非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

サマリー

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。

要約

多くのタンパク質の構造は共有性ジスルフィド結合によって安定化されます。最近の仕事では、この債券も翻訳後修飾として分類されています。このように、生細胞におけるこの修飾を研究することができることが重要である。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析およびホルムアルデヒド架橋の2ステップ法を介して行う。この二段階法は、その技術的容易さと低運転コストのためにジスルフィド結合によって安定化された多量体錯体を明らかにする最初のステップとして有利である。ここで、ヒト骨骨肉腫細胞株 U-2 OS は、dUTPase の核アイソフォームを特異的に分析することによりこの方法を説明するために用いられる。

概要

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。最近の仕事では、この結合はまた、可逆的な翻訳後修飾として分類されており、タンパク質機能、位置および相互作用^1、2の変調を可能にするシステインベースの「レドックススイッチ」として機能し、 ^3、4。したがって、この変更を研究することができることが重要です。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元性 SDS − PAGE 分析⁵を介して行う。SDS − PAGE 分析は、多くの実験室で用いられる技術であり、その結果は、迅速かつ容易に、かつ最小限のコストで解釈することができ、質量分析などのジスルフィド結合を同定するために使用される他の技術よりも有利である。 ^、7及び円形二色性⁸.

この方法が研究に役立つ適切な技術であるかどうかを決定するための1つの重要なステップは、関心のあるタンパク質の一次配列を徹底的に調べて、シス....

プロトコル

1. ヨードアセトアミドを使用して遊離システイン残基を遮断

1. 6 cm²ディッシュの u-2 OS セルを 50% ~ 60% のコンフルエントで、10% のウシ胎児血清と 1% のピルビン酸ナトリウムを 5% co2 で37° c で含有する高グルコースを用いて成長させます。
2. 使用する直前に 10 mM ヨードアセトアミドの新鮮なストックを作り、未使用の試薬を廃棄します。
3. 0.1 mM 最終濃度ヨードアセトアミドを細胞培養培地に直接添加する。ゆっくりと室温で2分間皿をロックします。

2. 細胞の採取

1. セルからメディアを吸引します。
2. 5 mL の冷燐酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を3回洗浄する。最後の PBS 洗浄溶液を吸引し、冷 PBS の1Ml を追加します。
3. セルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞をこすります。1つの mL のピペットを使用して PBS および細胞の懸濁液を引き、1.5 mL マイクロ遠心管にすべての液体を分配する。
4. 4° c で3分間 7500 x gで細胞を回転させる。PBS を吸引し、細胞ペレットを後に残します。細胞のペレットは処理まで-80 ° c で貯えることができる

結果

核 dUTPase は、各モノマータンパク質¹¹の第3のアミノ酸に位置付けられた2つのシステイン残基の相互作用を通じて安定な二量体構成を形成する分子間ジスルフィド結合体を形成する。これは図 1a、Bに示されています。このジスルフィド結合が非還元環境における遊走異常による非特異的相互作用ではなかったことを確認するために、t は適切な制御を含めることが不可欠であった。注目すべきは、核 dUTPase はヒトに存在する4つのアイソフォームのうちの1つである。4つのアイソフォームのうち3つは、共通の触媒コア^11,12を共有しながら固有のアミノ末端ドメインを有する。ウエスタンブロットに見られるように、収穫時のヒト細胞における dUTPase の単量体確認は、dUTPase の少なくとも3種のアイソフォーム (ミトコンドリアのア.......

ディスカッション

ここで概説される方法は、ジスルフィド結合を介して安定化された多量体錯体の分析のためのストレートフォワードプロトコルを与える。このプロトコルは、他の細胞培養ライン、組織および生物に容易に適応することができ、広範囲の用途を可能にする。

この手順の重要なステップは、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを確認することです。遊離システイン残基は、ヨードアセトアミド¹³を使用してブロックすることができます。このアルキル化剤は、それらのチオール基を介して結合されたシステイン残留物に連結し、新しいジスルフィド結合の形成を阻害する。しかし、ジスルフィド結合が治療時に存在する場合、この薬剤はそれを破壊しない。ヨードアセトアミドの最適化は、濃度と時間のバリエーションを使用して行うことができます。しかし、この試薬に曝露すると細胞死を引き起こすことになる。

役に立つかもしれないこのプロトコルへの追加ステップは、ホルムアルデヒド架橋の最適化です。ホルムアルデヒドの割合の変動は、架橋

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16% プレキャスト TGX ゲル	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 フラスコ	セル スター	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 ディッシュ	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
アマシャム ECL 検出キット	GE
ブロット転写装置	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	細胞シグナル伝達	99985
細胞溶解バッファー	細胞シグナル伝達	9803
遠心分離機	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
ドリル
EDTA	Sigma Aldrich	M101
電気泳動装置	Invitrogen	A25977
極厚ウェスタンブロッティングペーパー	ThermoFisher	88610
胎児ウシ血清	Gibco	1932693
ホルムアルデヒド	ThermoFisher	28908
ガラステフロンホモジナイザー
グリセロール	シグマ アルドリッチ	65516
グリシン	RPI	636050
ヒートブロック	デンビル	10285-D
ヘペ	スシグマ アルドリッチ	H0527
塩酸	VWR	2018010431
ヨードアセトアミド	サーモフィッシャー	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
メタノール	Pharmco	339000000
脂肪粉ミルク	細胞シグナル伝達	99995
PBS	シグマ Aldrich	P3813
PMSF	シグマ アルドリッチ	329-98-6
ポジクリック管	デンビル	C2170
電源	バイオラッド	200120
染色マーカー	サーモフィッシャー	26619
PVDF 膜	バイオラッド	162-0177
ロッカー	信頼性 科学	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
二次抗体	細胞シグナル伝達	70748
スモールセルスクレーパー	Tygon	S-50HL class VI
塩化ナトリウム	RPI	S23020
ピルビン酸ナトリウム	Gibco
Sonicator	Branson	450
ブロッティング用スポンジパッド	Invitrogen	E19051
攪拌プレート	コーニング	PC353
スクロース	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine Running buffer	VWR	J61006
トリトン X-100	シグマ アルドリッチ	T8787
トゥイーン 20	シグマ アルドリッチ	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X 線フィルム	サーモフィッシャー	34090

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