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方法論記事

マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価

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DOI:

10.3791/59496

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2019年6月12日

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

ブラシ細胞は、ナイーブマウス気管に見られる稀なコリン作動性化学感覚上皮細胞である。その限られた数のために、気道免疫および改造におけるその機能的役割のex vivo評価は困難である。フローサイトメトリーによる気管ブラシ細胞の単離方法について述べた。

要約

気管ブラシ細胞は、気道内腔から免疫系および神経系に信号を伝達する準備ができているコリン作動性化学感覚上皮細胞である。それらは、腸粘膜のタフト細胞、気管のブラシ細胞、鼻粘膜の孤独な化学感覚および微小絨毛細胞を含む化学感覚上皮細胞のファミリーの一部である。異なる上皮区画の化学感覚細胞は、主要な細胞内マーカーとコア転写部特質を共有するが、局所組織環境を反映する可能性が高い重要な転写不均一性も示す。単一細胞懸濁液からの気管ブラシ細胞の単離は、これらのまれな上皮細胞の機能を詳細に定義する必要があるが、それらの分離は、気管ブラシ細胞と神経終末との間の密接な相互作用のために、潜在的に困難である。またはタイトで接着接点の気道固有の組成物に起因する。ここでは、マウス気管上皮からブラシ細胞を単離する手順について説明する。この方法は、管下上皮の初期分離に基づいており、パパインを用いて上皮シートのその後の短いインキュベーションを可能にする。この手順は、生存可能な気管ブラシ細胞のフローサイトメトリックソートおよび機能解析のための迅速かつ便利なソリューションを提供します。

概要

ブラシ細胞は、苦味受容体および味覚芽細胞に見られる味覚受容体伝達機構の発現を特徴とする化学感覚上皮細胞のクラスに属する。味覚芽細胞とは異なり、化学感覚上皮細胞は上皮表面に散乱し、鼻上皮1、2、気管内のブラシ細胞中の孤独な化学感覚細胞(SCC)および微小絨毛細胞と呼ばれる。腸内の3、4、およびタフト細胞5、6.苦味受容体および苦味伝達機構を発現する上皮細胞は、尿道7、8および聴覚管9にも見出される。気道ブラシ細胞は、神経原性および免疫気道応答にユニークな機能を有する。彼らは、苦い化合物とクォーラム感知物質のような細菌代謝物で活性化時に保護呼吸反射を呼び起こすアセチルコリン産生化学感覚細胞です 10.気道ブラシ細胞はまた、気道3のエアロアレルゲン引き出された2型炎症を調節するIL-25の支配的な気道上皮源である。

下部気道ブラシ細胞の完全な転写物の特徴付けおよび環境刺激への応答は、気管上皮の低い数および大きな気管支10を超える非常に限られた数によって制限されている。腸上皮からの化学感覚細胞の単離に使用される技術は、おそらく神経終末10または他の気管ブラシ細胞の親密な接触のために、気管から比例して高い数を得ていない付着物およびタイトジャンクションタンパク質の組成のような呼吸粘膜における組織特異的因子。単一細胞RNAシーケンシング分析のためのより高い数で気管ブラシ細胞の分離に成功した最近の報告は、パパインとの2時間インキュベーションまたはプロナス11、12との18時間インキュベーションのいずれかを採用した。消化酵素を用いたより長いインキュベーションは細胞の生存率を低下させ、消化された組織13からの細胞の転写プロファイルを変化させることができるので、これは他の化学感覚上皮集団との比較分析に偏りを与える可能性がある。

ここでは、RNAシーケンシング3に対する気管ブラシ細胞の単離方法を報告する。高用量ジスパーゼによる気管の治療は、上皮を粘膜下から分離する。パパインとの上皮シートのその後の消化は、この構造細胞の優れた回復を可能にする。

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プロトコル

以下の実験を行う前に、すべての動物ケアの使用とプロトコルが機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国家研究評議会の「ケアと使用に関するガイド」に従って実施されることを確認してください。実験動物」( 第8版、2011年)とARRIVEガイドライン。以下に説明するすべての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物ケア・使用委員会によって審査され、承認されています。

1. 試薬の調製

  1. 16 Μ/mLディスパーゼと20 μg/mL DNase I.を含むPBS溶液であるジスパーゼ消化液を調べ、37°Cの水浴で溶液を温める前に、ディスパーゼ粉末が完全に溶解していることを確認してください。
  2. 5%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)をダルベッコ改変イーグルミディアム(DMEM)に加えて停止液を作ります。
  3. タイロードIバッファーを準備する:カルシウムなしでHEPES-Tyrodeのバッファーに26 U/mLパパイン(48 U/mgパパイン溶液の20 μL/mL)と10 μL/mL L-システインを追加します。
  4. タイロードIIバッファーを準備する:カルシウムを含むHEPES-Tyrodeのバッファーに2 μL/mLルペプチン(5mg/mL)を追加します。
  5. FACSバッファーを準備する:カルシウム、マグネシウム&フェノールレッドを含まないハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を使用し、2mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)を補充し、2%FBSを追加します。

2. マウス気管の解剖

注:このプロトコルで使用されるマウスは、ChAT(BAC)-eGFP(B6)である。Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J、男女ともに生後3~6ヶ月。eGFPの光漂白を減らすために直接光への組織の露出を最小にする。

  1. 100 mg/kg のペントバルビタール安楽死溶液を経内に注入するか、IACUC によって承認された標準プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。
  2. 上下の四肢を拡張した21G針で、外科用ボード上のマウスを固定します。70%のEtOHで毛皮をスプレーし、地域を消毒します。
  3. まっすぐな鉗子を使用して、腹部の皮膚と毛皮を持ち上げ、解剖はさみで中央に切開を行います(まっすぐなはさみ、3センチメートル)。はさみを使用して、皮下組織から腹部からマンディブラに皮膚を分離する。皮下組織を鉗子で持ち上げながら、腹壁の中央にはさみで小さな切開を行う。
  4. V字型切開で下膜を開きます。鉗子を使用して、小腸を横にそっと動かし、腹部大動脈と静脈カバを見つけ、解剖はさみで切開を行い、急速な排泄を可能にする。
  5. ダイヤフラムを見つけます。18Gの針を使用して、肺を脱脂するために胸骨のすぐ下の横隔膜に開口部を作る。鋭い尖ったまっすぐな解剖はさみを使用して肋骨のケージから慎重にダイヤフラムを分離し、リブの基部に沿って切断します。
  6. 鉗子を使用して、胸骨の露出した端を持ち上げ、胸骨を肋骨ケージの基部から首まで縦方向に切ります。短いまっすぐなはさみ(2 cm)で中央頸部切開を行い、顎下腺の2つの葉を分離する。
  7. 周囲の結合組織と胸腺を慎重に取り除き、高精度鉗子のペアでカリーナを覆います。
  8. 気管を最初に喉頭蓋のレベルで分離し、次に気管の分岐のレベルで遠位端を解剖することによって、気管を自由に解剖する。
  9. 喉頭蓋を見つけ、気管を喉頭蓋からカリーナまで縦方向に切る。

3. 気管上皮消化

  1. 気管を予温めた750 μL(37°C)の消化液を含む1.5mLチューブに入れます。200rpmでシェーカーで40分間、室温でインキュベートします。直接光への露出を減らすためにアルミ箔でチューブをカバーします。
  2. 反応を止めるために5%FBSで750 μLの冷たいDMEMを加えます。氷の上に置け
  3. 気管をペトリ皿(100mm x 15mm)に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。上皮側を上向きにして気管の向きをします。縦方向に解剖された気管は、軟骨リングによって維持される半円筒形を有する。上皮は凹面にある。
  4. ペトリ皿にまっすぐな鉗子と気管の喉頭蓋領域をテザーし、サイズ22使い捨てメスを使用して、気管から上皮を掻き取る。上皮層は半透明シートとして分離する。
  5. メスで上皮をミンチします。上皮層を2mLチューブに移します。
  6. 750 μLのタイロデIバッファーでペトリ皿をすすいで、上皮層を含む2mLチューブに移します。
  7. タイロードIの気管上皮層を200rpmでシェーカーで37°Cで30分間緩衝する。直接光への露出を減らすためにアルミ箔でチューブをカバーします。
  8. コールドタイロデIIバッファの750 μLを追加します。消化された組織を20~30秒間激しく渦にし、18G針に10回取り付けた注射器で同質をトリビュートする。 21 Gゲージ針に切り替え、さらに10~20回トリビュートします。
  9. 100 μm のストレーナーを通して 50 mL 円錐管にセルをろ過します。コールド FACS バッファーの 30:1 vol/vol を追加します。
  10. 350 x gで4°Cで10分間スピンし、上清を廃棄します。冷たいFACSバッファーでペレットを再懸濁し、12 mm x 75 mm (5 mL) ポリスチレンチューブにサスペンションを移します。4°Cで10分間350 x gで再び回転し、上清を廃棄します。
  11. FACSバッファーの100 μLでペレットを再中断します。
  12. 抗マウスCD16/32ブロッキング抗体を1μL添加して非特異的結合を遮断し、氷上で15分間インキュベートします。洗わなく。
  13. 次の抗体とそれぞれのアイソタイプコントロールを追加: 太平洋青色の抗マウス CD45 またはラット IgG2a, k (0.25 μg/106細胞 100 μL 容積) とアロフィコシアニン (APC) 抗マウス EpCAM またはラット IgG2b, k (0.5 μg/106細胞 100 μL ボリューム)モノクローナル抗体。直接光から保護された氷の上で45分間インキュベートします。冷たいFACSバッファーの4.5 mLを追加し、4°Cで10分間350 x gで混合し、スピンします。FACSバッファを破棄し、低温FACSバッファの300 μLでペレットを再中断します。
  14. フローサイトメトリックソートの直前にヨウ化プロピジウム(PI)(5 μg/mL)を加えます。
    注:ブラシセルは、フィルタへの付着性を高める可能性のあるいくつかのプロセスを持つ不規則な形状を持っています (図 3C)。私たちは、30ミリメートル70ミリメートルと100ミリメートルフィルタを比較し、より大きな細孔フィルタは、より良い収率を確保することを発見しました。また、パパイン消化後の細胞懸濁液の完全なトリチュレーションは、ブラシ細胞収率を有意に向上させる。初期トリチュレーションには18G針を使用し、その後、細胞の細かい解離のために小さなボア(21または23Gの針)を使用することをお勧めします。

4. フローサイトメトリーゲーティング戦略

  1. 前方および側面散乱角度によって破片から細胞を識別します。前方散布の高さと幅、側面散布の高さと幅を使用して、二重線を除外します。doublet は、幅の高い値を持つセルです。
  2. 単一のセル内で、PI 陰性の母集団として生細胞を識別します。
  3. 生きている単一細胞内で、アイソタイプコントロールに基づいて低から負の細胞にCD45を同定する。
  4. CD45の低/負の細胞内で、eGFP陽性であるEpCAM陽性細胞を同定する(FITCチャネル内)。これはブラシセルの集団です(図2A)。

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結果

この手順は、RNA シーケンシング3の気管ブラシ 細胞を分離するために正常に実装されています。2段階プロトコル(図1)で気管を単離し、組織を消化した後、細胞を収集し、PIで死んだ細胞を排除した後に蛍光標識CD45およびEpCAMで染色した。前方および側面散乱特性に基づいて二重化を行った後、ブラシセルをCD45の場合は低/負、EpCAMでは正、eGFPでは陽性(図2A)と定義した。ブラシ細胞は、流量細胞メトリーによりCD45低/ネグ細胞の約0.16〜0.42%を表し、気管当たり250〜600細胞を占めた(図2B)。これらのカウントを、ChAT(BAC)-eGFPマウスからの気管マウント全体におけるChAT-eGFP陽性細胞数の推定値と比較し、我々が公表した気管ブラシ細胞3の広範な免疫組織学的評価

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ディスカッション

我々は、40分間の高用量ジスパーゼ治療の組み合わせと短いパパイン治療(30分)が気管消化およびブラシ細胞分離に最適なプロトコルを提供することを見出した。この組み合わせは、広範な消化を回避し、代替プロトコルと比較して、ブラシ細胞の最高収率を生成します。

血行細胞を抽出する肺消化は、古典的にコラゲナーゼIV15のような軽度の消化酵素に依存しているが、上皮細胞の単離には、より複雑なプロトコルが必要である。上皮細胞の単一細胞懸濁液は、互いに結合する接合部と地下膜、および細胞自体の脆弱さのために達成することがより困難です。上皮細胞消化のためのほとんどのプロトコルは、2つのステップを伴う - 最初のステップは、地下膜から上皮を分離し、その後のステップは、上皮細胞を互いに付着させるタイトなジャンクションとデスモソームを妨害する後のステップです。16歳,17.

いくつかのグループ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

ブリガムと女性の人間免疫学センターフローコアのアダム・チコインに感謝します。この研究は、国立衛生補助金研究所R01 HL120952(N.A.B.)、R01 AI134989(N.A.B)、U19 AI095219(N.A.B.、 L.G.B)、K08 AI132723(L.G.B)、および米国アレルギー・喘息・免疫学アカデミー(AAAAI)/アメリカ肺アレルギー呼吸器疾患賞(N.A.B.)、AAAAI財団教員育成賞(L.G.B.)、スティーブン・アンド・ジュディ・ケイ・ヤング・イノベーター賞(N.A.B.)、ジョイスリン・C・オースティン女性医師のキャリア開発基金(L.G.B.)、およびヴィニク家(L.G.B.)による寛大な寄付。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗体
抗GFP(ポリクローナルヤギIg)アブカムキャット#ab5450
APC抗マウスCD326(EpCAM) (G8.8)バイオレジェンドネコ#118214
APC ラット IgG2a, k アイソタイプコントロールバイオレジェンドネコ#400511
DAPIバイオレジェンドネコ#422801
ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probesネコ#A-11055
正常ヤギ IgGR&D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype controlBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) AntibodyBiolegendcat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
DispaseGibcoの猫#17105041 
DNase ISigma cat# 10104159001
HEPES-Tyrode'カルシウムを含まないバッファー(10 mM HEPES、135 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM MgCl2、12 mM NaHCO3、0.4 mM NaH2PO4、0.25% BSA、5.5 mM グルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22µでろ過します。mフィルターボストンバイオプロダクツcat# PY-912
Tyrode's溶液(HEPES緩衝)140 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM HEPES、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2および10 mMグルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22µでろ過します。mフィルター。)Boston BioProductscat# BSS-355
L-CysteineSigmacat# C7352
ロイペプチン トリフルオロ酢酸塩Sigmacat# L2023
パパイン産 ラテックスSigmacat# P3125
ヨウ化プロピジウム シグマcat# P4170
実験モデル: 生物/菌株
ChATBAC-eGFP (B6.CG-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)ジャクソン研究所7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system  ツァイス アクシオ オブザーバー Z1 倒立顕微鏡ツァイス
LSRFortessaBD647465
<ストロング>ディスポーザブル 機器
1.5 mL 滅菌チューブトーマス サイエンティフィック1157C86
5 mL ポイステレン丸底チューブ、12 mm x 75 mm スタイルファルコン14-959-1A
50 mLポリプロピレン円錐管、30 mm x 115 mmスタイルファルコン352098
フェザー使い捨てメス no.12フィッシャーサイエンティフィックNC9999403
ペトリ皿、100 mm x 15 mmスタイルファルコン351029
滅菌細胞ストレーナー、100 μmフィッシャーブランドキャット#22363549

参考文献

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