMF(20 mL)で材料をリディス溶解します。化合物4(0.44g、1.50 mmol)とDIPEA(0.78g、1.05 mL、6.00 mmol)を追加し、フラスコに還流凝縮器を装備します。 アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。
    4. 室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。飽和NaHCO 3(50 mL)、H2 O(50 mL)、10%KHSO4(50 mL)、H2 O(50 mL)、塩水(50mL)で有機層を洗浄し、Na2 SO4上に乾燥させ、フィルターを真空中に濃縮します。
    5. EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。
    6. 核磁気共鳴(NMR)上のDMSO-d6における1H NMRおよび13C NMRスペクトルによる分子構造(図5A化合物8、5B化合物9)の解明と検証分光 器。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により、両方の化合物の純度が97%を超え、ダイオードアレイ検出(DAD)を220~500nmで適用することを確認してください。

2. PROTAC分子の機能的検証

  1. PROTACによるCRBN分解のウェスタンブロット分析
    注:化合物の効果8およびコンパウンド9CRBNタンパク質レベルに関して、ウェスタンブロット分析により試験した。また、IKZF1 レベルおよび IKZF3 レベルへの影響も確認できます。図 6).
    1. サンプル調製
      1. 化合物8および9、レナリドミド(Len)、ポマリドミド(Pom)、MG132、およびMLN-4924を10mMの濃度で溶解し、アリコートをさらに使用するまで-80°Cで保存する。
      2. 2.5 mL媒体を用いて6ウェルプレートにシード1 x 106 MM1S細胞を入れ、100 nMまたは1 μM化合物8または9を24時間で処理します。
      3. 700 x g、5分、4°Cで治療と遠心分離機の後に細胞を収穫します。冷たい1x PBSでセルペレットを洗浄し、残りの培温を700xg、5分、4°Cで除去し、上清を廃棄します。 この手順を 1 回繰り返します。
      4. ライシスバッファー中のライゼ細胞(25 mMトリスHCl pH 7.4、150 mM NaCl、1%NP-40、1mM EDTA、5%グリセロール、1xプロテアーゼ&ホスファターゼ阻害剤カクテル)の氷上で10分間、遠心分離機を320 x gで10分間、10分間°C。上清を収穫し、メーカーのプロトコルに従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCAアッセイ)によってタンパク質濃度を決定する。
      5. 1x LDS負荷バッファー(5%2-メルカプトエタノール)を伴う変性タンパク質(15~30μg/サンプル)と沸騰10分、75°C。
    2. SDS-ページ
      1. 10%分離ゲル[4 mL 3xゲルバッファー(3 Mトリス/HCl、 0.3% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS), pH 8.45), 4 mL アクリルアミド 30%, 2.52 mL グリセロール 50%, 1.395 mL H2O, 75 μL 11% ペルスルフェートアンモニウム (APS), および 9.75 μL TEMED と 9.75 μL TEMED とゲルを積み重ねます。 [1.992 mL 3xゲルバッファー、0.792 mL 30%アクリルアミド、3.168 mL H2O、36 μL 11%APS、および6 μL TEMED]を電極組立ユニットに入します。櫛を取り外し、カソードバッファー(100 mMトリス/HCl、100 mMトリシン、0.1%(w/v)SDS)、およびロードサンプルでウェルをフラッシュします。
      2. アノードバッファ(100 mMトリス/HCl、pH 8.9)をタンクに充填します。ステップ2.1.1.4からタンパク質サンプルをロードし、SDS-PAGEを70V、20分、続いて一定電圧で115V、150分で実行します。
    3. CRBN、IKZF1およびIKZF3の免疫ブロッティングと検出
      1. PVDF膜(0.45 μm)を100%メタノールで1分間平衡化し、ゲルを1x転写バッファーで分離[10x転写バッファー(192mMグリシン、25mMトリスベース/HCl、900mL H2O)、20%メタノール、0.1%SDS、p.8.p.H.SDSを活性化する。
      2. メーカーのプロトコルに従ってブロッティングカセットを組み立てます。ゲルを180mAで90分間転写します。
      3. 1x TBS-T(25 mMトリス/HCl、150 mM NaCl、pH 7.6、0.1%ツイエン20)で膜3xを室温でそれぞれ5〜10分間洗浄します。5%非脂肪乾燥乳(NFDM)で膜をブロックし、室温で1時間TBS-T。1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。
      4. CRBN(5%BSA、TBS-Tで1:500)の一次抗体を用いて膜をインキュベートし、一晩4°Cで穏やかに振ります。
      5. 1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。抗マウス(5%NFDMで1:10.000、TBS-T)または抗ウサギ(5%NFDMで1:5.000、TBS-T)をワサビペルオキシダーゼHRPに結合した二次抗体(室温で1時間)で膜をインキュベートする。
      6. 1X TBS-Tで膜2xを室温で5~10分間洗浄します。1x TBS でこの手順を 2 回繰り返します。
      7. メーカーのプロトコルに従ってHRP基板溶液で2分間膜をインキュベートし、化学発光検出装置で化学発光を検出します。
      8. 1X TBSで1xで1xを洗浄し、室温でそれぞれ5~10分間洗浄します。抗体の放出については、市販のストリッピングバッファー内のストリップ膜を15分間洗浄し、1X TBSで膜を3倍、室温でそれぞれ5~10分間洗浄する。
      9. 5%の非脂肪乾燥牛乳で膜を再ブロックし、室温で1時間TBS-T。1x TBS-Tで1xで膜を5~10分間室温で洗浄し、ステップ2.1.3.4に従ってIKZF1、IKZF3またはチューブリンで再プローブします。
  2. MG132、MLN4942またはポマリドミドとの競争実験
    注:CRBNがユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されるかどうかを確認するために、プロテアソーム阻害剤MG132とネディリレーション活性化酵素(NAE)阻害剤MLN4942(図7)との競合実験を行った。
    1. 種子1 x 106 MM1S細胞を6ウェルプレートでウェルあたり。10 μM MG132、10 μM MLN4942、またはレナリドミド(100x)を持つプレトリート細胞は、37°Cで1hをインキュベートし、5%CO2.
    2. 37 °C で 3 h の 100 nM化合物8を追加します。
    3. ステップ2.1.1に従ってウェスタンブロットの細胞を収穫する。
  3. 多発性骨髄腫細胞株における細胞生存率アッセイ
    注:このアッセイは、細胞生存率への影響を試験するために使用され、さらに、化合物8を有する細胞の前処理によって多発性骨髄腫細胞に対するIMiDsの効果に拮抗する(図8、図9A、B)。
    1. 生物学的三重分化における96ウェルプレート中のウェル当たり種子5 x 104 MM1S細胞は、生存率アッセイ用である。ウェスタンブロット分析の場合、生物学的三重分化における6ウェルプレートでウェル当たりシード1 x 106 MM1S細胞を種子化する。
    2. DMSOまたは100 nM、1 μM、または10 μM化合物8、化合物9またはポマリドミドで細胞を処理し、37°C、5%CO2で24時間、48時間、または96hのインキュベートを行います。 救助実験のために、1μMポマリドミドを添加する前または後に、100 nM化合物8を3時間で処理し、96時間インキュベートする。
    3. ウェスタンブロット分析用の6ウェルプレートからプレートリーダーまたは収穫細胞のメーカーのプロトコルに従って、発光細胞生存率アッセイで96ウェルプレート発光を測定します。

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結果

ここでは、CRBNの分解に対するホモディメリックポマリドミドベースのPROTACの設計、合成及び生物学的評価について説明した。当社のPROTACは、2つのCRBN分子と同時に相互作用し、ポマリドミド誘発ネオ基板IKZF1またはIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、CRBNの自己ユビキチン化およびプロテアソーム分解を誘導する三項複合体を形成します。

以前に公表された一連のポマリドミド系PROTAC分子24のうち、化合物8はCRBNの化学的誘導分解において特に有効であった。その合成は以下のように行うことができる(図4)。1,1'-カルボニルジミダゾール促進されたBoc保護l-グルタミンの凝縮は、環化イミド1につながる。N-メチル化アナログ2は、ヨウ化メチ...

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ディスカッション

CRBNのためにここに説明するこのようなホモPROTACの設計は、多くのヘテロビ機能PROTACでうまく利用され、PROTAC 8の高度な開発をもたらしたCRBNに対するポマリドミドの特定の親和性に依存しています。選択的 CRBN デグレーダー。我々の分子の特異性は、プロテオミクス分析24によって既に確認されている。遺伝的に媒介されたノックアウトのために、 副作用の排除と検証は困難で時間がかかります。さらに、化学的に誘導されたノックダウンは可逆的で、迅速かつ直接細胞および組織タイプ28の広いスペクトルに適用可能である。

IMiDsサリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイドは、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫および骨髄異形成症候群の治療において主力となっている。IMiDsは、CRBN-CRL4 E3リゲスの特異性を調節して、ネオ基板IKZF1、IKZF3、またはCK1α6、11、29を分解す...

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開示事項

著者は、潜在的な金銭的利益相反を宣言していません。

謝辞

この作品は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(エミーノエーテルプログラムKr-3886/2-1とSFB-1074からJ.K.まで)によってサポートされました。FOR2372 から M.G.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,1'-カルボニルジイミダゾールTCI化学物質C0119
2,2′-(エチレンジオキシ)-ビス(エチルアミン)Sigma-Aldrich385506化合物6-2
-メルカプトエタノールSigma-AldrichM6250
3-フルオロフタル酸無水物、98%Alfa AesarA12275
4-ジメチルアミノピリジン、99%アクロス148270250有毒
アクリルアミドスタンムルösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB細胞シグナル伝達15103S
ウサギで産生された抗CRBN抗体SigmaHPA045910
抗ウサギIgG HRP結合抗体Sigma7074S
過硫酸アンモニウムRoth 9592.2
Boc-Gln-OHTCI化学物質B1649
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF、無水、99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO、無水、99.7 %アクロス348445000モレキュラーシーブグリ
シンSigma-Aldrich15523-1L-R
ヤギ抗マウス (HRP 共役)サンタ クルス バイオテクノロジーsc-2005
停止プロテアーゼ &ホスファターゼ阻害剤シングルユースカクテル(100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507高毒性
メタノールSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot 電気泳動転写セルBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cellバイオ・ラッド1658004
MLN4942バイオモール (ケイマン)Cay15217-1
マウスで産生されたモノクローナル抗アルファ (B512)シグマT5168
N-エチルジイソプロピルアミン、99 %アルファ エーザーA11801
脱脂粉乳PanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell WhiteポリスチレンプレートThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
ナトリウムドデシル硫酸塩カール・ロス183.1
塩化ナトリウムSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDカール・ロス2367.3
tert-ブチル N-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル]カルバメートSigma-Aldrich89761化合物 5
トリシンカール・ロス6977.4
トリズマ塩基Sigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL スプレーAdvanstaK-12049-D50
な

参考文献

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