方法論記事

組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

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DOI：

10.3791/59490

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2019年4月3日

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1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

この記事について

サマリー

試料調製法は、イメージング質量分析法による低分子交換を検出する細胞・組織の培養を対応するために開発されました。

要約

イメージング質量分析 (IMS) が 3 種類の試料に日常的に適用されています: 微生物コロニー、回転楕円体、ティッシュ セクション。これらのサンプルのタイプは興味の生物的サンプルの蛋白質、脂質、および代謝物質の分布を可視化するマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) を使って解析しました。エコイノベーション アプローチでアガロースに哺乳類の細胞培養を播くことによって、がんの化学交信を識別するために対処するため 3 つの以前のアプリケーションの長所を組み合わせて、新規サンプル調製法を開発しました。サンプルの乾燥が続く健康な組織培養します。哺乳類の組織や細胞は、組織と細胞の拡散を介して化学通信を許可する近接遊走が。特定の時点でアガロース ベースのサンプル、微生物コロニー IMS 分析の準備と同じ方法で乾燥させます。それは転移中に操作すると、卵巣に卵管から派生したハイグレード漿液性卵巣癌間の通信をモデル化する手法が開発されました。サンプル調製の最適化は、卵巣の微小環境の主要成分としてノルエピネフリンの特定につながった。新たに開発したこのメソッドは、隣接する細胞や組織間の化学コミュニケーションの理解を必要とする他の生物学的システムに適用できます。

概要

3 つの広く使われているアプリケーションの分子機能の空間分布を特徴付けるために最適化されているイメージング質量分析 (IMS): 組織スライス、回転楕円体、および微生物コロニー1,2,3。切片は、ホスト、ターゲットまたは関連性の低い特定の質量範囲内で生物学的条件のコンテキストにおける代謝物の局在の評価に使用できます。ただし、分子の機能の違いは最も重要かつ明らかな病的状態、たとえば、腫瘍に比較すると健康な組織。この IMS アプローチは特に疾患バイオ マーカーの検出、ただしの開始のために重要なことができる信号の識別ができなくなります (腫瘍グレード) などの病気の進行の各ステージで組織サンプルを取得、病気。空間を介して情報の交換は多くの生物学的システム、ユビキタス機能と組織スライスは、このダイナミックな化学リレーをキャプチャできません。化学交換と拡散を可視化することができる 1 つの方法は寒天プレート上に成長した微生物のコロニーの IMS小さな分子は寒天とを通じて拡散することができる、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI TOF) 質量分析法4経由で取り込むことができます。この成長のセットアップは、離散生物学的実体 (植民地) 間で交換される分子を識別するために使用することができ、代謝産物生産の方向性を決定することも。微生物コロニー成長用に設計されたプラットフォームは哺乳類セルの成長組織移植片の一次代謝を探索に適応され、IMS は in vitro 哺乳類システムの動的の化学交換の評価に使用されました。

ハイグレード漿液性卵巣癌 (HGSOC) が卵管上皮 (FTE) に由来する多くの場合、早期疾患開発5,6,中に卵巣に転移し明らかになった過去数年間で7,8. FTE の幹細胞、最終的に大きな腫瘍を形成、さらに転移、卵巣への普及であることの理由は不明です。前の研究は主に転移、卵巣卵巣の役割に焦点を当ててください。しかし、それが健康から発癌性の組織への移行が細胞代謝の大規模な破壊の結果し、変更する小分子9,10,11の生産実証最近されています。したがって、我々 の仮説、FTE と卵巣の間で交換される低分子化合物 HGSOC の主な転移に部分的に責任があります。

私たちの新しく開発された IMS プロシージャを使用して、幹の FTE と健康な卵巣組織の培養が卵巣からノルエピネフリンの生産を誘導することを決定しました。ただし、他の細胞の種類や細胞の FTE はないこの効果を引き出します。この方法の特別な利点、分子の生産および実際の分子を表す信号の交換を視覚化できる、共に、シグナルの原因を特定することが可能です。これは空間のすべての情報が失われる均質化試料の分析上の優位性です。モデル体制で明らかに卵巣にノルエピネフリンの生産を割り当てることができました。ノルエピネフリンは転移と卵巣癌の抗癌剤にリンクされており、IMS 方式が生体関連分子12,13,を発見することがこの分子の検出機能の検証が14. この検証は、私たち IMS のこの新しいアプリケーションは特に細胞形質転換に影響を及ぼす早期のイベントを理解して培養環境で小さい分子を識別するためにしようとしているグループの研究に役に立つことを提案することができます・転移。このメソッドの全体的な目標は組織や臓器、3 D 細胞培養体外または前のヴィヴォ組織によって表される間の交換の間に小さな分子の空間分布とアイデンティティを明らかにします。

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プロトコル

すべての動物の手続きケアと実験動物の使用のための国民の健康ガイドライン機関に従って、イリノイ大学シカゴ校制度上の動物の使用とケア (IACUC) 委員会によって承認されました。

1. 試薬の調製

  1. マウス卵管上皮 (萌) 細胞 10% 牛胎児血清を添加したアルファ最小必須培地 (アルファ MEM) メディアで加湿のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° c (FBS)、2 mM L-グルタミン、10 mg/mL インスリン、トランスフェリン、セレン (ITS) を維持します。、1.8 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mg/mL ゲンタマイシン 18.2 ng/mL エストラジ オール-17 β。セルごとに 3-4 日を渡すと、同じ日に十分なセルがあることを確認、マウスが犠牲に。
  2. 2% の agarose を準備するには、低融点アガロースの 1 g を 50 mL の蒸留水を混合します。クールに、オートクレーブ、アガロースを許可して、因数 (1 mL) 2 ml 管 (材料表参照) agarose が固化する前に。アガロースは、-20 ° C で無期限に格納できます。
  3. 1 x ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) メディアの少なくとも 2 mL を準備します。
  4. MALDI-TOF MS のマトリックスの準備 5 mg/mL を 10 mL の 1:1 α-シアノ-4-hyroxycinnamic 酸 (CHCA): ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) (材料表参照) 90: 10 ACN:H2O + 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)。マトリックスを溶解するまでのソリューションの超音波照射します。

2. マウスのコロニーおよび卵巣除去

  1. 住宅の標準的なプロシージャを使用して CD 1 マウスの繁殖ペアを維持します。分娩の日、近くの子犬時代が知られているのでで、マウスを毎日チェックします。
  2. NIH のガイドラインあたりの CO2吸入で 16-18 日齢で子犬を安楽死させます。配信 CO2 (100%)流れ率 10% – 20% の 1 分あたりのボリュームを商工会議所、呼吸が停止していた後 2 分間続けます。頚部転位して安楽死を確認します。
  3. 70% のエタノールの沈没によってすべての手術用機器を消毒します。1 x ペニシリン-ストレプトマイシンを 37 ° C でリーボビッツの L-15 メディアをウォーム アップします。
  4. 領域を消毒し、毛の混入を最小限に抑えるための 70% のエタノールと腹部の表面を湿らせます。把握は腹壁を覆っている皮膚を使用して鈍い鉗子と使用外科はさみ、大きな V 字カット皮膚と腹壁を通して臓器の内部を公開します。
  5. 内臓を鉗子を使用する側に移動します。個別に微細鉗子でそれぞれの子宮角をつかむし、少し持ち上げてください。
  6. 卵巣、腎臓のすぐ下の子宮角の終わりにあるを探します。外科はさみを使用して、結合組織の無料の卵巣を解剖します。その後、卵巣のホーンを半分にカットします。
  7. 卵巣、卵管および約 1 つ移動に予め温めておいたリーボビッツの L-15 メディアにそれぞれの子宮角の半分。
  8. 解剖顕微鏡下卵管やブルサ、任意の脂肪組織から解放、周囲滑液包からそれぞれの卵巣を慎重に移動します。リーボビッツの L-15 メディアの新しい皿にそれぞれの卵巣を移動します。
  9. 軸それぞれの卵巣は半分にカットします。卵巣部分 (今呼ばれる植) agarose のめっきまで 37 ° C で保管をしてください。

3. 設定と共培養系の伊藤扱われるスライドをインキュベート

  1. 分割されていない共培養系
    1. 70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。
    2. インジウム酸化スズ (伊藤) の上に 8 もディバイダーを配置-扱われたスライド (図 1 a)。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。
    3. 15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適の場合は、このステップで、細胞懸濁液は 2 x (例えば、300 μ L、この段階での細胞密度の 50,000 セルの最終濃度は 150 μ L の 50,000 セル) の最終の密度が必要なを確認します。
    4. 細胞培養をメッキする前に追加卵巣植よく (図 1 b) の中心に。
    5. めっき前に個々 の 2 mL 管各細胞の培養にアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液 200 μ L、200 μ L 2 mL 管で液化 agarose を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞懸濁液を 800 μ l 添加し、800 μ L 2% の agarose の。いくつかの混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。
      1. すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。
    6. すぐに各ウェル (図 1) に細胞・ アガロース培養混合物の 300 μ L を追加します。図 1は、各メッキ卵巣と 3 つのセルの条件と 1 つのメディアの状態を示しています。
    7. 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。
  2. 分割共培養系。
    1. 薄く、滑らかなプラスチック (図 2 a) から仕切りをカットします。
      注: この実験は、平らで薄いので滅菌使い捨てメディア洗面器の側面を使用します。それらはちょうどよく (~ 13 mm) の斜辺にぴったり収まる幅をカットします。
    2. 70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。
    3. 伊藤治療スライド (図 2 b) の上に 8 も区切りを配置します。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。
    4. 15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適な場合、この段階で細胞懸濁液は必要に応じて最終密度 x 2 を確認してください (例えば 300 μ L で 50,000 セルの最終的な集中、この段階で細胞密度は、150 μ L の 50,000 のセル)。
    5. 井戸 (図 2) にプラスチックの仕切りを斜めに挿入します。
    6. めっき直前時に各セル中断の 1 つにアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液を 100 μ l 添加し、2 mL 管で液化 agarose の 100 μ L を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞培養の 400 μ L と 2% の agarose の 400 μ L。いくつかの細胞・ アガロース培養混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。
      1. すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。
    7. 分周器の 1 つの側面の細胞・ アガロース培養混合物の 150 μ L をプレートします。クールし (約 1 分) を固めるし、分周器 (図 2 D) を削除する agarose を許可します。
    8. 卵巣植を井戸の空の半分の中央に配置します。場所 150 μ L メディア ・ アガロース培養混合上卵巣とよく (図 2 e) の正しい側にのみ。
    9. 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。

4. スライドを乾燥と MALDI-TOF MS の準備

  1. 4 日後 (または任意の最寄りの時点) アガロース プラグとスライド (図 1) から商工会議所の区分線を削除します。平らなヘラで商工会議所から agarose の側面を注意深く取り外し、軽く引いてチャンバー、上向き移動任意のアガロース プラグに触らない。彼らが移動を行う場合そっと移動してようにして彼らが互いを触れていません。
  2. 約 4 時間、回転 90 ° 毎の h の 37 ° C のオーブンでスライドを配置します。
    注:スライドの回転は、サンプル全体をとおして均等な熱分布を確保することが重要です。
  3. 一度乾燥し、オーブン (図 1E) からスライドを削除します。
  4. 次のパラメーターで (図 1 階)、噴霧器を使用してマトリックス ソリューションを適用: 温度 30 ° C、流量を = = 0.2 mL/分、パス数 = 8、方向 = CC とノズルの距離 = 40 mm。
    注: マトリックス スプレーの代わりに芸術的なエアブラシは液体マトリックスを適用する使用できます。スプレー、同じマトリックス ソリューションを使用できますが、約倍のソリューションが必要です。それが垂直にハングアップするので、クランプのスライド、スライドをスプレー 90 ° の角度から離れておよそ 1 フィートから (ホフマン15から適合) 行列までレイヤーが表示されます。
  5. Calibrant の 1 μ L を追加 (ターゲットのリン赤 < 500 Da、ペプチドの混合物 (材料表参照) ターゲットの < 5,000 Da) スライド上の明確なスポットに。マトリックスと混合するリン赤は必要ありませんが、ペプチド混合物イオン化を支援するためにマトリックスとの 1:1 混合物が必要です。Calibrant 乾燥するを待ちます。
  6. X を描くスライドの各コーナーで永久的なマーカーを使用して、カメラまたはスキャナーを使用して、1,200 dpi の光学イメージを取る。

5. イメージング質量分析データ集録

  1. IMS データ解析ソフトウェアに新しいシーケンスを開く (材料の表を参照してください)。目的の空間解像度、少なくとも 50 μ m にラスターの幅を設定します。
  2. スライドの画像は、光を解析ソフトウェアにアップロードし、設定 3 の交差を使用してポイントを教える、X の各隅に描画します。
  3. 集録ソフトウェアの投射のための関心領域を指定し、それに応じて名前を付けます。
  4. データ集録ソフトウェアを使用して計測器を校正 (材料表参照) 5 ppm の誤差範囲内で。
  5. 最適化されたメソッドを保存し、実行を開始します。この実験は、次のパラメーターを最適化: 極性正、検出器を = = リフレクトロン、レーザーのサイズ = 2、レーザー出力 = 50%、反射モード検出器ゲイン = 3 x。

6. 処理 IMS データ

  1. 統計ソフトウェアにインポート *.mis ファイル (材料の表を参照してください) 重要性の分析のため。

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結果

フラット乾燥サンプルで最適な乾燥の伊藤スライドになりますアガロースとスライド (図 3) の空間的な分離を維持する agarose 部分の表面にしわを最小限に抑えています。図 3 aは、図 3 bは、避けるべきであるしわを示しています一方、最適な乾燥を示しています。この最適化は、相対湿度に基づく監視オーブンでスライドの正確な時間は異なることができます注意してください必要があります。しわ少し高さに影響を与えるが、IMS の質量精度の信号のため、わずかなしわは、データの品質を影響しません。したがって、最終的にはわずかなしわを持つアガロース MALDI-TOF MS 経由で分析できます。スライドを完全に乾燥する必要があります。 またはこれは MALDI-TOF 質量分析計の高真空中での試料の爆発を引き起こす可能性があります。

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ディスカッション

HGSOC12,17,18, ノルエピネフリンの役割を関係づける証拠の成長するボディがあるし、この手法は、多くの情報を貢献しています。同じスライド上に存在、少なくとも 8 生物学的条件、メソッドの実行する単一の IMS のメディア コントロールと同様、遺伝子および細胞の特異性など生物学的コントロールのアカウントことができます。メソッドの最適化を評価する HGSOC、任意のセルの主要な転移のモデルで小さな分子を交換やさまざまな生物学的質問と病気の状態を分析する agarose で配置することができます組織型を置き換えることができます。

プロトコルの最も重要な手順の 1 つはティッシュまたは細胞のタイプが互いに近くには、アガロース プラグの中心に存在を確保することです。もう一つの重要な考慮事項は、スライド全体の乾燥時間の最適化です。このメソッドは、簡単に乾燥する、スモール サイズが少し乾燥合併症の結果...

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開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

シカゴのコミュニティ信頼 (C-076) (L.M.S.); でサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供された資金イリノイ大学シカゴ スタートアップの資金 (L.M.S.);卵巣癌研究基金同盟 (医学博士); から 543296 を付与します。UG3 ES029073 (ジェブ) と進んで並進、国立衛生院、グラント UL1TR002003 を通じて (ジェブ ・ LMS) のための国立センター。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL ファルコンチューブデンビルC1017-O細胞を収集するには
8 ウェルチャンバー (Millipore EZ-slide chamber)MilliporePEZGS0816Millipore から再利用 Millicell EZ-スライドチャンバースライド
アセトニトリルSigma-Aldrich34998-4Lスプレーマトリックス用溶媒
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM)Fisher10-022-CV細胞培養培地
Autoflex speed MALDI-TOF LRFBrukerIMSデータ分析用
遠心分離機Eppendorf5810 R細胞を採取し、上清を除去する
CHCAマトリックスBruker ダルトニック8201344マトリックス 乾燥スライドにスプレー
DHB MatrixBruker Daltonic 8201346マトリックス スプレー乾燥スライドに
使い捨てメスフィッシャー22-079-707卵巣の除去用
解剖ハサミフィッシャー13-804-6卵巣の除去用
DMEM メディアGibco11995-065アガロース
表皮成長因子Peprotech Inc.100-15細胞培養培地サプリメント
エッペンドルフチューブジェネシーサイエンティフィック22-282アガロースアリコート用
エストラジオール-17&β;Simga-AldrichE2758細胞培養培地サプリメント
胎児ウシ血清デンビルfb5001細胞培養培地サプリメント
FlexControl 3.4ブルカーダルトニックIMSデータ収集ソフトウェア
FlexImaging 4.1ブルカーダルトニックIMSデータ分析ソフトウェア
鉗子(罰金)Fsiher22-327379の除去用卵巣
ゲンタマイシンセルグロ30-005-CR細胞培養培地サプリメント
インスリン、トランスフェリン、セレン(ITS)Sigma-Aldrich11074547001細胞培養培地サプリメント
ITOコーティングスライドブルカー8237001共培養インキュベーション用プラットフォーム
LeibovitzのL-15培地Gibco11415064組織中に使用される培地解剖
L-グルタミンGibco25030-081細胞培養培地サプリメント
低融点アガロースSigma-AldrichA9414-10Gめっき用培地と混合
培地洗面器Corning4870分割チャンバー用のプラスチック仕切りを切断するために使用
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122細胞培養培地サプリメント
ペプチド校正標準Bruker Daltonic8206195中質量範囲用キャリブラント
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5G低質量範囲用キャリブラント
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS データ統計分析
外科用鉗子 (鈍い)Fisher08-875-8B卵巣の除去用
TFAFisher技術A116-50マトリックスソリューションに追加
TM噴霧器HTXテクノロジーマトリックス適用用
と混合されたメディア

参考文献

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MALDI TOF MS

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