A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

サマリー

ここでは、ゼブラフィッシュ稚魚から光誘発網膜電図反応の測定を簡素化するプロトコルを提案する.新規円錐状のスポンジ チップ電極は、ビジュアル開発の研究は、ゼブラフィッシュ稚魚網膜電図 ERG を信頼性の高い結果と低コストで達成するために簡単に使用する助けることができます。

要約

ゼブラフィッシュ (動脈分布) の発達研究の脊椎動物モデルとして用い、視覚神経科学に特に適して。鳥類網膜電図 (ERG) は、視覚的なパフォーマンスの機能測定より高い脊椎動物種に確立されている理想的な非侵襲的な方法です。このアプローチは、ますますゼブラフィッシュ、発達初期の幼虫などの視機能を検査するため使用されています。日付に幼虫ゼブラフィッシュ ERG の最も一般的に使用される記録電極はガラス マイクロ ピペット電極は、限られた資源で研究所の挑戦を提示、その製造に特殊な機器が必要です。ここでは、円錐状のスポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルを提案します。新規電極は製造してより経済的なガラス マイクロ ピペットより幼虫の目を損傷する可能性は低く、ハンドルに簡単です。以前に公開した ERG メソッドと同様現在のプロトコルはそれぞれ視細胞と双極細胞応答、a ・ b 波、外側の網膜機能を評価できます。プロトコルは、ユーティリティ、感度、および新規電極の信頼性を支えるゼブラフィッシュ幼虫の初期開発全体を通して視覚機能の改良を説明することが明らかに。簡易電極は、モデル生物の新しい ERG システムを確立または変更既存小動物 ERG 測定装置の試作ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュを使用する視覚神経科学の研究者を助ける時に便利です。

概要

ゼブラフィッシュ (動脈分布) 視覚神経科学の研究など、広く使用されている遺伝的脊椎動物モデルとなっています。この種の人気の高まりは、遺伝子操作、非常に節約された脊椎動物の視覚システム (ニューロンの種類、解剖学的形態および組織、および基になる遺伝学)、高い多産の使いやすさなどの利点に起因することができます。飼育哺乳類モデル¹と比較しての低コスト。非侵襲的な局所網膜電図 (ERG) は、人間の視覚機能を評価するために臨床的に使用されています長いと齧歯動物およびゼブラフィッシュ稚魚^2,3を含む大小の種の範囲のビジョンを定量化する実験室の設定で^,4,5します。 最も一般的分析 ERG コンポーネントは、a 波と b 波、それぞれ光を感じる視細胞と双極ニューロンから発信されました。ゼブラフィッシュ稚魚における網膜の異なる層は、3 日後受精 (dpf) によって確立された、シナプス ターミナル光受容体円錐形の形態の 4 dpf^6、7の前に成熟しました。ゼブラフィッシュ稚魚の外側の網膜機能は 4 dpf、ERG がこの初期の時代以降から測定可能なことを意味する前にこのように行われます。短い実験サイクルとモデルの高スループット特性のため ERG に適用されている疾患モデルにおける機能的アセスメントのゼブラフィッシュ稚魚カラー ビジョンと網膜の開発を分析、ビジュアルの概日リズムを勉強してテスト薬^{8,9,10、11,12}。

しかし、ゼブラフィッシュ稚魚の現在アプローチ ERG は採用が困難になることがありますいくつかの複雑さを持っています。公開されたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルは一般的、記録電極^3,4,5,として¹³、高品質マイクロ ピペットを必要とする導電性の液体で満たされたガラス ピペットを使用してください。ヒント³を。専門機器、マイクロ ピペットの引き手などマイクロフォージ、いくつかのケースでは、その製造に必要です。これは、限られた資源で研究所のための挑戦をすることができます、ゼブラフィッシュ稚魚視覚機能の測定に使用可能な小さな動物 ERG システムを適応させるときにも余分なコストに 。滑らかに、時でさえシャープ マイクロ ピペット チップは幼虫の眼の表面を損傷することが。さらに、電気生理学の商業マイクロ ピペット ホルダーは、固定の銀線で構成されます。これらのワイヤを固定になる増加維持管理費につながる新しいホルダーの購入を必要とする、繰り返し使用した後不動態処理されました。

ここでゼブラフィッシュ稚魚 ERG 測定の確立された小動物 ERG セットアップを適応させるために特に有用である円錐形のスポンジ チップ記録電極を用いた ERG 手法について述べる。電極が一般的なポリ酢酸ビニル (PVA) スポンジおよび他の専門にされた装置なし銀細線を使用して簡単になります。我々 のデータは、この新規電極は敏感であり 4 と 7 の dpf 間幼虫のゼブラフィッシュの網膜の神経回路の機能の開発を示すに十分な信頼性の高いことを見る。この経済的で実用的なスポンジ チップ電極は、エルグの新しいシステムを確立することやゼブラフィッシュ研究、小動物の既存のシステムを変更することは研究者に役に立つかもしれません。

プロトコル

網膜電図 (ERG) プロシージャがすべての動物の使用とケアのための実践規範のオーストラリア国立保健医療研究評議会の規定に従って行われた、動物倫理委員会で承認された、メルボルンの大学.

1. バッファー準備

1. 金魚リンゲル液バッファー (1.25 M の NaCl、KCl 26 mM, 25 mm CaCl₂、10 mM MgCl₂, 100 mM グルコース、100 mM HEPES) x 10 の準備逆浸透 (RO) の水を使用しています。PH 7.8 にバッファーを調整し、0.22 μ m フィルターを使用してバッファーを滅菌します。ソリューション ストック³として 4 ° C で 10 x バッファーを格納します。
   注:リンゲル液バッファー x 10 は、3 ヶ月以内に使用ください。
2. 実験の日、逆浸透水を使って金魚リンゲル液バッファー x 10 を希釈して金魚リンゲル液バッファー x 1 を作る。
   注:金魚リンゲル液バッファー × 1、ゼブラフィッシュ稚魚の配置に使用するスポンジをはじめ、PVA スポンジと記録電極の先端部には、スポンジを飽和状態に使用されます。

2. 電極作製

1. 円錐状のスポンジの記録電極を準備します。
   1. 白金電極リード拡張子からオスをカットし、10 mm メス刃を使用して外側のポリテトラフルオロ エチレン絶縁被覆の端から削除します。電極リードのインナーワイヤーを損傷しないように注意してください。
   2. シルバーワイヤー (直径 0.3 mm) の 40 mm 長さにカットにしっかりと電極の鉛露出のインナー ワイヤと銀線をまとってによって接続これ。銀線公開 (図 1 a) ~ 15 mm 長さを残して、絶縁テープを使用して関節を包みます。
   3. 60 の 9 V DC 電源を使用して塩化物と露出の銀線を電気メッキ s 信号伝導を改善します。食塩で露出シルバー チップのもう一方の端をバッテリーのプラス端子に接続します。他の配線をバッテリーのマイナス端子に接続、生理食塩水²にワイヤのもう一方の端を浸します。
      注:また、銀線を塩素漂白剤溶液 (有効成分 42 グラム/L のナトリウム次亜塩素酸) で 1 時間浸漬。
   4. カット 〜 20 mm × 20 mm スクエアの PVA スポンジはさみを使用して円錐形 (図 1 a) にします。1 x のバッファーを使用してスポンジを飽和させます。顕微鏡接眼レンズ上のスケール バーと、〜 40 μ m の直径の円錐形の頂点を形成するのにメスの刃を使用します。空気は、それが固体になるまで吸収紙ティッシュに円錐状のスポンジを乾燥させます。
      注:PVA スポンジを大幅拡大が飽和状態、従ってスポンジは最初、円錐の頂点を形成する前に生理食塩水で飽和していることが重要です。
   5. Chloriding、空気乾燥後 5 分挿入吸収性組織に銀線円錐の底面を乾燥、ソリッド、円錐状の PVA スポンジに銀線。太陽光発電アイテム (図 1 b ・ C) を軽減するマスクのテープを使用して任意の余分な露出した金属を絶縁しなさい。
      注:各実験的セッションの後に、銀線からスポンジを削除します。再利用のため、逆浸透膜水と空気の乾燥を使用してスポンジを洗ってください。最適な信号収集するように、銀線の単独使用をお勧めします。PVA スポンジが 5 回以上を再利用されませんする必要があります。
   6. 実験の日、スポンジを完全に飽和状態に少なくとも 15 分のバッファー x 1 に記録電極のスポンジ チップを浸します。
2. スポンジ チップを取り付けることがなく、上記に説明したように、参照電極を準備します。
3. 市販の接地電極を取得します。

3. ゼブラフィッシュ準備

1. 暗適応一晩ゼブラフィッシュ幼虫 (> 8 h) 15 mL チューブにゼブラフィッシュを置くことによって録音の前に (< チューブあたり 20 幼虫) 暗いインキュベーターでアルミ箔に包まれました。十分な酸素供給を確保するため蓋を取り外します。
2. レコーディングの日、幼虫を含む箔ラップ ファイティングファルコン管に蓋を締めなさいし、チューブが耐光性であることを確認します。エルグ ラボに幼虫を輸送します。
3. 暗闇の中で薄暗い赤い照明光-発光ダイオード (LED; 17.4 cd.m^-2、λ_max 600 nm) からの支援を受けてペトリ皿に魚を注ぐ。光の露出を最小限に抑えるために耐光性のタオルを使用してシャーレをカバーします。

4. スポンジ プラットフォームの準備

1. 35 mm のペトリ皿にぴったりと合うように乾燥の PVA スポンジの矩形をカットします。スポンジの厚さをペトリ皿の深さとほぼ同じにする必要があることを確認します。
2. 参照電極の銀線に合わせてスポンジの一方の端を垂直方向に小さい切り傷を作る。
3. 1 飽和するまで金魚リンゲル液バッファー x PVA スポンジを浸します。その後、きれいな 35 mm のペトリ皿にスポンジを置きます。軽い指押下に応じてスポンジからしみ出させるソリューションがないまでに余分な液体を吸収するのに紙タオルを使用します。

5. 動物や電極位置

1. 0.02% tricaine 1 x 金魚リンゲル液バッファーで希釈を使用して幼虫を麻酔します。
2. 3 mL Pasteur のピペットを使用して紙タオル (²〜 3 cm) の正方形の上に麻酔の幼虫を転送します。
3. 鉗子を使用したしっとりスポンジ プラットフォームに幼虫を含むペーパー タオルを配置します。リンゲル液バッファーに浸した高級ブラシを使用して、幼虫の位置を調整します。幼虫の下にペーパー タオルの広場に近く液体から分離された 1 つ目に、上向きに直面していることを確認します。
4. 保湿アイジェル幼虫の ERG 記録を通して潤いを保つために、ヘッドを除く、幼虫の体を艶をかけます。
5. ファラデーケージ (図 1) 内に位置する Ganzfeld ボウル光刺激の前に小さな水加熱プラットフォームにスポンジのプラットフォームでシャーレを配置します。
   注:スポンジと幼虫の体の温度の維持は、ERG 信号を安定を保証します。
6. プラットフォーム スポンジ (図 1) でなされたカットに参照電極を挿入します。
7. ファラデーケージの中に商業的に得られた接地電極を接続します。
8. 記録電極の電極ホルダーを付ける、マイクロマニピュレーター (図 1) の脳定位固定装置のアームにホルダーを固定します。3 mL パスツール ピペットを使用して、リンゲル液再飽和のため電極のスポンジの先端に × 1 の一滴を滴下します。
9. 電極の配置のための ERG プラットフォーム上ファラデーケージ内顕微鏡の位置。
   注:杉本を維持しながら、照明は薄暗い赤色 LED 17.4 cd.m^-2(λ_max 600 nm) の幼虫の観察を許可してアクティブ電極の配置によって提供される必要があります。
10. 顕微鏡下で幼虫の観察を許可するスポンジ プラットフォームの位置を調整します。吸収性組織を使用して、電極スポンジ チップから余分な液体を削除します。
11. ゼブラフィッシュ稚魚の目 (図 1E) 中央角膜表面に優しく接するようにアクティブ電極を配置します。
12. スポンジ プラットフォームに向けて Ganzfeld ボールを移動し、幼虫がボールによって覆われていることを確認します。
13. 余分な電磁ノイズを低減するファラデーケージを閉じます。

6. 網膜電図の記録

1. ERG システムを特定のコンピューターのソフトウェアを使用して²以下推奨設定に基づく刺激をトリガーし、データを取得する (詳細については材料の表を参照してください)。
   1. 4 khz 以上 650 ms 取得ソフトウェアのウィンドウ (2,560 ポイント) を記録システムのサンプリング レートを設定します。
   2. 1,000 × システムのゲインを設定します。
   3. システム 1-300 Hz の帯域通過フィルターを設定します。
   4. ノッチ フィルターを使用して、60 Hz (またはローカル ユーティリティ周波数に応じて 50 Hz) を軽減するノイズ。
      注:理想的な騒音レベルは ± 10 μ V 以上もないはずです。
2. 以下の手順を使用して、データ コレクションを開始します。
   1. 単一のテスト-フラッシュ (0.06 ログ cd.s/m²) を使用すると、電極の位置を評価するのに目からテスト応答を測定します。
      注:テストのフラッシュのこの強さは、b 波の振幅 4 dpf 幼虫で 25 μ V 以上になります。頑健な応答を測定できない場合は、電極の位置を変更して別フラッシュが電極に位置付けていることを確認するをテストします。
   2. 暗闇の中には、動物を許可する次のテストのフラッシュの録音の前に完全な暗闇の中で 3 分の適応。
   3. 現在は、明るい光の強度を調光器から点滅します。
   4. 全体平均信号は、信号のノイズのレベルに従って繰り返されます。
      注:一般に、平均調光レベル (以下 3 の繰り返し) でより多くの信号と明るい光のレベル (通常 1 の繰り返し) より少ない。10 から 60 までの刺激間間隔を徐々 に長く s 最も明るい、最も暗いの光のレベルから。サンプル プロトコルを表 1に示します。
   5. 録音後 0.1 %tricaine を使用しての幼虫を殺す人道的。

7. 分析

1. 負の波、トラフにベースラインからの波の振幅と正 b 波のピークに負の波の谷から b 波の振幅を測定します。
2. それぞれの波の谷と b 波のピークの刺激開始から a 波と b 波の暗黙的な時間を計測します。

結果

7 dpf に 4 から毎日取られる ERG 測定の代表的な結果を説明します。4 dpf ERG 応答を示す堅牢な a 波と b 波のコンポーネントがあり、それぞれ視細胞と双極細胞から生じる.テスト各歳、b 波の振幅増加光強度 (図 2;図 3)。特に、年齢と共に増加し調光が点滅するゼブラフィッシュ稚魚網膜の感度。A ・ b 波が明らかに信号が古い幼虫 (図 2) のこれらの強度で検出されたに対し-1.61 ログ 4 dpf で cd.s/m²より低い強度で認識可能でした。4 と 5 の dpf の間伸びと b 波応答 (P < 0.0001;図 2AB;図 3 b)。5 と 6 の dpf に比べ 7 dpf で 2.48...

ディスカッション

ERG など機能のリードアウトは、ゼブラフィッシュ稚魚^8,9,12,14を研究に使用するツールのスイートでますます重要になっています。ゼブラフィッシュ稚魚の目のサイズが小さいためガラス マイクロ ピペットは、ほとんど公開されているプロトコル^3,4,5,8,9の電極として適応されています。^,12,13,<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上m	フィルターMillex GP	SLGP033RS	10× sterilizatio 1 mLの注射器のための金魚リンガーの緩衝液をろ過
	Terumo	DVR-5175	30G × ½電極スポンジの先端に生理食塩水の滴を追加する針は、ERG信号の乾燥とノイズの増加を防ぎます。
30 G × ½「針	テルモ	NN*3013R	食塩水totehソプンゲチップ電極を追加するため。
バイオアンプ	ADInstruments	ML135	ERG信号を増幅します。
漂白剤溶液	キングホワイト	9333441000973	ライバー電極の塩素処理の代替方法。有効成分:42 g / L次亜塩素酸ナトリウム。
循環式ウォーターバス	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	水加熱プラットフロムを作るために使用。
電極リード	グラステレファ	クターF-E2-30	銀線電極をアンプに接続するためのプラチナケーブル。
ファラデーケージ	測光ソリューションインターナショナル		ダークアフォーテーションを維持し、Ganzfeldセットアップを囲んで信号対雑音比を改善します。
ガンツフェルドボウル	測光ソリューションインターナショナル		カスタム設計の光刺激装置:直径36 mm、開口部サイズ13 cm。
ルクシオンLEDsフィ	リップスライト株式会社		光刺激には、5WのLEDが20個、1WのLEDが1個あります。
マイクロマニピュレーター	ハーバード装置	BS4 50-2625	実験中に記録電極を保持します。
Microsoft Office Excel	Microsoft	バージョン2010	用のスプレッドシートソフトウェア。
保湿アイジェル	ジェンティールジェル 9319099315560		録画中にゼブラフィッシュの幼虫を覆い、脱水症状を防ぐために使用されます。有効成分:0.3%ヒプロメロースおよび0.22%カルボマー980。
パスツールピペット	コパン	200C	ゼブラフィッシュの幼生を世話に移すために使用されます。
Powerlabのデータ収集システム	ADInstruments	ML785	LEDを制御して刺激を生成します。
PVAスポンジ	MeiCheLe	R-1675	ゼブラフィッシュの幼生の配置と円錐形の電極ti
食塩水	Aaxis Pacific	13317002	銀線電極の電気めっき用。
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Powerlabシステムを通じて刺激を同時にトリガーし、データを収集
シルバー(細い丸いワイヤー)	A&Eメタル	0.3mm	ERG電極の記録・参照用電極に使用。
実体顕微鏡	ライカ	M80	錐形のスポンジ頂点(接眼レンズにスケールバー付き)の成形と測定に使用されます。電極配置のためにファラデーケージに配置されます。
トリカイン	Sigma-aldrich	E10521-50G	ゼブラフィッシュの幼生の麻酔用。
水加熱式プラットフォーム	カスタムメイド		ERG記録中にスポンジプラットフォームと幼虫の体の温度を維持するため