サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

Summary

ヒトが誘導した多能性幹細胞 (hiPSC) 由来の腸管オルガノイドは、インビトロで腸内疾患をモデル化する刺激的な機会を提供する。我々は、腸管オルガノイド (iHOs) への hiPSCs の分化、サイトカインによるこれらの iHOs の刺激、およびサルモネラサルモネラの iHO 内腔への微量注入を示し、これによって上皮浸潤の研究を可能にする病原 体。

Abstract

ヒトの腸の上皮内層を代表する3次元構造を特徴とする腸管 ' オルガノイド ' (iHO) 系は、ヒト誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) から産生され、培養において維持し、促進する刺激的な機会を提供する腸内感染症に対する上皮反応のモデル化。インビボでは、腸管上皮細胞 (IECs) は腸の恒常性を調節する上で重要な役割を果たし、病原体を直接阻害することがあるが、これが起こるメカニズムは完全には解明されていない。サイトカインインターロイキン-22 (IL − 22) は、感染に応答して抗菌ペプチドおよびケモカインの放出を誘発することを含む腸上皮関門の維持および防御において役割を果たすことが示されている。

我々は、基底膜マトリックスベースの prointestinal 培養システムに埋め込む前に、特定のサイトカインの組合せをそれらの培地に添加することによって、iHOs への健康なコントロール hiPSCs の分化を記述する。一旦埋め込まれると、iHOs は、ノギン、spondin-1、上皮成長因子 (EGF)、CHIR99021、プロスタグランジン E2、および Y-27632 dihydrochloride 一水和物を添加した培地で増殖される。IHO ultrastructure の手動破壊による週刊継代は出芽 iHOs の形成につながり、いくつかは陰窩/絨毛構造を呈する。すべての iHOs は、杯細胞、enteroendocrine 細胞、パネート細胞、および偏光 enterocytes からなる分化した上皮を示し、各細胞サブセットの特異的マーカーについて免疫染色を介して確認することができる、透過型電子顕微鏡(TEM)、及び定量 PCR (qPCR)。感染をモデル化するために、サルモネラサルモネラトラコマチスサルモネラ SL1344 をマイクロインジェクションの内腔に IHOs し、37° c で90分間インキュベートし、修飾ゲンタマイシン保護アッセイを実施して細胞内濃度のレベルを特定する。細菌の侵入。いくつかの iHOs はまた、このサイトカインがサルモネラ感染に対して保護されているかどうかを確立するために、感染前に組換えヒト IL-22 (rhIL) で前処理されている。

Introduction

近年では、宿主病原体相互作用の研究が、様々な前駆細胞から腸上皮の3次元表現を産生することができる「オルガノイド」モデルの開発によって強化されてきた。「主要な」オルガノイドは腸のバイオプシーから収穫される腸の幹細胞から直接生成することができる。さらに、腸オルガノイドは、hiPSCs から生成することができる。多くの組織で同じことが言え、胃¹、肝臓²、膵臓^3、4、脳^5、6、肺⁷、前立腺⁸オルガノイド病気。がん⁹と薬物スクリーニング¹⁰のモデリングを含む、オルガノイドシステムの多くのエキサイティングなアプリケーションがありますが、ここでは、S を使用して、感染モデルとしての iHOs の使用に焦点を当てています。サルモネラトラコマチスサルモネラ (S.サルモネラ) を例示的な病原体として、IL −22を治療として前処理する。

本研究において、iHO を生成するために用いられた hiPSCs は、健常人から生成された「Kolf2」 iPSCs、ヒト誘導多能性幹細胞イニシアティブコンソーシアム (HipSci; www.hipsci.org) から入手可能な、オープンアクセス参照パネルを特徴とするhiPSC ライン¹¹.オルガノイドのための前駆細胞として hiPSCs を使用することの1つの利点は、現在利用可能な健康ドナー iPSC ラインの広範な銀行があります, 結果は、異なる遺伝的背景を持つ細胞株の数で検証することができることを意味.さらに、特定の疾患関連一塩基多型 (Snp) の研究を希望する場合、CRISPR/Cas9 を使用して健康な細胞株の変異をエンジニアリングし、それによって変異型ラインと isogenic を保持することができます。比較のための制御線¹².私たちの経験では、hiPSC 由来の腸管オルガノイドは、それらの主要な対応物よりもサイズが大きく、培養においてより一貫性があり、より技術的に困難な微量注入を可能にし、さらに多様化する病原体の可能性を研究。iHOs は凍結に保存することができ、私たちは実験用の材料を生産するために、iHO の文化を1年まで伝播しました。

インビボでは、IECs は腸の恒常性を調節する上で重要な役割を果たし、病原体を直接阻害することがあるが、これが起こるメカニズムはよく理解されていない。このサイトカイン IL −22は、腸管上皮バリア¹³の維持において役割を有することが知られており、感染¹⁴に応答して抗菌ペプチドおよびケモカインの誘導および分泌に関与している。それは、活性化 T 細胞 (特に、Th17 細胞) ならびにナチュラルキラー (NK) 細胞によって生成され、22R1 および IL −10R2 サブユニット¹⁵からなる heterodimeric 受容体に結合する。IL −22の受容体は、IECs 上で肺尖に発現され、iHO モデルにおいては、培養培地¹⁶にその添加によってオルガノイドと共に rhIL を pretreat することができる。オルガノイドシステムの欠点の1つは、他の免疫細胞の種類によって通常提供される関連する免疫応答が欠けていることです。しかしながら、この^17,18をより良く表現するために腸リンパ球とオルガノイドを添加 drg しようとするモデルが出現している。

微量注入システムの使用は、インビボ感染の場合に起こるように、上皮の頂端表面への病原体の直接送達を可能にするので、iHO モデルにおける感染をシミュレートするための鍵である。IHO に注入された細菌溶液へのフェノールレッドの添加は、感染したものをマークし、したがって同じ iHO の繰り返し注射を回避する。オルガノイドは、感染モデル化のための血管として使用中に成長しており、ヘリコバクター・ピロリなどの病原体、¹⁹のノロウイルス、²⁰のロタウイルス、²¹の滋賀毒素産生エシェリヒア・コリ²²、クリプトスポリジウム²³、およびジカウイルス²⁴は、これらのシステム内で生存し、複製することが示されました。この技術は、感染に対するヒトの上皮反応についての直接的な情報を得るために、特に原虫のような培養が困難な生物、またはヒトの制限された病原体に、より広い範囲の病原体に適用することができる。

Protocol

1. 多能性幹細胞の培養と継代

注:ここに記載されたすべての方法は、市販のヒト細胞株を使用する。以下に詳述されるすべての組織培養作業は、クラス II 層流フードで行う必要があります。iPSCs は、iPSCs の週末のない文化を可能にするメーカーの指示に従って、幹細胞培養培地で日常的に維持されています (材料の表を参照してください)。iPSCs は、他の iPSC 培養システムから比較的容易に適合させることができます。

1. いったんコロニーがプレート表面の約 80% – 90% を覆うと、細胞を通過させる。
2. ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS、カルシウム [Ca] またはマグネシウム [Mg]) に希釈したビトロネクチン10μ g/mL を組織培養処理プレートに添加することで、使用前の継代用プレートを調製します。コーティングのためのボリュームは、プレートのサイズに依存しており、メーカーの指示で見つけることができます。この間、室温 (RT) への温かい幹細胞培養培地。
3. パッセージの準備ができている iPSCs からメディアを取り出し、DPBS (Ca または Mg なし) でセルを2倍洗ってください。
4. EDTA 溶液 (材料の表を参照) をプレートに追加し、表面全体をコーティングし、RT で 5 ~ 8 分間インキュベートします。IPSC コロニーの中心に孔が現れ始めると、EDTA 溶液を吸引除去する。
5. ウェルに幹細胞培養培地を追加します。皿の表面を数回軽く洗うことによって、iPSCs を取り除きます。IPSCs は、単一のセルとしてではなく、束として継代されるので、EDTA 溶液が長時間放置されていないことを確認してください。任意の外れた iPSCs を 15 mL の円錐形のチューブに移動します。
6. ラミニンフラグメントプレートからビトロネクチンを吸引し、幹細胞培養培地と交換します。IPSC 懸濁液を何度も反転させて iPSCs が円錐管の底部に収まっていないことを確認し、適切な懸濁液量を加えて、新しいプレート上の1:10 希釈の細胞を得た。分割比率は、iPSC の成長速度に応じて調整することができ、iPSC ライン間で異なる場合があります。
7. プレートをロックして iPSCs を表面に分散させ、37° c/5% CO2 のインキュベーター内に置きます。継代の翌日に iPSCs を養う。

2. iPSCs から Hindgut への分化

1. 0 日目に、10 cm 組織培養処理皿に iPSCs を分割し、ステップ1.2 で説明したようにビトロネクチンと共に、アクチビン a (10 Ng/ml) + 塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF; 12 Ng/ml) を添加した 10 mL の幹培養培地にラミニンフラグメント。使用する前に、成長因子を直接メディアに追加してください。これは、以降のすべての手順で行います。
2. 1 日目に、培地 (アクチビン a [10 Ng/ml] + bFGF [12 Ng/ml]) を持つ幹細胞培養液 10 mL を変更します。
3. 2 日目に、次の成長因子を補足した幹細胞培養培地 10 mL にメディアを変更することによって分化を開始する: アクチビン A (100 Ng/ml)、bFGF (100 ng/ml)、骨形態形成タンパク質 4 (BMP-4; 10 Ng/ml)、ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ阻害剤は LY294002 (10 μ m)、および GSK3 阻害剤 CHIR99021 (3 μ m) を有する。
4. 3 日目に、10 mL の幹細胞培養培地にアクチビン A (100 Ng/ml) を添加し、bFGF (100 ng/ml)、BMP-4 (10 ng/ml)、および LY294002 (10 μ m) を補充してメディアを変更する。この培地によって誘導された内胚葉仕様は、次の24時間にわたって iPSC コロニー形態に目に見える変化をもたらすはずである。
5. 4 日目に、10 mL の培地にアクチビン a (100 Ng/ml) および bFGF (100 Ng/ml) を添加した RPMI/B27 培地を交換する。
   注:RPMI/B27 培地には、L-グルタミンサプリメント (表 1参照)、10 ML の B27 サプリメント (50x、血清フリー)、および非必須アミノ酸 5 ml の 500 mL が含まれています。任意: 5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン (1万 U/mL) を加えなさい。フィルター-使用前に滅菌します。
6. 5 日目に、培地を 10 ML の RPMI/B-27 培地にアクチビン a (50 Ng/mL) を添加して交換した。
7. 6 日目に、hindgut に事後内胚葉のパターニングを開始し、CHIR99021 (6 μ m) + レチノイン酸 (3 μ m) を添加して 10 ML の RPMI/B27 培地に培地を変更する。
8. 7、 8、 9日目に、ステップ2.7 を繰り返します。これらのステップの間、hindgut の目に見える3-d 構造は、プレートの表面を覆う、明らかになるはずです。
9. 10 日目に、得られた hindgut を基底膜マトリクスに埋め込む (材料の表を参照)。

3. 基底膜マトリクスに Hindgut の埋め込み

1. IHO のベース成長培地を作ります 500 (ダルベッコ改変の高度な改良型イーグルの中 [DMEM]/F12、10 ml の B27 サプリメント [50x、血清遊離]、5 ml の N2 サプリメント [100x、血清遊離]、5ml の 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、および5Ml の非必須アミノ酸 [100x]オプション: 5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン [1万 U/mL] を加えてください。フィルター-使用前に滅菌します。表 1参照)。
2. Hindgut プレートからメディアを取り出し、プレート1x を DPBS で洗浄します (Ca または Mg なし)。プレートにコラゲナーゼ溶液 5 mL を加え、37° c で5分間インキュベートします。
   1. 500 mg のコラゲナーゼ IV 粉末を 400 mL の高度な DMEM/F12 に添加することによってコラゲナーゼ溶液を生成する。これに続いて、100 mL の血清置換物 (材料の表を参照) を加え、L-グルタミンの 5 ml (200 mM)、および 2-メルカプトエタノールの3.5 μ l を添加し、混合するための溶液を旋回させる。フィルター-コラゲナーゼ粉末が完全に溶解したら、溶液を滅菌します。
      注:これはより小さいアリコートで-20 ° c に6か月まで貯えることができる。
3. IHO ベース成長培地をプレートに 5 mL 添加し、セルスクレーパーを使用して hindgut 細胞を掻き取り、15 mL の円錐形のチューブに hindgut 懸濁液を収集することによって、コラゲナーゼを不活性化する。
4. 1分間 240 x gで遠心分離し、上澄み液を剥がします。
5. 10 mL のメディアを追加し、hindgut を軽くピペッティングして小さい部分に分割し、95 x gで1分間遠心分離します。
6. ステップ3.5 を繰り返すことにより、iHO ベース成長培地中の細胞2x を洗浄する。再懸濁は、塩基成長培地 (~ 300 ~ 500 μ l) の小容量の細胞を増殖させるとともに、この溶液の約100μ l を地下膜マトリックスの 1.5 mL に加える。マトリックスは RT で急速に固化し始めるので、この間は氷の上に残しておく必要があります。
7. プレートヒーターの24ウェルプレートを37° c でセットアップし、60μ l を24ウェルプレートの1ウェルにスポットアウトします。それが簡単に設定し、顕微鏡下で密度を確認することができます。
   1. 必要な場合は、所望の濃度が達成されるまで段階的に基底膜マトリクスに hindgut 溶液を追加し、残りの井戸に溶液をスポットアウトします。
8. 37° c で10分間インキュベートします。次いで、24ウェルプレートの各ウェルに成長因子を含有する800μ l の iHO を以下の濃度で添加する (表 1参照): 500 Ng/ml R-spondin-1, 100 Ng/ml ノギン, 100 Ng/ml 上皮成長因子 (EGF), 3 μ m CHIR99021, 2.5 μ mプロスタグランジン E2, 10 μ m Y-27632 dihydrochloride 一水和物 (ロック阻害剤).
9. IHO ベースの成長メディアを 2 ~ 3 日ごと、またはメディアが変色し始めるとすぐに変更します。基底膜マトリックスに最初に播種した後、iHOs は、それらを分割する前に7日間開発することができます。3 ~ 4 日目には、異なる球体がカルチャに表示されます。
   1. メディア変更のみの場合は、分割/シード時にのみ必要となるため、Y-27632 を省略してください。

4. iHOs のメンテナンスと通過

1. 漸進的な解凍を可能にするために、分離する前に、4° c で覆われた氷のバケツの基底膜マトリックスの必要な容積を一晩、24時間に出してください。
2. IHOs からメディアを取り出し、ウェルごとに500μ l のセルリフティング溶液 (材料の表を参照) と交換します。4° c で 40 ~ 50 分間インキュベートし、その時点で iHOs は溶液の中で浮いている必要があります。
   1. オプション: インフードイメージングシステムを使用して、目的の形態の iHOs のみを選択します (「材料の表」を参照)。
3. IHOs を壊さないように、iHO/細胞リフティング溶液懸濁液を 15 mL の円錐形のチューブにやさしくピペットで入れます。IHOs が3〜5分間沈降し、上清および単一細胞を除去することを許可する。
4. 再懸濁は、iHO 塩基成長培地の5ml 中に iHOs を入れ、それらを優しく洗浄するためにピペットで入れます。95 x gで2分間遠心します。
5. フード内で37° c のプレートヒーターに24ウェルプレートを設置します。
6. 上清を除去し、P1000 ピペットを使用して、iHOs ~ 300 ~ 500 μ l のベース成長培地に再懸濁を加え、iHOs をより小さなチャンクに分割します。適用する必要がある力は iHO ラインおよび成熟状態によって変わるので、穏やかに開始し、必要であれば力を増加させることに注意してください。
7. IHOs の〜100μ l の場所 (容積は溶液の密度に依存している) を基底膜マトリックスの 1.5 mL に、簡単に混合するためにピペットで入れる。
8. 基底膜マトリクスの 1 x 60 μ l を24ウェルプレートの1つのウェルにスポットアウトし、それを ~ 30 s の間固化させるようにしてから、顕微鏡下で密度を確認する。密度が低すぎる場合は、マトリックスにさらに iHOs を追加します。
9. 正しい密度が取得されるまでステップ4.8 を繰り返し、残りの行列を24ウェルプレートにスポットします。
10. ステップ3.7 に記載されているように、37° c のインキュベーター内に10分間置き、次いで、成長因子を有する塩基成長培地の800μ l でそれをオーバレイする。
11. 侵襲アッセイ実験 (以下に概説) のための iHOs を準備するために、ステップ4.1 〜4.10 に記載されている実験の前に iHOs を4〜5日通過するが、ステップ4.7 で生成したマトリックス iHO 溶液を 5 mm ガラス底マイクロインジェクション皿に120配置する。
    1. ルーチンの継代のように、液滴に iHO 懸濁液を残すのではなく、皿の底に液滴を広げて、マトリックスの薄層を作成します。ベース成長培地 + 成長因子の 2.5 mL でそれをカバーしています。
       注:抗生物質が培地中で使用されている場合は、これらを除去し、マイクロインジェクション実験のために nonantibiotic 添加媒体で置換しなければならない。

5. rhIL との iHOs の Prestimulation

1. IHOs からメディアを吸引し、新たなベース成長培地 (抗生物質を含んではならない) に 18 h を侵襲アッセイに置き換える。
2. 100 ng/mL の最終濃度に培養培地に rhIL-22 を加えます。

6. iHOs および細胞内浸潤アッセイの微量注入

1. 実験の前日にSを設定します。サルモネラは Luria-Bertani ブロスの 10 mL で SL1344 培養し、振盪しながら一晩37° c でインキュベートする。
2. 実験当日、密閉された熱室を有する顕微鏡が利用可能である場合、それをオンにして、アッセイを開始する前に温度が37° c に達するのを許容する。
3. DPBS (Ca および Mg を含有する) における一晩の細菌培養物を 600 nm (OD₆₀₀) で2の光学密度に希釈し、次いで、それをフェノールレッドと混合して1:1 する。
4. 顕微鏡ステージ上に iHOs を含むマイクロインジェクションディッシュをロードし、蓋を取り外し、iHOs を焦点にして、射出を開始する準備が整います。
5. インジェクタとアーム制御ステーションをオンにします。インジェクタが、600 kPa の圧力および 0.5 s の射出時間に設定されていることを確認します。顕微鏡段階からまだバックアップされていない場合は、射出アームを回転させて、それがあることを確認します。
6. 針から包むことおよびプラスチックシリンダーを取除くことによって6μ m のマイクロインジェクションのドリル先端をセットアップしなさい。射出アームからグリップヘッドを取り外します。
7. ドリル先端に10μ l の接種を行い、その鈍い末端で優しくドリル先端を把持する。ドリル先端をグリップヘッドに挿入し、マイクロインジェクションアームに取り付け直します。
8. 針がマイクロインジェクションディッシュの 1 ~ 2cm 上にあるように、腕をゆっくりと位置に移動します。腕のコントロールを使用して、針の先端を皿の中央に置き、メディアの表面のちょうど上になるまで下ろします。
   1. すべての注射の後、このポイントに針を返すために、arm 制御ステーションをプログラムします。
9. 顕微鏡を iHOs に当て、注入するターゲットを選択します。注射されるように、iHO のすぐ上と右に針を配置し、iHO ルーメンの下と横方向に針を移動します。
10. Microinjector に注入ボタンを押してください。フェノール染色された細菌混合物が針から出てきます。各 iHO 3x を注入してください。条件ごとに少なくとも 30 iHOs を注入します。
    注:培養内の iHO サイズおよび構造における不均一性のために、変動を制御するために多数の iHOs を注入することが必要である。
11. すべての必要な iHOs が注入されたら、ステージからマイクロインジェクションプレートを取り出し、蓋を交換して、プレートを90分間37° c でインキュベートします。
12. 90分後、成長培地を吸引し、3 mL の細胞リフティング溶液に交換します。4° c で45分間インキュベートします。
13. IHOs/セルリフティングソリューションを 5 mL の DPBS を含む 15 mL の円錐チューブにそっと移動させる。注入した iHOs がすべてプレートから取り外されていることを確認します (必要に応じてプレートを1Ml の DPBS ですすいでください)。370 x gで3分間遠心します。
14. 上清を除去し、0.1 mg/mL でゲンタマイシンを含む塩基成長培地で iHOs を再懸濁 (1 mL の培地を加え、P1000 ピペット〜50x を使用して iHOs を分解し、さらに 4 mL の培地を加える)。
15. 37° c で1時間インキュベートして細胞外細菌を死滅させる。
16. IHOs を 370 x gで3分間遠心し、上清を吸引し、できるだけ少なく残します。再び DPBS と遠心分離機で iHOs 1x を洗ってください。
    注:このステップは、細胞が溶解すると、残りのゲンタマイシンが細胞内細菌を死滅させることが重要であるゲンタマイシンを除去する。
17. 再懸濁は、iHOs を溶解バッファーの500μ l で (材料の表を参照)、ピペッティング〜50x によってオルガノイドを手動で解離させる。この混合物を RT で5分間放置します。
18. DPBS で得られた溶液10倍を連続的に希釈し、10-¹, 10^-2, および 10^-3濃度を生成する。ピペット prewarmed の LB の寒天の版に端正な、希釈された解決の 3 x 20 μ l の液滴。
19. 37° c で一晩インキュベートし、コロニー計数およびコロニー形成単位 (CFU) の計算を行います。コロニー数は、細胞溶解するプロセス中に放出された細胞内細菌の数を反映する。

7. 細胞の凍結と回復

注:既に説明したように、必要に応じて iHOs を保存して再構成凍結ことができます。凍結と解凍のプロセスは、以下に概説されています.

1. 凍結したい iHOs の井戸を選択します。ウェルにセルリフティングソリューションを追加し、4° c で40〜50分インキュベートします。IHOs は、ソリューションにフローティングする必要があります。
2. IHOs をゆっくりと 15 mL の円錐形のチューブにピペットで入れ、沈降させます。メディアを取り外し、ベース成長メディア (成長因子なし) で iHOs 1x を洗ってください。
3. 95 x gで2分間遠心分離し、上澄みを取り除き、適切な量の細胞凍結培地に交換します (材料の表を参照してください、製造業者の指示に従って媒体を使用してください)、iHOs を超低温バイアルにデカントします。
   1. より緩やかな凍結を可能にするために-80 ° c の冷凍庫にバイアルを保管してください。その後、液体窒素貯蔵庫に移します。
4. IHOs を再構築するには、水/ビーズ浴を使用して37° c で極低温バイアルを急速に解凍します。その後、その内容物を 10 mL のベース成長培地 (成長因子なし) にやさしくピペットで入れます。IHOs が新しいベース成長メディアの ~ 300 μ l のメディアを決済して交換できるようにします。
   1. IHOs を手動で切り離すことはできません。基底膜マトリックスに iHOs を追加し、セクション3で説明されているようにそれらをプレートします。

Results

分化プロセスの開始後、細胞は、基底膜マトリクスに包埋する前に、最終的な内胚葉形成の段階を通過し、続いて hindgut パターニングを行うべきである。スフェロイドは、iHOs が成熟するにつれて数週間にわたって透明になり多量の混入物質を有する培養物を形成することになる。分化、埋め込み、および継代プロセスの見本画像を図 1に示す。

微量注入システムのセットアップは図 2に示す通りである。IHOs は、フェノールレッド/細菌溶液とマイクロインジェクションされ、その赤色を保持し、重複した注射を防ぐために感染した iHOs の同定を可能にします。播種された細胞内細菌の数は、修飾ゲンタマイシン保護アッセイに従って行われる。rhIL の prestimulation は S を制限します。サルモネラ感染は、rhIL 治療後に観察される細胞内細菌の減少を伴う (図 3)。また、宿主の IEC-細菌性相互作用の可視化を促進するために、感染した iHOs を免疫染色 (TEM) で日常的に処理しています (図 4)。

図 1: iPSCs の分化を iHOs に誘導した。IPSCs から iHOs への分化の代表的な配列は、観察された形態変化およびこれらの変化を駆動するのに必要とされる成長因子を実証する。決定的な内胚葉は、分化の第4日目に形成され、アクチビン A、FGF、BMP −4、LY294002、および CHIR99021 の組み合わせの特定の濃度への曝露に続く。8日後、特異的濃度の CHIR99021 およびレチノイン酸を有するこの決定的な内胚葉のパターニングは、hindgut 形成をもたらす。Postembedding は、スフェロイド形成が観察される。Prointestinal 増殖因子 spondin 1、ノギン、EGF、CHIR99021、およびプロスタグランジン E2 を添加した培地と重ね合わせて支持基底膜マトリックスを用いて持続的に継代した後、スフェロイドは出芽 iHOs に進行する。(画像は4倍 ~ 10 倍の倍率で撮影しました)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: Sで IHO を微量注入する。サルモネラ.(A)環境室に封入された微量注入システム (材料の表を参照してください。これは管理された環境の iHOs の注入を可能にする (37 ° c/5% の CO₂)。(B) 細菌接種は、微量注入系に付着した microcapillary を用いて iHO 管腔内に直接送達される。(C) フェノールレッドと細菌 inoculums を混合することにより、どの iHOs が感染しているかは明らかであり、従って同じ iHO の重複注射を避ける。画像は10倍の倍率で撮影した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3:RhIL を有する Kolf2 細胞株に由来する iHOs の前処理は、S を制限する。腸管上皮細胞への侵入を SL1344 サルモネラ。ゲンタマイシン保護アッセイについて、iHOs は、感染前に 100 ng/mL rhIL-22 18 h で処理し、未処置で放置し、90分 postinfection にインキュベートした。データは3つの生物学的反復のための3つの技術的な反復の平均± SEM である。有意性の検定では、マン・ホイットニー U 検定が使用されました。p < 0.0001.この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: IECs と s. サルモネラ SL1344 との相互作用これらのパネルは Sと注入される iHOs を示す。サルモネラ SL1344 を3時間インキュベートし、(A) 免疫蛍光または(B) 透過型電子顕微鏡のための固定および処理に先立った。パネルAでは、細菌は iHO 内腔内に見られ、上皮と相互作用する。核は、4′、6-diamidino-2-フェニル (DAPI) dilactate (青)、ファロイジン (赤色) を有する細胞膜、及び CSA − 1 (緑色) を有する細菌で染色される。画像は20倍の倍率で撮影されています。パネルBは、侵入後のサルモネラの3つの異なる細胞内処理経路を示す。細菌はサルモネラ含有液胞の中で (a)、細胞質の中では遊離しており、(c) オートファジーを受けている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

RPMI/B27 培地
コンポーネント：	量：
グルタミンサプリメントと RPMI 1640 培地	500 mL
B27 無血清サプリメント50x	10Ml
iHO ベース成長培地
コンポーネント：	量：
高度 DMEM/F12	500 mL
B27 無血清サプリメント50x	10Ml
N2 無血清サプリメント100x	5Ml
HEPES 1 M	5Ml
L-グルタミン 200 mM	5Ml
IHO ベース成長培地の成長因子
コンポーネント：	量：
組み換え型ヒト R-spondin1	500 ng/mL
組換えヒトノギン	100 ng/mL
上皮成長因子 (EGF)	100 ng/mL
プロスタグランジン E2	2.5 μ m
CHIR99021	3μ m
Y-27632 dihydrochloride 一水和物	10μ m

表 1: メディアのレシピ

Discussion

このプロトコルは、腸内感染をシミュレートするモデルとして、iHOs とその有用性に hiPSCs の分化を概説します。以下では、プロトコルの重要な手順と、変更または改善された点について概説します。

このプロトコルは、以前に公開された作業²⁵と比較して hiPSCs の差別化プロセスを合理化します。以前に使用された方法は、他の hiPSC 培養系 (例えば、フィーダー依存性 hiPSC 培養物) から化学的に定義された培地-ポリビニルアルコール (CDM − PVA) への hiPSCs の移送を必要とした。CDM-PVA へのこの転送は、通常、2〜3週間かかり、hiPSCs の毎日の供給を必要とします。このプロトコルはまた、一貫して効果的ではなく、いくつかの差別化が失敗しました。したがって、我々は、同じ成長因子を用いて分化を試さ、幹細胞培養培地 (CDM-PVA ではなく) で成長した hiPSCs を開始し、分化日数 0-3 における CDM − PVA を幹細胞培養培地と交換する。これは、これまでの5つの独立した hiPSC ライン試さのために成功しており、差別化プロセスをはるかに迅速かつ効率的にしています。これはまた、hiPSCs の分化前に週末のない培養を可能にし、hiPSC 培養の柔軟性をより高めることを可能にする。この方法によって生成された iHO 線は、hiPSC 線 Kolf2、Yemz1、および Lise1¹⁶について前述したように腸上皮のマーカーのために phenotyped し、前のものを使用して生成された表現型と見分けがつかないように見えるプロトコル。

播種後、iHOs は、少なくとも1ヶ月のルーチン継代を必要とし、成熟を促進するために4〜7日ごとに分割します。使用される iPSC 線と初期培養の密度に応じて、iHO の開発に多少のばらつきがあることに注意してください。最初のいくつかの継代の間に、iHOs ていない細胞を視覚的に汚染することになる。これらは最終的には死滅し、球状のクリーンな培養物を残し、約4週間後、出芽 iHOs。さらに、内部のイメージ投射システムは望ましい形態を iHOs だけ選択し、通ることを使用することができる。IHOs が成熟するにつれて、成長率と密度に応じて、6 ~ 7 日ごとに分割する必要があります。次のいずれかが発生した場合、iHOs は、このポイントの前に分割する必要があります: iHOs の管腔空洞が死んだ細胞でいっぱいに開始し、基底膜マトリックスが崩壊し始め、iHOs は基底膜マトリックスから成長し始める、または文化はあまりにも 密集しており、メディアは非常に迅速に黄色になり始めます。

いったん iHO 培養が確立されると、iHOs の出現がいつでも変化するか、または予想と異なる場合 (例えば、培養は出芽ではなく球状のままである)、みつかりを介した免疫組織化学および qPCR による細胞マーカーiHOs 内の細胞型の分化 (例えば、杯細胞、パネート細胞) が無傷のままであることを確実にするために繰り返される。IHOs がもはや分化していない場合、それらは廃棄されるべきであり、redifferentiated または iHOs のそれ以前の通過は解凍し、再構成されるべきである。IHOs が分化しなくなった場合、潜在的な原因は培養の年齢 (6 ヶ月以上前のものであれば)、成長因子の活性 (これらは製造者の指示に従って再構成されることを確認し、避けるために小さなアリコートで凍結したままである複数の凍結融解サイクル)、あまりにも頻繁または暴力的な通路 (一般的に、継代は週に1回のみ発生する必要があります、そして、iHOs が手動で、定期的にあまりにも激しく解離している場合、彼らは完全に区別するために停止します)。

我々は、upregulates に感染する前に IL-21 が 18 h 刺激することを RNA 配列により確立し、抗菌遺伝子とバリア防御表現型に関与するものを用いた。RhIL-22 (またはシステムがこれに使用されている場合は代替サイトカイン) を伴う prestimulation を含むアッセイに対して新しい iHsO を使用する前に、サイトカインによってアップレギュレートされることが知られている遺伝子の活性を確認することをお勧めします (IL-22 の場合、我々は、iHOs の刺激後に qPCR を介してDUOX2およびLCN2) を使用して、受容体発現および無傷のシグナリングを保証した。IL-22 の最初の使用に先立ち、我々はまた、IL-6 レセプターの発現が基底であったことを立証するために iHOs 上の IL −22受容体を特定するために免疫組織を実施し、prestimulation が iHO 培養に rhIL を加えることによって単純に達成できることを意味する媒体。しかしながら、受容体が apically に発現されている場合、このプロトコルはリガンド apically を送達するように適合されなければならないことがある。

微量注入システムに関する落とし穴は、一般的に注射に必要な針の繊細さに関連しています。ここでは、6μ m ルーメンで市販のドリルチップを使用しています。これは、ガラス毛細管²⁶から注射針を引っ張ることが可能であるが、これはあまり均一ではないかもしれないが、針先端または iHOs に注入される一貫性のないボリュームからの漏出につながる。注射が染料としてフェノールレッドを使用するための一つの理由である iHO ルーメンに行われていることを確認することが重要です。iHOs は赤色の接種を視覚的に拡大して保持し、どの iHOs が注入されたかを確実にすることができます。時折針は iHO 壁から破片で詰まります。この場合は、iHO の内側から針の先端を取り外し、マイクロインジェクションシステムの [クリーン] ボタンを押します。これは、閉塞をクリアする必要があり、より高い空気圧の短い期間を生成します。それはまた、プレート上に細菌の接種のいくつかの漏れを誘導します。したがって、これが発生した場合、プレートあたりの細菌の接種の平等を確保するために、すべてのプレートにクリーンアクションを繰り返す必要があります。HiPSC 派生 iHOs の大きな利点の1つは、そのサイズです。マウスおよび初代ヒトオルガノイドからの腸管オルガノイドははるかに小さい (hiPSC 由来 iHOs のために、それぞれ²⁷、250〜1500μ m に対して最大〜100μ m および100〜300μ m まで測定)、大量のオルガノイドの注射が遅くなることを意味する。これにより、hiPSC 由来の iHOs で大規模な射出実験を試さすることができます。また postinfection を収穫することによって iHOs の管腔内容を研究し、iHOs を手動で DPBS し、管腔内容を解放することも可能である。微量注入の場合は、高濃度の細菌を使用することをお勧めします。我々は、低濃度が iHOs を含む IECs からの応答を生成するのに十分ではなかったことを発見した。さらに、その後、顕微鏡検査を使用して内在化細菌を見つけることは困難であった。Inoculums は、異なる細菌株に対して最適化されなければならない場合がある。

要約すると、hiPSC 由来 iHOs は腸内感染症に対する上皮応答を直接解剖するための有望なモデルを提供し、細胞内浸潤カウントを研究するか、画像化、iHO 上清におけるサイトカインレベルの測定、または RNA の収穫病原体に曝露した後の転写変化を研究する。これらの有用性は、将来的にはヒトが制限された病原体の感染モデルを確立し、この技術を使用して特定の疾患関連遺伝子変異を研究することによって調査をパーソナライズする可能性を活用するためにさらに明らかになるであろうおよび薬剤の応答。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
5 mm ガラス底注入皿	MatTek corporation	P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Alexa fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A22287	1:1,000 濃度で使用
B27 無血清サプリメント	Life Technologies	17504044	ストック濃度 50 倍、最終濃度 1 倍
BMP-4 組換えヒトタンパク質	R&D	PHC9534	ストック濃度 10 μg/mL、最終濃度 10 ng/mL
細胞回収液(細胞リフティング液)	BD	354253
CHIR99021	Abcam	ab120890-5mg	ストック濃度 3 mM、最終濃度 3 & マイクロ;M
コラゲナーゼ、IV型粉末	ライフテクノロジー	17104019	0.1%で再構成
コーニング極低温バイアル	コーニング	430487
Costar TC 処理 24ウェル培養プレート	コーニング	CLS3527
DAPI二乳酸	Sigma-Aldrich	D9564-10MG	10 nM濃度で使用
Dulbecco'PBS(MgCl2またはCaCl2なし)	Life Technologies	14190-144
Dulbecco'PBS(MgCl2およびCaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662-100ML
上皮成長因子	R&D	236-EG-200	原貨濃度 100 μg/mL、最終濃度 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (マイクロインジェクションシステム)	Eppendorf	920000011
Eppendorf Femtojet express (マイクロインジェクションシステム)	Eppendorf	5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (幹細胞培養培地)	Life Technologies	A2858501
EVOS XL イメージングシステム (インフードイメージングシステム)
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272-10ML	ストック濃度 10 mg/mL、最終濃度 0.1 mg/mL
ヤギ抗サルモネラ菌、CSA-1	Insight Biotechnology	02-91-99	1:20 濃度で使用
HEPES 1 M	Life Technologies	15630056
ノックアウト血清補充 (setrum replacment)	Gibco	10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement	ThermoFisher
L-glutamine	Life Technologies	A2916801	Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002	Promega UK	V1201	原液濃度 50 mM、最終濃度 10μM
Matrigel、GFR、フェノールフリー(基底膜マトリックス)	Corning	356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x)	Gibco	11140035
N2 serum-free supplement	Life Technologies	17502048	Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140163	ストック濃度 10,000 U/mL、最終濃度 100 U/mL
フェノールレッド	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
ピエゾドリルチップマウス ICSI、25°C; 先端角度、6 µm 内径	エッペンドルフ	5195000087
プロスタグランジン E2	Sigma	P0409-1MG	原液濃度 2.5 mM, 最終濃度 2.5 mM
組換えヒトFGF 基礎	R&D	233-FB-025	ストック濃度 100 μg/mL、最終濃度 100 ng/mL
組換えヒト IL-22	R&D	6057-NG-100	ストック濃度 100 μg/mL、最終濃度 100 ng/mL
組換えヒト Noggin	R&D	6057-NG-100	ストック濃度 100 μg/mL、最終濃度100 ng/mL
組換えヒト R-spondin1	R&D	4645-RS-025	ストック濃度 25 mg/mL、最終濃度 500 ng/mL
組換えヒト/マウス/ラット アクチビン A	R&D	338-AC-050	ストック濃度 100 μg/mL、最終濃度 100 ng/mL
回収細胞培養凍結培地 (cell freezing medium)	Gibco	12648010
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	ストック濃度 3 μM、最終濃度 3 mM
RPMI 1640 培地と Glutamax サプリメント (RPMI 培地と L-グルタミン サプリメント)	Life Technologies	61870010
Triton X-100 (細胞溶解バッファー)	Sigma-Aldrich	RES9690T-A101X	1% 濃度で使用
Versene (EDTA 溶液)	Life Technologies	15040066
Vitronectin XF	Stemcell Technologies	7180
Y-27632 二塩酸塩一水和物	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	ストック濃度 3 mM、最終濃度 10 mM