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方法論記事

Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化

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DOI：

10.3791/59477

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2019年5月16日

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1Department of Bionanoscience & Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Department of Biology, University of Rochester

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、低コストの商用3D プリンタを、パターン化したバイオフィルムの印刷を容易にすることができる細菌3D プリンタに変換する方法について説明します。Bioprinter およびバイオインクの調製に必要なすべての側面、ならびにバイオフィルムの形成を評価するための検証方法について説明する。

要約

バイオフィルムは、自己産生空間的パターン化された細胞外マトリックスに埋め込まれる細菌の凝集体である。バイオフィルム内の細菌は、潜在的な健康上の危険をもたらす強化された抗生物質耐性を開発しますが、飲料水の浄化などの環境アプリケーションにも有益です。抗菌薬とバイオフィルムに触発されたアプリケーションのさらなる発展には、バイオフィルム作成のための再現性のある、engineerable 方法の開発が必要になります。近年、細菌インクを用いて改質された三次元 (3D) プリンタを用いたバイオフィルム調製の新規な方法が開発されるようになった。この記事では、bacterially によって誘導される材料処理に複数のアプリケーションを提供する、この効率的で低コストの 3D bioprinter を構築するために必要な手順について説明します。このプロトコルは適合した市販の3D プリンタで始まり、押出機がシリンジ・ポンプ・システムに接続されたバイオインクディスペンサーに交換されることにより、バイオインクの制御可能で連続的な流れができる。バイオフィルムの印刷に適した生体インクを開発するために、設計された大腸菌細菌はアルギン酸塩の溶液中に懸濁し、カルシウムを含有する表面と接触して固化する。印刷基板内のインデューサー化学物質の含有は、印刷されたバイオインク内のバイオフィルムタンパク質の発現を駆動する。この方法は、印刷されたバイオフィルムの離散層からなる様々な空間パターンの3D プリンティングを可能にします。このような空間的に制御されたバイオフィルムは、モデルシステムとして機能し、抗生物質耐性予防や飲料水の浄化など、社会に幅広い影響を与える複数の分野のアプリケーションを見つけることができます。

概要

現在、このような材料の市場の数が拡大しているため、空間的にパターン化された材料の生産のための環境に優しい、持続可能なソリューションを開発する必要性が高まっています1.この記事は、このような材料の生産のためのシンプルで経済的な方法を提示し、したがって、将来のアプリケーションの大規模なスペクトルを提供しています。ここで紹介する方法は、生きた細菌を含む生体インクを用いて、空間的にパターン化された構造物の三次元 (3D) 印刷を可能にする。細菌は、1週間以上にわたってプリントされた構造内で生存可能なままであり、細菌は自然または操作された代謝活動を行うことができる。印刷された細菌は、それにより、印刷構造内で所望の成分を生成及び堆積することができ、例えば機能的架橋型バイオフィルム2を作成する。

高度な材料を製造するための従来の方法は、高いエネルギー支出 (例えば、高温および/または圧力) を伴い、大量の化学廃棄物を生成することができ、多くの場合、コストを必要とする有毒物質3 、4.対照的に、複数の細菌種は、様々な産業で容易に適用できる材料を製造することができる。これらの材料は、polyhydroxyalkanoates (PHA)5またはポリ (グリコリドコポリマー) (PGLA)6、細菌セルロース7、細菌性コンクリート材料8、バイオミメティック複合材9などのポリマーを含む、アミロイド系接着剤10、またはバイオベースの電気スイッチ11、とりわけ。さらに、貴重な材料の細菌生産は、典型的には、有毒な化合物を必要または生成することなく、周囲の温度および圧力および水性環境で行われる。細菌を用いて材料を製造することは文献において実証されているが、いくつかの産業用途はすでに12,13に浮上しており、そのような材料の空間的パターニングのための信頼できる方法は課題のままである。

この記事では、低コストの商用3D プリンタを3D の細菌プリンタに変換するための簡単な方法を紹介します。このプロトコルは、生きている細菌を含むバイオインクを調製する方法、ならびに3D プリンティングを行うことができる基質を調製する方法を示しています。この方法は、材料を生産することができる天然および設計された細菌株の様々な使用に適しています。これらの細菌は、3D プリントされた構造内に空間的に分散することができ、依然としてその代謝活性を継続し、これは、細菌によって生成された所望の材料の空間的分布をもたらすであろう。

この印刷方法により、バイオフィルム、自己産生細胞外マトリックスに囲まれた細菌の凝集体の添加物製造が可能になる。バイオフィルムは、タンパク質、ポリマー、細菌細胞、酸素、および栄養素がすべて空間的に構造化された14の異種3d ネットワークです。バイオフィルムの形態では、バクテリアは抗生物質の耐性と構造的な頑健性を高め、医療用カテーテルやインプラントを含む表面からの根絶を困難にしています。バイオフィルムの特性にとって重要なことは、またバイオフィルム研究への最大の課題であり、バイオフィルム15、16、17の不均一性であると思われる。空間的に制御されたモデルバイオフィルムの生産は、バイオフィルム成分の空間パターンを再生または調整することを可能にし、事実上あらゆる表面のバイオフィルムの安定した沈着の理解を助けるため、特別な関心を持っています自然。

本稿では、インデューサーの存在下でバイオフィルムタンパク質を生成する工学的大腸菌細菌を含む3D プリントされたヒドロゲルを用いたバイオフィルムの製造方法、ならびにバイオフィルム形成の検証方法を紹介する。 .これらのバイオフィルムの主要な細胞外マトリックス成分は、自己組織化された CsgA タンパク質を含む curli アミロイド繊維18である。CsgA のタンパク質を発現させるために大腸菌の細菌が誘導されると、それらは、印刷面から洗い流されて細胞を保護する安定したモデルバイオフィルムを形成する。このような3D プリントバイオフィルムは、空間的に制御することができ、マルチスケールのバイオフィルム構造機能力学または materiomics19の調査のための有用な研究ツールとして機能することができます。これらのオーダーメイドのバイオフィルムは、バイオフィルム形成の原理とその機械的特性の理解を助け、他のアプリケーションの間で抗生物質耐性のメカニズムのさらなる研究を可能にする。

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プロトコル

1. 商用3D プリンタの 3D bioprinter への変換

  1. 市販の3D プリンタ (材料表) の押出機とヒータをプリンタフレームから取り外し、これらの素子を制御する配線を主回路基板から抜きます (図 1a)。プリンタの動作温度を制御するセンサは、プリンタソフトウェアと通信するために機能する必要があるため、動作温度に達するまで印刷を遅らせるアルゴリズムを印刷ソフトウェアから削除します。
  2. シリコンチューブ (内径 1mm) を使って、ピペットチップ (200 μ l チップ) をシリンジポンプに装填した 5 mL シリンジに接続します。ピペットチップを元の押出機の代わりとして、3D プリンタ押出機ヘッドに取り付けます (図 1b)。
  3. 複数のタイプのバイオインクが使用される場合は、追加のチューブシステム (s) とピペットチップ (s) をプリンタに取り付けます。

2. 3D プリンティングのための基板準備

  1. Luria-Bertani ブロス (LB) 培地に溶解された 1% w/v 寒天の 400 mL に 4 mL の 5 M CaCl2溶液を加え、適切な抗生物質および誘導剤 (ここでは34μ g/mL のクロラムフェニコールおよび 0.5% ラムノース) を補充した。
  2. 各 150 mm x 15 mm ペトリディッシュに 20 mL の LB 寒天溶液を塗布します。蓋を半分開いた状態で室温で30分乾燥させます。
    注: このプロトコルは、これらの印刷基板を4° c で最大数日間保存することによって、ここで一時停止することができます。

3. バイオインキ製剤

  1. アルギン酸ナトリウム溶液 (3% w/v) を調製し、沸騰点まで3回加熱し、溶液を殺菌する。使用するまで4° c で保管してください。
  2. 成長大腸菌MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (e.coli ΔcsgA) プラスミド pSB1C3-緑蛍光タンパク質 (GFP) を担持した細菌 (構成的 gfp 発現)2または pSB1C3-GFP-CsgA (恒常的 Gfp 発現、ラムノース誘導性 CsgA式) は、34μ g/mL クロラムフェニコールおよび 0.5% ラムノースを含有する LB 培地の 50 mL で 250 rpm で振盪しながら37° c で一晩放置した。
  3. 細胞培養物を 3220 x gで5分間遠心し、菌をペレットにする。上清を除去します。
  4. この菌ペレットを 10 mL の LB 培地に再懸濁し、アルギン酸ナトリウム (3% w/v) を10ml 添加する。

4. 3D プリンティングプロセス

  1. コンピュータに3D 印刷ソフトウェア (資料表) をインストールして開きます。3D プリンタをコンピュータに接続します。X、Y、Z 軸のホームボタンをクリックして、プリントヘッドをそのホーム位置に移動します。
  2. 各印刷について、印刷用ベッドの特定の位置に印刷用基板を配置します。
  3. Z 軸の印字ヘッドの高さを調整します。
    1. それは所望の位置に移動するときにペトリ皿の縁と衝突しないように、手動制御下で22ミリメートルの高さに印字ヘッドを上げます。印字ヘッドをプレートのオーバートップに置き、ピペットチップが印刷面に接触するまで下に移動します。この Z 軸の位置を Z1 (印刷面の高さ) として割り当てます。
    2. 印字ヘッドを持ち上げ、X、Y、Z 軸の手動制御でプレート領域の外側に移動します。印字ヘッドとプレート面の作動距離が Z2 と定義されている場合は、印刷時に Z 値として Z1 + Z2 を印刷プログラムに入力します。
  4. 所望の軌跡に応じて自己開発されたポイントバイポイントの座標決定方法によって印刷形状をプログラムする。
    1. 目的の軌道が直線の場合は、始点と終点のみを定義します。曲線上に追加の点を含めると、曲線がより滑らかになります。プリントヘッドを手動ですべてのポイントに順番に移動し、これらのポイントの座標を順に記録します。これらの座標をすべて入力し、印刷された各セグメントのプリントヘッドの移動速度を G コードエディタに入れます。
  5. 印刷の前後に、印字ヘッドをプレートのエッジ (20mm) よりも高い距離まで持ち上げ、プレート領域から直接移動します。このプログラムを G コードファイルとして保存し、後続のプリントで使用するために直接ロードし、新しいプリント基板ごとに Z 軸の高さを再測定します。
    注: 正方形を印刷するための G コードの例については、表 1を参照してください。
  6. 事前にプログラムされた G コードファイルをロードします。ソフトウェアの G コードエディタを開き、希望の形状を印刷するためのコマンドでプログラムします。各コマンドラインにおいて、印字ヘッドの位置は、X、Y、および/または Z 軸において変更されてもよい。すべての印刷ステップにおいて、Z1 + Z2 (印刷面の高さ + 作業距離) として Z 値を入力します。
    注: 移動速度も調整可能です。9000 mm/min は、一般的な印刷レートに適した値です。
  7. 液体バイオインクをシリンジ (複数可) に入れ、3D bioprinter のシリンジポンプに装着します。
  8. プリントボタンをクリックして、プリント基板上にバイオインクを印刷します。
  9. 印刷中は、ソフトウェアによってプリントヘッドの動きを完全に制御します。プリントヘッドは、印刷面に接触する前に、手動でシリンジポンプを起動します。
    注: シリンジポンプとプリンタの調整は、押出速度、印字ヘッドが最初のプリントポイントに移動する速度、および印字ヘッドの初期位置に応じて経験的に決定されます。最初の印字ヘッド位置が 20 mm の場合は、プリントヘッドの速度が 9000 mm/min、押出速度が 0.1 mL/h である場合、印刷開始直後にシリンジ・ポンプを始動します。押出速度を 0.1 mL/h から 0.3 mL/h に変更した場合は、印刷開始後2−3秒待ってシリンジ・ポンプを始動します。
  10. プリントヘッドが印刷の最後のポイントに到着するとすぐにシリンジポンプを停止します。プリントヘッドが印刷プロセスの最後に上昇する前にシリンジポンプを停止し、それ以外の場合は過剰なバイオインクが印刷基板上に落下し、印刷解像度を低下させます。
  11. 3D 構造の構築のために、G コードエディタでプリントヘッドのすべての動きを制御します。最初のレイヤーの印刷高さを入力します。2番目のレイヤーが印刷の高さを大きくするには、G コードの Z 値を0.2 ミリメートルずつ増やします。その後、より高い層に移動するとき、Z 値を0.1 ミリメートル増加させる。印刷中は、プレートを動かさないでください。
  12. 印刷されたハイドロゲルの幅と高さを測定するには、サンプルの下または横に配置されたスチール定規を使用します。

5.大腸菌によるバイオフィルム製造の有効性の拡大と試験

  1. 印刷されたサンプルを室温で3−6日間インキュベートして、バイオフィルム成分 (curli 繊維) の生産を可能にします。カメラまたは蛍光スキャナーを使用してプレートをイメージします。
  2. アルギン酸マトリックスを溶解させるために、0.5 M のクエン酸ナトリウム溶液を 20 mL (NaOH で調整した pH = 7) を印刷基材に添加し、室温で 30 rpm 振とうして2時間インキュベートする。液体を廃棄し、再度クエン酸処理の前にプレートの画像と比較するためにプレートを画像。

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結果

バイオフィルムの3D プリントを成功させるための第一歩は、市販の3D プリンタを bioprinter に変換することです。この変換は、ポリマーインクで印刷するために設計された押出機とプリンタのヒータを除去し、これらを生きた細菌を含むバイオインクを印刷するのに適した成分に置き換えることによって達成される (図 1a)。押出機は、スポイトポンプに接続されたチューブシステムに取り付けられた複数のバイオインクが印刷プロセスに使用される場合は、ピペットチップ (またはヒント) によって置き換えられる (図 1b)。商業用プリンタを bioprinter に正常に変換するには、必要なバイオインク (複数可) をシリンジ・ポンプからチューブ・システムを通して移動させ、表面上にピペット (s) を入れて漏れたり加熱したりすることなく、バイオインク印刷中にバイオインクの流れによってチューブが膨らんだ場合は、壁が厚いチューブに置き換えられることがあります。これは、この印刷...

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ディスカッション

エンジニアリングバイオフィルムの3D プリンティングのためにここに提示されたプロトコルは、2つの重要なステップを持っています。まず、特定の印刷解像度を生成するための最も重要な要因である寒天印刷面の調製です。印刷表面が平らであり、プリントヘッド上のピペットチップが表面から正しい高さに位置していることを確認することが重要です。サーフェスが平坦でない場合、印刷プロセス中に作業距離が変化します。作動距離が 0.1 mm 未満の場合、CaCl2溶液がピペットチップ内に入り、ヒドロゲルが形成され、ピペットチップが詰まる原因となる可能性があります。作動距離が 0.3 mm を超える場合は、ゲルを連続して印刷することはできません。この調査の最適の作動距離は 0.2 mm である。平らな寒天の印刷面を準備するための良いアプローチは、より大きな直径のペトリ皿 (90 mm 径のプレートではなく、150 mm 径のペトリ皿) を使用し、平らなテーブルの上にプレートを置き、寒天を注ぐことです速く、さらに速度の解決は、凝固の間に寒天の版を動かすことを避ける。

第2の重要なステップは、ポ...

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開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

この作品は AOARD の助成金によって支えられました (No.FA2386-1-4059)、オランダ科学研究機構 (NWO/OCW) は、ナノサイエンスプログラムのフロンティアの一部として、先端材料 NWO ・ NSFC プログラム (729.001.016)。著者たちは、ラモン・ヴァン・デル・ヴァルクとローランド・ Kieffer の実験支援を承認した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3DプリンターCoLiDo3D-P キット
3DプリントソフトウェアCoLiDoPrint-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
寒天Sigma-Aldrich05040
CaCl2 二水和物Sigma-AldrichC7902
遠心分離機エッペンドルフ5810 R
クロラムフェニコールSigma-Aldrich3886.1
LBブロスパウダーSigma-AldrichL3022
オービタルシェーカーVWR89032-092モデル 3500
ペトリ皿VWR25384-326150 x 15 mm
ラムノースSigma-Aldrich83650
シリコンチューブVWR DENE 3100103/25
シリンジポンプProSense B.V. NE-300
アルギン酸ナトリウムSigma-Aldrich W201502
クエン酸ナトリウムモノベーシックSigma-Aldrich71498
酸化ナトリウムVWR28244.295
水

参考文献

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