Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化

Summary

この記事では、低コストの商用3D プリンタを、パターン化したバイオフィルムの印刷を容易にすることができる細菌3D プリンタに変換する方法について説明します。Bioprinter およびバイオインクの調製に必要なすべての側面、ならびにバイオフィルムの形成を評価するための検証方法について説明する。

Abstract

バイオフィルムは、自己産生空間的パターン化された細胞外マトリックスに埋め込まれる細菌の凝集体である。バイオフィルム内の細菌は、潜在的な健康上の危険をもたらす強化された抗生物質耐性を開発しますが、飲料水の浄化などの環境アプリケーションにも有益です。抗菌薬とバイオフィルムに触発されたアプリケーションのさらなる発展には、バイオフィルム作成のための再現性のある、engineerable 方法の開発が必要になります。近年、細菌インクを用いて改質された三次元 (3D) プリンタを用いたバイオフィルム調製の新規な方法が開発されるようになった。この記事では、bacterially によって誘導される材料処理に複数のアプリケーションを提供する、この効率的で低コストの 3D bioprinter を構築するために必要な手順について説明します。このプロトコルは適合した市販の3D プリンタで始まり、押出機がシリンジ・ポンプ・システムに接続されたバイオインクディスペンサーに交換されることにより、バイオインクの制御可能で連続的な流れができる。バイオフィルムの印刷に適した生体インクを開発するために、設計された大腸菌細菌はアルギン酸塩の溶液中に懸濁し、カルシウムを含有する表面と接触して固化する。印刷基板内のインデューサー化学物質の含有は、印刷されたバイオインク内のバイオフィルムタンパク質の発現を駆動する。この方法は、印刷されたバイオフィルムの離散層からなる様々な空間パターンの3D プリンティングを可能にします。このような空間的に制御されたバイオフィルムは、モデルシステムとして機能し、抗生物質耐性予防や飲料水の浄化など、社会に幅広い影響を与える複数の分野のアプリケーションを見つけることができます。

Introduction

現在、このような材料の市場の数が拡大しているため、空間的にパターン化された材料の生産のための環境に優しい、持続可能なソリューションを開発する必要性が高まっています¹.この記事は、このような材料の生産のためのシンプルで経済的な方法を提示し、したがって、将来のアプリケーションの大規模なスペクトルを提供しています。ここで紹介する方法は、生きた細菌を含む生体インクを用いて、空間的にパターン化された構造物の三次元 (3D) 印刷を可能にする。細菌は、1週間以上にわたってプリントされた構造内で生存可能なままであり、細菌は自然または操作された代謝活動を行うことができる。印刷された細菌は、それにより、印刷構造内で所望の成分を生成及び堆積することができ、例えば機能的架橋型バイオフィルム²を作成する。

高度な材料を製造するための従来の方法は、高いエネルギー支出 (例えば、高温および/または圧力) を伴い、大量の化学廃棄物を生成することができ、多くの場合、コストを必要とする有毒物質^{3 、4}.対照的に、複数の細菌種は、様々な産業で容易に適用できる材料を製造することができる。これらの材料は、polyhydroxyalkanoates (PHA)⁵

Protocol

1. 商用3D プリンタの 3D bioprinter への変換

1. 市販の3D プリンタ (材料表) の押出機とヒータをプリンタフレームから取り外し、これらの素子を制御する配線を主回路基板から抜きます (図 1a)。プリンタの動作温度を制御するセンサは、プリンタソフトウェアと通信するために機能する必要があるため、動作温度に達するまで印刷を遅らせるアルゴリズムを印刷ソフトウェアから削除します。
2. シリコンチューブ (内径 1mm) を使って、ピペットチップ (200 μ l チップ) をシリンジポンプに装填した 5 mL シリンジに接続します。ピペットチップを元の押出機の代わりとして、3D プリンタ押出機ヘッドに取り付けます (図 1b)。
3. 複数のタイプのバイオインクが使用される場合は、追加のチューブシステム (s) とピペットチップ (s) をプリンタに取り付けます。

2. 3D プリンティングのための基板準備

1. Luria-Bertani ブロス (LB) 培地に溶解された 1% w/v 寒天の 400 mL に 4 mL の 5 M CaCl₂溶液を加え、適切な抗生物質および誘導剤 (ここでは34μ g/mL のク....

Results

バイオフィルムの3D プリントを成功させるための第一歩は、市販の3D プリンタを bioprinter に変換することです。この変換は、ポリマーインクで印刷するために設計された押出機とプリンタのヒータを除去し、これらを生きた細菌を含むバイオインクを印刷するのに適した成分に置き換えることによって達成される (図 1a)。押出機は、スポイトポンプに接続されたチューブシステムに取り付けられた複数のバイオインクが印刷プロセスに使用される場合は、ピペットチップ (またはヒント) によって置き換えられる (図 1b)。商業用プリンタを bioprinter に正常に変換するには、必要なバイオインク (複数可) をシリンジ・ポンプからチューブ・システムを通して移動させ、表面上にピペット (s) を入れて漏れたり加熱したりすることなく、バイオインク印刷中にバイオインクの流れによってチューブが膨らんだ場合は、壁が厚いチューブに置き換えられることがあります。これは、この印刷.......

Discussion

エンジニアリングバイオフィルムの3D プリンティングのためにここに提示されたプロトコルは、2つの重要なステップを持っています。まず、特定の印刷解像度を生成するための最も重要な要因である寒天印刷面の調製です。印刷表面が平らであり、プリントヘッド上のピペットチップが表面から正しい高さに位置していることを確認することが重要です。サーフェスが平坦でない場合、印刷プロセス中に作業距離が変化します。作動距離が 0.1 mm 未満の場合、CaCl₂溶液がピペットチップ内に入り、ヒドロゲルが形成され、ピペットチップが詰まる原因となる可能性があります。作動距離が 0.3 mm を超える場合は、ゲルを連続して印刷することはできません。この調査の最適の作動距離は 0.2 mm である。平らな寒天の印刷面を準備するための良いアプローチは、より大きな直径のペトリ皿 (90 mm 径のプレートではなく、150 mm 径のペトリ皿) を使用し、平らなテーブルの上にプレートを置き、寒天を注ぐことです速く、さらに速度の解決は、凝固の間に寒天の版を動かすことを避ける。

第2の重要なステップは、ポ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3Dプリンター	CoLiDo	3D-P キット
3Dプリントソフトウェア	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
寒天	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 二水和物	Sigma-Aldrich	C7902
遠心分離機	エッペンドルフ	5810 R
クロラムフェニコール	Sigma-Aldrich	3886.1
LBブロスパウダー	Sigma-Aldrich	L3022
オービタルシェーカー	VWR	89032-092	モデル 3500
ペトリ皿	VWR	25384-326	150 x 15 mm
ラムノース	Sigma-Aldrich	83650
シリコンチューブ	VWR	DENE 3100103/25
シリンジポンプ	ProSense B.V.	NE-300
アルギン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich W201502
クエン酸ナトリウムモノベーシック	Sigma-Aldrich	71498
酸化ナトリウム	VWR28244.295