マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価

Summary

ブラシ細胞は、ナイーブマウス気管に見られる稀なコリン作動性化学感覚上皮細胞である。その限られた数のために、気道免疫および改造におけるその機能的役割のex vivo評価は困難である。フローサイトメトリーによる気管ブラシ細胞の単離方法について述べた。

Abstract

気管ブラシ細胞は、気道内腔から免疫系および神経系に信号を伝達する準備ができているコリン作動性化学感覚上皮細胞である。それらは、腸粘膜のタフト細胞、気管のブラシ細胞、鼻粘膜の孤独な化学感覚および微小絨毛細胞を含む化学感覚上皮細胞のファミリーの一部である。異なる上皮区画の化学感覚細胞は、主要な細胞内マーカーとコア転写部特質を共有するが、局所組織環境を反映する可能性が高い重要な転写不均一性も示す。単一細胞懸濁液からの気管ブラシ細胞の単離は、これらのまれな上皮細胞の機能を詳細に定義する必要があるが、それらの分離は、気管ブラシ細胞と神経終末との間の密接な相互作用のために、潜在的に困難である。またはタイトで接着接点の気道固有の組成物に起因する。ここでは、マウス気管上皮からブラシ細胞を単離する手順について説明する。この方法は、管下上皮の初期分離に基づいており、パパインを用いて上皮シートのその後の短いインキュベーションを可能にする。この手順は、生存可能な気管ブラシ細胞のフローサイトメトリックソートおよび機能解析のための迅速かつ便利なソリューションを提供します。

Introduction

ブラシ細胞は、苦味受容体および味覚芽細胞に見られる味覚受容体伝達機構の発現を特徴とする化学感覚上皮細胞のクラスに属する。味覚芽細胞とは異なり、化学感覚上皮細胞は上皮表面に散乱し、鼻上皮1、2、気管^{内のブラシ細胞中の孤独な化学感覚細胞(SCC)および微小絨毛細胞と呼ばれる。腸内}の3、4、およびタフト細胞5、6.苦味受容体および苦味伝達機構を発現する上皮細胞は、尿道7、8^および聴覚管9にも見出される。気道ブラシ細胞は、神経原性および免疫気道応答にユニークな機能を有する。彼らは、苦い化合物とクォーラム感知物質のような細菌代謝物で活性化時に保護呼吸反射を呼び起こすアセチルコリン産生化学感覚細胞^{です 10.}気道ブラシ細胞はまた、気^道3のエアロアレルゲン引き出された2型炎症を調節するIL-25の支配的な気道上皮源である。

Protocol

以下の実験を行う前に、すべての動物ケアの使用とプロトコルが機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国家研究評議会の「ケアと使用に関するガイド」に従って実施されることを確認してください。実験動物」( 第8版、2011年)とARRIVEガイドライン。以下に説明するすべての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物ケア・使用委員会によって審査され、承認されています。

1. 試薬の調製

1. 16 Μ/mLディスパーゼと20 μg/mL DNase I.を含むPBS溶液であるジスパーゼ消化液を調べ、37°Cの水浴で溶液を温める前に、ディスパーゼ粉末が完全に溶解していることを確認してください。
2. 5%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)をダルベッコ改変イーグルミディアム(DMEM)に加えて停止液を作ります。
3. タイロードIバッファーを準備する:カルシウムなしでHEPES-Tyrodeのバッファーに26 U/mLパパイン(48 U/mgパパイン溶液の20 μL/mL)と10 μL/mL L-システインを追加します。
4. タイロードIIバッファーを準備する:カルシウムを含むHEPES-Tyrodeのバッファーに2 μL/mLルペプチン(5mg/mL)を追加します。
5. FACSバッファーを準備する:カルシウム、マグネシウム&フェノー....

Results

この手順は、RNA シーケンシング³の気管ブラシ 細胞を分離するために正常に実装されています。2段階プロトコル(図1)で気管を単離し、組織を消化した後、細胞を収集し、PIで死んだ細胞を排除した後に蛍光標識CD45およびEpCAMで染色した。前方および側面散乱特性に基づいて二重化を行った後、ブラシセルをCD45の場合は低/負、EpCAMでは正、eGFPでは陽性(図2A)と定義した。ブラシ細胞は、流量細胞メトリーによりCD45^低/ネグ細胞の約0.16〜0.42%を表し、気管当たり250〜600細胞を占めた(図2B)。これらのカウントを、ChAT(BAC)-eGFPマウスからの気管マウント全体におけるChAT-eGFP陽性細胞数の推定値と比較し、我々が公表した気管ブラシ細胞3の広範な免疫組織学的評価

Discussion

我々は、40分間の高用量ジスパーゼ治療の組み合わせと短いパパイン治療(30分)が気管消化およびブラシ細胞分離に最適なプロトコルを提供することを見出した。この組み合わせは、広範な消化を回避し、代替プロトコルと比較して、ブラシ細胞の最高収率を生成します。

血行細胞を抽出する肺消化は、古典的にコラゲナーゼIV¹⁵のような軽度の消化酵素に依存しているが、上皮細胞の単離には、より複雑なプロトコルが必要である。上皮細胞の単一細胞懸濁液は、互いに結合する接合部と地下膜、および細胞自体の脆弱さのために達成することがより困難です。上皮細胞消化のためのほとんどのプロトコルは、2つのステップを伴う - 最初のステップは、地下膜から上皮を分離し、その後のステップは、上皮細胞を互いに付着させるタイトなジャンクションとデスモソームを妨害する後のステップです。^16歳,17.

いくつかのグループ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗体
抗GFP(ポリクローナルヤギIg)	アブカム	キャット#ab5450
APC抗マウスCD326(EpCAM) (G8.8)	バイオレジェンド	ネコ#118214
APC ラット IgG2a, k アイソタイプコントロール	バイオレジェンド	ネコ#400511
DAPI	バイオレジェンド	ネコ#422801
ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molecular Probes	ネコ#A-11055
正常ヤギ IgG	R&D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase	Gibco	の猫#17105041
DNase I	Sigma	cat# 10104159001
HEPES-Tyrode'カルシウムを含まないバッファー(10 mM HEPES、135 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM MgCl2、12 mM NaHCO3、0.4 mM NaH2PO4、0.25% BSA、5.5 mM グルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22µでろ過します。mフィルター	ボストンバイオプロダクツ	cat# PY-912
Tyrode's溶液(HEPES緩衝)140 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM HEPES、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2および10 mMグルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22µでろ過します。mフィルター。)	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-Cysteine	Sigma	cat# C7352
ロイペプチン トリフルオロ酢酸塩	Sigma	cat# L2023
パパイン産 ラテックス	Sigma	cat# P3125
ヨウ化プロピジウム	シグマ	cat# P4170
実験モデル: 生物/菌株
ChATBAC-eGFP (B6.CG-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	ジャクソン研究所	7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system  ツァイス アクシオ オブザーバー Z1 倒立顕微鏡	ツァイス
LSRFortessa	BD	647465
<ストロング>ディスポーザブル 機器
1.5 mL 滅菌チューブ	トーマス サイエンティフィック	1157C86
5 mL ポイステレン丸底チューブ、12 mm x 75 mm スタイル	ファルコン	14-959-1A
50 mLポリプロピレン円錐管、30 mm x 115 mmスタイル	ファルコン	352098
フェザー使い捨てメス no.12	フィッシャーサイエンティフィック	NC9999403
ペトリ皿、100 mm x 15 mmスタイル	ファルコン	351029
滅菌細胞ストレーナー、100 μm	フィッシャーブランド	キャット#22363549