Method Article

組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

DOI:

10.3791/59490

⸱

April 3rd, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

In This Article

Summary

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試料調製法は、イメージング質量分析法による低分子交換を検出する細胞・組織の培養を対応するために開発されました。

Abstract

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イメージング質量分析 (IMS) が 3 種類の試料に日常的に適用されています: 微生物コロニー、回転楕円体、ティッシュ セクション。これらのサンプルのタイプは興味の生物的サンプルの蛋白質、脂質、および代謝物質の分布を可視化するマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) を使って解析しました。エコイノベーション アプローチでアガロースに哺乳類の細胞培養を播くことによって、がんの化学交信を識別するために対処するため 3 つの以前のアプリケーションの長所を組み合わせて、新規サンプル調製法を開発しました。サンプルの乾燥が続く健康な組織培養します。哺乳類の組織や細胞は、組織と細胞の拡散を介して化学通信を許可する近接遊走が。特定の時点でアガロース ベースのサンプル、微生物コロニー IMS 分析の準備と同じ方法で乾燥させます。それは転移中に操作すると、卵巣に卵管から派生したハイグレード漿液性卵巣癌間の通信をモデル化する手法が開発されました。サンプル調製の最適化は、卵巣の微小環境の主要成分としてノルエピネフリンの特定につながった。新たに開発したこのメソッドは、隣接する細胞や組織間の化学コミュニケーションの理解を必要とする他の生物学的システムに適用できます。

Introduction

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3 つの広く使われているアプリケーションの分子機能の空間分布を特徴付けるために最適化されているイメージング質量分析 (IMS): 組織スライス、回転楕円体、および微生物コロニー1,2,3。切片は、ホスト、ターゲットまたは関連性の低い特定の質量範囲内で生物学的条件のコンテキストにおける代謝物の局在の評価に使用できます。ただし、分子の機能の違いは最も重要かつ明らかな病的状態、たとえば、腫瘍に比較すると健康な組織。この IMS アプローチは特に疾患バイオ マーカーの検出、ただしの開始のために重要なことができる信号の識別ができなくなります (腫瘍グレード) などの病気の進行の各ステージで組織サンプルを取得、病気。空間を介して情報の交換は多くの生物学的システム、ユビキタス機能と組織スライスは、このダイナミックな化学リレーをキャプチャできません。化学交換と拡散を可視化することができる 1 つの方法は寒天プレート上に成長した微生物のコロニーの IMS小さな分子は寒天とを通じて拡散することができる、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI TOF) 質量分析法4経由で取り込むことができます。この成長のセットアップは、離散生物学的実体 (植民地) 間で交換される分子を識別するために使用することができ、代謝産....

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Protocol

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すべての動物の手続きケアと実験動物の使用のための国民の健康ガイドライン機関に従って、イリノイ大学シカゴ校制度上の動物の使用とケア (IACUC) 委員会によって承認されました。

1. 試薬の調製

  1. マウス卵管上皮 (萌) 細胞 10% 牛胎児血清を添加したアルファ最小必須培地 (アルファ MEM) メディアで加湿のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° c (FBS)、2 mM L-グルタミン、10 mg/mL インスリン、トランスフェリン、セレン (ITS) を維持します。、1.8 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mg/mL ゲンタマイシン 18.2 ng/mL エストラジ オール-17 β。セルごとに 3-4 日を渡すと、同じ日に十分なセルがあることを確認、マウスが犠牲に。
  2. 2% の agarose を準備するには、低融点アガロースの 1 g を 50 mL の蒸留水を混合します。クールに、オートクレーブ、アガロースを許可して、因数 (1 mL) 2 ml 管 (材料表参照) agarose が固化する前に。アガロースは、-20 ° C で無期限に格納できます。
  3. 1 x ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) メディアの少なくとも 2 mL を準備します。
  4. MALDI-....

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Results

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フラット乾燥サンプルで最適な乾燥の伊藤スライドになりますアガロースとスライド (図 3) の空間的な分離を維持する agarose 部分の表面にしわを最小限に抑えています。図 3 aは、図 3 bは、避けるべきであるしわを示しています一方、最適な乾燥を示しています。この最適化は、相対湿度に基づく監視オーブンでスライドの正確な時間は異なることができます注意してください必要があります。しわ少し高さに影響を与えるが、IMS の質量精度の信号のため、わずかなしわは、データの品質を影響しません。したがって、最終的にはわずかなしわを持つアガロース MALDI-TOF MS 経由で分析できます。スライドを完全に乾燥する必要があります。 またはこれは MALDI-TOF 質量分析計の高真空中での試料の爆発を引き起こす可能性があります。

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Discussion

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HGSOC12,17,18, ノルエピネフリンの役割を関係づける証拠の成長するボディがあるし、この手法は、多くの情報を貢献しています。同じスライド上に存在、少なくとも 8 生物学的条件、メソッドの実行する単一の IMS のメディア コントロールと同様、遺伝子および細胞の特異性など生物学的コントロールのアカウントことができます。メソッドの最適化を評価する HGSOC、任意のセルの主要な転移のモデルで小さな分子を交換やさまざまな生物学的質問と病気の状態を分析する agarose で配置することができます組織型を置き換えることができます。

プロトコルの最も重要な手順の 1 つはティッシュまたは細胞のタイプが互いに近くには、アガロース プラグの中心に存在を確保することです。もう一つの重要な考慮事項は、スライド全体の乾燥時間の最適化です。このメソッドは、簡単に乾燥する、スモール サイズが少し乾燥合併症の結果.......

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Disclosures

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著者がある何も開示するには

Acknowledgements

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シカゴのコミュニティ信頼 (C-076) (L.M.S.); でサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供された資金イリノイ大学シカゴ スタートアップの資金 (L.M.S.);卵巣癌研究基金同盟 (医学博士); から 543296 を付与します。UG3 ES029073 (ジェブ) と進んで並進、国立衛生院、グラント UL1TR002003 を通じて (ジェブ ・ LMS) のための国立センター。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL ファルコンチューブデンビルC1017-O細胞を収集するには
8 ウェルチャンバー (Millipore EZ-slide chamber)MilliporePEZGS0816Millipore から再利用 Millicell EZ-スライドチャンバースライド
アセトニトリルSigma-Aldrich34998-4Lスプレーマトリックス用溶媒
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM)Fisher10-022-CV細胞培養培地
Autoflex speed MALDI-TOF LRFBrukerIMSデータ分析用
遠心分離機Eppendorf5810 R細胞を採取し、上清を除去する
CHCAマトリックスBruker ダルトニック8201344マトリックス 乾燥スライドにスプレー
DHB MatrixBruker Daltonic 8201346マトリックス スプレー乾燥スライドに
使い捨てメスフィッシャー22-079-707卵巣の除去用
解剖ハサミフィッシャー13-804-6卵巣の除去用
DMEM メディアGibco11995-065アガロース
表皮成長因子Peprotech Inc.100-15細胞培養培地サプリメント
エッペンドルフチューブジェネシーサイエンティフィック22-282アガロースアリコート用
エストラジオール-17&β;Simga-AldrichE2758細胞培養培地サプリメント
胎児ウシ血清デンビルfb5001細胞培養培地サプリメント
FlexControl 3.4ブルカーダルトニックIMSデータ収集ソフトウェア
FlexImaging 4.1ブルカーダルトニックIMSデータ分析ソフトウェア
鉗子(罰金)Fsiher22-327379の除去用卵巣
ゲンタマイシンセルグロ30-005-CR細胞培養培地サプリメント
インスリン、トランスフェリン、セレン(ITS)Sigma-Aldrich11074547001細胞培養培地サプリメント
ITOコーティングスライドブルカー8237001共培養インキュベーション用プラットフォーム
LeibovitzのL-15培地Gibco11415064組織中に使用される培地解剖
L-グルタミンGibco25030-081細胞培養培地サプリメント
低融点アガロースSigma-AldrichA9414-10Gめっき用培地と混合
培地洗面器Corning4870分割チャンバー用のプラスチック仕切りを切断するために使用
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122細胞培養培地サプリメント
ペプチド校正標準Bruker Daltonic8206195中質量範囲用キャリブラント
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5G低質量範囲用キャリブラント
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS データ統計分析
外科用鉗子 (鈍い)Fisher08-875-8B卵巣の除去用
TFAFisher技術A116-50マトリックスソリューションに追加
TM噴霧器HTXテクノロジーマトリックス適用用
と混合されたメディア

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

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Imaging Mass SpectrometryMALDI TOF MSSmall Molecule CommunicationOvarian Cancer MetastasisAgarose CocultureTissue Cell CocultureSample Preparation MethodDesiccation ProcessSpatial IntegrityLabel Free Analysis

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