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方法論記事

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

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DOI:

10.3791/59497

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2019年5月13日

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

この記事について

サマリー

ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol II伸長複合体に関連する転写物の共転写処理の基礎となるメカニズムを研究するのに有用である。

要約

真核生物mRNA合成は、成熟したmRNAを形成する前駆体RNAの多サブユニット酵素RNAポリメラーゼIIおよび共写物キャッピングおよびスプライシングにより前駆体RNAへのDNAテンプレートの転写を必要とする複雑な生化学的プロセスである。mRNA合成中、RNAポリメラーゼII伸長複合体は、その触媒活性を制御する転写因子の大規模なコレクション、ならびに成熟したmRNAを作成するキャッピング、スプライシング、および3'処理酵素による調節の標的である。mRNA合成の本質的な複雑さのために、その様々な共転写段階の単離および調査を可能にするより単純な実験システムは大きな有用性を持っている。

本稿では,同写物RNAキャッピングの研究に適したそのような単純な実験システムについて述べた.このシステムは、精製されたポリメラーゼおよび人工転写気から組み立てられた定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体に依存する。ビオチン化DNAを介して固定化すると、これらのRNAポリメラーゼII伸長複合体は、同転写RNAキャッピングと、伸び複合体がカッピング酵素を募集し、調節するメカニズムを解剖するための容易に可動化可能なツールを提供します。共写RNAキャッピング。このシステムは、RNAポリメラーゼII伸長複合体に結合されたmRNA成熟の他の段階における役割を有するタンパク質またはタンパク質複合体の募集および/または組み立てを研究するために適応できると期待される。

概要

真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。

当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。

活性Pol II伸長複合体を再構成するためのそのようなより簡単な方法の1つは、細長いPol IIの構造および生化学的研究に有用であることが証明されており、さらに最近では、共転写RNA処理2、3を研究するために有用である。 、4、5.本稿では、精製されたPol IIと合成転写気泡から調製されたPol II伸長複合体を効果的に使用して、新生Pol II転写物の共転写キャッピングのメカニズムを調べることができる方法を示す。

キャッピングとは、5'-グアノシン「キャップ」を、生まれつきのPol II転写物の5'-三リン酸末端に共生添加することをいう。キャップは、mRNAの成熟、輸送、翻訳、およびその他のプロセス6、7の後続のステップで重要です。キャップは、キャッピング酵素と呼ばれる酵素によってPol II転写物に共写物を添加する。哺乳動物細胞において、キャッピング酵素のRNA 5'-三ホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を担う活性部位は、単一のポリペプチド8内に含まれる。キャッピング酵素は、そのヘプタペプチドのSer5上でリン酸化されたPol II体およびRpb1カルボキシ末端ドメイン(CTD)上の未定義の表面との相互作用を通じてPol II伸長複合体に募集される5。伸長複合体では、キャッピング酵素は、生まれつき転写物が少なくとも18ヌクレオチドの長さに達し、ポリメラーゼRNA出口チャネルから出現した後、5'-グアノシンキャップの添加を触媒する。キャッピング反応の最初のステップでは、三ホスファターゼはRNA 5'-三リン酸を加水分解し、5'--二リン酸を得る。第2工程では、GTPをグアニチルトランスフェラーゼによってGMPに加水分解し、GMPキャッピング酵素中間体を形成する。最後に、グアニュリルトランスフェラーゼは、GMPを生まれつき転写物の5'-二リン酸末端に移し、キャップを産生する。

キャッピング反応の顕著な特徴は、同写物キャッピング(すなわち、機能的Pol II伸長複合体に関連する転写物のキャッピング)が遊びRNA5,9のキャッピングよりもはるかに効率的である。したがって、この分野の大きな問題は、キャッピングのこの劇的な活性化がPol II伸長複合体とのキャッピング酵素の相互作用によってどのように達成されるのかである。このプロトコルでは、精製されたRNAポリメラーゼIIおよび人工転写気泡のみを用いた活性RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの方法は、定義された長さと配列の転写物を有するRNAポリメラーゼII伸長複合体の作成を可能にする。最近の研究では、これらの定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体をRNAキャッピング5のメカニズムの側面を調査するためのモデルとして使用した。特に、これらの伸長複合体に関連するRNAのキャッピングは、遊値RNAのキャッピングよりも100倍以上効率的であり、(ii)はPol II CTDのTFIIH依存性リン酸化によって刺激されたことを示した。ここで説明するアプローチは、原則として、Pol II伸長複合体にリンクされた他の共転写RNA処理反応を研究するための基板を生成するように適合させることができる。

このプロトコルのセクション1では、人工伸び複合体は、合成テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを、テンプレート鎖DNAの約9ヌクレオチドに対してその3'末端で相補的であるRNAオリゴヌクレオチドにアニールすることによって作成される。次に、Pol II が DNA:RNA 二重鎖にロードされます。伸長複合体は、その3'末端でビオチンで標識された部分的に相補的な非テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを添加することによって完了する(図1および図2A)。RNAオリゴヌクレオチドは、これらの伸長複合体におけるPol IIによって拡張され、放射性標識ヌクレオチドの適切な組み合わせの添加時に定義された長さと配列の放射標識転写物を作る。さらに、未組み込みのヌクレオチドを除去するワッシュの組み合わせを使用して、ヌクレオチドの異なる組み合わせをさらに添加し、1つは、DNAテンプレートに沿って異なる位置にPol IIを「歩く」と定義された長さのRNAを合成することができます。RNAは次いで精製され、尿素-PAGEゲルを脱ナーチジンで電気泳動を受ける。プロトコルのセクション2では、人工伸長複合体が共転写RNAキャッピングを分析するために使用される。提示された例は、共転写RNAキャッピングに対するPol II CTDのTFIIH依存リン酸化の効果を測定する。本実験では、キャッピング酵素濃度(反応当たり5、15、45ng)と時間(1、2、4分)の関数として、共写物キャッピングの程度を測定した。

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プロトコル

1. 人工伸びコンプレックスの組み立てとポルIIウォーキング

  1. 磁気ビーズ上の3'ビオチン分子を含む非テンプレートDNAオリゴの1 nmolを固定化する。
    注:    次の手順は、将来の実験に備えるために事前に行うことができます。このプロトコルで使用されるすべてのオリゴ配列は表1に示されています。RNAオリゴは、5'-三リン酸修飾で合成される。
    1. 低タンパク質結合1.5 mLチューブに200 μLの磁気ビーズ(10mg/mL)を加え、磁気ラックに2分間置きます。
    2. チューブが磁気ラック上にある間は、ビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り出します。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り外し、5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl を追加し、チューブをラックに戻し、2 分後に洗浄液を取り外します。
    3. 同じバッファーの200 μLを使用して、さらに2回洗い返します。
    4. 10 mMトリス-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl、バッファーの 400 μL で磁気ビーズを再中断します。次に、H2 Oの380 μLと10 μMの非テンプレートバイオチニル化DNAオリゴの20 μLと混合します。チューブをヌタターの上に置き、室温で30分間インキュベートします。
    5. 5 mMトリス-HCl pH 7.5の200 μLで固定化された非テンプレートDNAオリゴを3回洗浄し、 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, その後、20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% グリセロール, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL ウシ血清アルブミンの200 μLで3倍.
    6. チューブを4°Cで一晩放置し、BSAでビーズを遮断します。
    7. 翌日、チューブを磁気ラックに入れ、液体を取り出して廃棄し、20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウシ血清アルブミンを新しいチューブに移し、ビーズを200μLで再懸濁させます。このDNAテンプレートの場合、最終濃度は約5μMです。
      注:インキュベーション時間とオリゴ濃度は、ビオチン化DNAオリゴごとに経験的に決定する必要があります。このテンプレートは、200の反応のために十分に提供する必要があり、4 °Cで保存した場合、少なくとも6ヶ月間続きます。
  2. アニールRNAおよびDNAテンプレート鎖オリゴヌクレオチドオリゴは、2:1モル比(それぞれ20および10pmol)でDNA:RNA二重鎖を得た。
    1. 表 2に説明するように、10 μL のアニーリング ミックスを設定します。
      注:10 μLのアニーリングミックスは10の反応で十分です。より多くのアッセイを実行する場合は、アニーリングミックスを必要に応じてスケールアップすることができます。
    2. 次のプログラムを使用して熱サイクラーでアニール反応を実行します:45°Cで5分、その後、それぞれ2分の12サイクル、43°Cから始まり、サイクルあたりの温度2 °Cを減少させます。4 °Cでアイドル。
      注:これは柔軟なタイムポイントです。アニーリングは約30分以内に終了しますが、より長い期間4°Cに残すことができます。実験室では、アニーリング混合物は、反応効率の低下を観察することなく、最大4時間座って残されています。
    3. RNAをテンプレート鎖DNAにアニーリングしながら、プロトコルの後のステップ用のバッファーを準備する。各バッファーを 1 つの反応に対して各バッファーを準備するために必要な成分を表 2 ~ 8に示します。[Y(X+1) + 1] の係数でレシピをスケールアップし、その他のすべてのバッファーの [X+1] と [X+1] を使用します。X = 調製する反応の数;Y = 必要な洗浄ステップ数(最小3)。
      注:実験の日に新鮮なすべてのバッファを準備します。PVAをバッファに追加した後は、チューブを氷の上に置かないようにしてください。使用する直前にバッファーにPol IIまたはヌクレオチドを追加します。
  3. 精製されたRNAポリメラーゼIIをDNA:RNAハイブリッドにロードします。
    1. DNAの1pmol(1 μL)を混合:13 μLのPol IIバッファーを持つRNAデュプレックス(表3より)。
    2. 精製されたRNA Pol II(1μL)をステップ1.3.1から混合物に約0.02単位加え、気泡を導入することなく、ピペット先端でゆっくりと上下にピペットでかき混ぜて混ぜます。30°Cで10分間インキュベートします。
      注:ここから与えられるボリュームは、単一の反応のためです。実験の反応の数に必要に応じてスケールアップします。記載の10としてラット肝臓から精製されたRNA Pol IIは、この例で使用される。しかしながら、培養哺乳動物細胞または酵母を含む他の供給源から精製されたRNA PolIIは、3、4、5、11、12、13も用いることができる。
  4. ビオチン化非テンプレートDNAを添加して伸長複合体を完成させる。
    1. 固定化された非テンプレートDNAオリゴの5pmol(1 μL)を非テンプレートDNAバッファーの14 μLに加え(表4より)、ステップ1.3.2からチューブに加え、37°Cで10分間インキュベートする。
    2. サンプルを磁気ラックに2分間磁気ラックに入れ、30μLの洗浄バッファー(表7から)で1xを洗浄し、未組み込みのPol IIとオリゴを除去します。
  5. 放射標識RNA 23mersを含む伸び錯複合体を生成する。
    1. 30°Cでさらなるインキュベーションをすべて行います。パルスバッファーの 23 μL に [α-32P] UTP (3,000 Ci/mmol) の 15 μL ATP および 10 μCi (1 μL) を 1 μL を追加し、これを使用して洗浄された磁気ビーズを再サスペンドします。
      注意:放射性物質は危険です。適切な保護具を着用し、放射性物質の安全な使用と処分のためのすべてのラボガイドラインに従ってください。
      注:ウェスタンブロット実験など、放射標識されたRNAが不要な場合は、放射標識されたUTPを15 μM UTPに置き換えます。
    2. 10分間反応をインキュベートし、放射標識された23mersの合成を可能にする。
    3. 100 μM ATP と 100 μM UTP ミックスを含む溶液を 3.5 μL のチェイス バッファーに追加し、組み立て済みの伸びコンプレックスを含むチューブに追加し、5 分間インキュベートしてすべての生まれつき転写物を 23mers に追いかけます。
    4. サンプルを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、30μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、未組み込みのヌクレオチドを除去し、30μLの洗浄バッファーで再中断します。
    5. 94 μLのストップミックスをプロテネーゼKおよびグリコーゲン(表9)で加えて反応を終了するか、セクション1.6に進み、より長い転写物またはセクション2を持つ伸長複合体を生成してキャッピングアッセイを行います。
  6. (オプション)23、25、および29ヌクレオチド転写物を作るためにポールIIを歩く
    1. 手順 1.2.1 ~ 1.5.4 で説明する手順に従って、放射標識付き 23mers を含む伸び複合体を準備します。4倍にスケールアップして、120μLの洗浄伸長複合体を生成します。
    2. ラベル 3 新しいチューブ "23mer", "25mer"と "29mer".洗浄された伸長複合体の30 μLを「23mer」チューブに移し、プロテネーゼKおよびグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加する。
    3. 磁気ラックに洗浄された伸長複合体の残りの90 μLを含むチューブを2分間入れ、上清を取り除き、BTBの90 μLでビーズを再サスペンドし、それぞれ1.5 mM ATPおよび1.5 mM CTPを補充した。30°Cで10分間インキュベートします。
    4. 90 μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、ステップ1.5.4に記載されているように90μLの洗浄バッファーで再中断した後、伸長複合体の30μLを「25mer」チューブに移し、プロテネーゼKおよびグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加します。
    5. 残りの60μLの伸び錯体を含むチューブを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、1.5 mM ATPと1.5 mM CTPのそれぞれ0.8 μLを補充したBTBの60 μLでビーズを再サスペンドします。
    6. 30°Cで10分間インキュベートし、セクション1.5.5のように60μLの洗浄バッファーで1回洗浄し、60μLの洗浄バッファーで再中断します。
    7. 2xサンプルから「29mer」チューブに30 μLを移し、プロテパネーゼKとグリコーゲンとのストップミックスの94 μLを追加するか、セクション2に進んでキャッピングアッセイを実行します。
    8. RNA精製および分析に進みます(セクション3)。

2. 人工伸び複合体をアッセイコトランスプリケートキャッピングに使用する

  1. ステップ 1.2.1 から 1.5.5 13 倍に説明する手順をスケールアップすることにより、23mers を含む洗浄された伸び縮複合体を生成します。これは12の反応+1余分のために十分です。
  2. ポルII CTDリン酸化
    1. 洗浄した伸長複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間入れ、上清を取り除き、1.5mM ATPの13 μLを補充したBTBの377 μLでビーズを再サスペンドします。
    2. +H と -H というラベルの付いた 2 つの新しいチューブをそれぞれ準備します。+H標識チューブに〜300 ng/μL TFIIHの3 μLを加え、標識されたチューブに-Hを加えて20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウビンムアルバムを添加する。
      注:通常、ラット肝臓から精製したTFIIHを用いていますが、市販の組換えCdk7/サイクリンH/MAT1(TFIIHのキナーゼモジュールであるCAK)の反応を約0.6μg/反応で得ています。情報については、材料の表を参照してください。
    3. ステップ2.2.1から洗浄された伸長複合体の87 μLを、30°Cで10分のインキュベートするチューブに+Hおよび270 μLの洗浄伸長複合体を加えます。
    4. サンプルを磁気ラックに2分間置きます。過剰なヌクレオチドおよび非結合タンパク質を除去するには、それぞれ90 μLまたは270 μLの洗浄バッファーで+Hおよび-H反応で伸長複合体を洗浄する。
  3. RNA キャッピング
    1. キャッピングミックスの87 μLで+Hと標識されたチューブ内の伸び複合体を再中断する(BTBは50 μM GTP(表10)を補充した)キャッピングミックスの261 μLで-Hと標識されたチューブ内の伸び複合体を再中断する。
    2. 5 ng CE+H、5 ng CE、15 ng CE、45 ng CEというラベルの付いた4つの新しいチューブを準備します。希釈キャッピング酵素(CE)を20mM HEPES-NaOH pH 7.9、20%グリセロール、100mM KCl、1mM EDTA、0.5mg/mLウシ血清アルブミンに希釈し、5ng CE/μL、15 ng CE/μL、または45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび45ng CE/μLおよび各3μLを含む溶液を調製する。
    3. それぞれに94 μLのストップバッファ(2.1.1)を追加した12本の新しいチューブを準備します。
    4. TFIIHで処理した伸び錯複合体の87 μLを加えて各キャッピング反応を開始するか、キャッピング酵素を含む標識チューブに加えないようにする。熱ブロックで30°Cでインキュベートします。
    5. 1、2、または4分後、各反応混合物の30μLを94μLのストップバッファーを含むチューブに転写して反応を停止する。セクション3に記載されているように反応産物を精製し、分析する。

3. RNA精製・分析

  1. RNA を浄化する
    1. 反応物を室温で20分間停止バッファー内でインキュベートする。
      注:一時停止ポイント。このバッファー内のサンプルは、RNAの損失または分解なしに最大4時間維持されています。
    2. 124 μLのフェノールで1回抽出:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)とクロロホルムで1回:イソアミルアルコール(24:1)。
      注意:フェノールは非常に有毒であり、急速に皮膚に吸収されます。適切な保護具を着用してください。
      注:抽出中のRNAの回収を最大化するには、水性相と有機相の間に安定した障壁を形成する高密度ゲルを含む市販のチューブを使用します。「ディスカッションと資料の表」を参照してください。
    3. 水位相(最上層)を、3M酢酸ナトリウムpH 5.2の12.4 μLを含む新しいチューブに移します。
  2. エタノール沈殿
    1. 100%エタノールの350 μLを追加し、反転によって完全に混合します。
    2. ドライアイスで少なくとも10分間インキュベートします。
      注:一時停止ポイント。便宜上、ここで停止し、翌日に手順を完了することができます。ただし、ステップ3.3に直接進み、同じ日にゲルを実行することが可能です。RNAは、さらなる処理の前に数日間-80°Cで保つことができますが、より長い時間放置しないでください。
  3. ゲル電気泳動用RNAサンプルの調製
    1. サンプルを解凍し、2~3回反転させて混合し、21,000 x g、4 °C、卓上遠心分離機で15分間遠心分離機を使用します。一方、脱電ゲルミックス(セクション3.4.1)を設定する。
    2. ペレットを邪魔することなく、サンプルからエタノールを慎重に除去します。
    3. 70%エタノールの500 μLを加え、チューブを数回反転させてペレットを洗浄し、室温または4°Cで5分間21,000 x gで再度遠心分離機を行います。
    4. できるだけ多くのエタノールを取り除き、テーブルトップ遠心分離機でチューブのクイックスピン(5-10 s)を行います。次に、ゲルローディングチップで、エタノールの最後の残りの体積を取り除きます。
    5. 室温で3分間エアドライペレット。
    6. 各ペレットの上部にH2Oの4 μLを加えてRNAを溶解する。室温で5分インキュベートします。
    7. ミックスに2x RNA色素の4 μL(材料表参照)を加え、各チューブを数秒間渦で渦にしてRNAを完全に再中断します。
      注:後者は低温で沈殿するので、尿素の代わりにホルムアミドを含むRNA色素が推奨される。
    8. チューブを素早く回転させ、70°Cで10分間加熱します。
    9. チューブをジェルにロードする準備ができるまでドライアイスに保存します。
      注:      ドライアイス上にRNAを保持すると、ゲルが重合している間、他の実験で柔軟に作業できます。サンプルは解凍後に再加熱する必要はありません。しかし、ゲルを実行する準備ができていれば、加熱後に直接RNAをロードすることができます。
  4. 尿素ページゲルの準備
    1. 40 mLゲルミックスの場合は、50 mLの円錐形チューブで組み合わせます:尿素の16.7g、40%のビス:アクリルアミド溶液の15 mL(19:1比)、10x TBEの4mL(1Mトリス-HCl、1Mホウ酸塩、20mMEDTA)、および8 mLのH2 OのmL。この容積は1.0 mmスペーサーが付いている1つの標準的なサイズのゲル(18 cmの高さx 16 cmの幅)のために十分である。
      注意:アクリルアミドは非常に有毒です。溶液中に吸入のリスクはありませんが、取り扱い中は必ずラボコート、手袋、安全メガネを着用してください。
      注:この混合物は、15〜50 ntの間で容易にRNAを解決する変性15%ポリアクリルアミドゲルを鋳造するためのもので、異なる長さの異なるRNA転写物を解決するために必要に応じてビス/アクリルアミドの濃度を変更する。
    2. 尿素が完全に溶解するまで、ゲルミックスを含む閉じたチューブをヌタターに置きます。
    3. ガラス板、1mmスペーサー、15ウェル櫛でゲル鋳造ステーションを設置します。
    4. 迅速に動作し、TEMEDの40 μLと10%のアンモニウム過硫酸溶液の400 μLをゲル溶液に加え、よく混合します。25 mLピペを使用して、プレート間にゲル溶液を注ぎ、櫛を挿入し、ゲルが少なくとも2時間重合することを可能にする。
      注:使用前に2時間以上注いだ場合は、湿ったペーパータオル(櫛を所定の位置に残す)で覆い、ラップで包んで乾燥を防ぎます。
  5. rna 電気泳動の脱電性ゲル
    1. 重合後、ゲルを走行タンクに移し、1x TBEで20mAで15〜30分間前走します。
    2. 一方、サンプルを解凍し(凍結した場合)、渦、2,000 x g、4°Cで4分間回転させます。
    3. 準備ができたら電源を切り、注射器を使用して1x TBEで各井戸を慎重にすすいでください。
    4. ゲルローディングのヒントを使用して、サンプルをゲルにロードします。
    5. 約2時間または低い色素(キシレンシアノールFF)がゲルの底に達するまで、一定の20〜30 mAでゲルを実行します。
  6. ゲルを取り出し、吸収性紙の上に置き、ラップで包みます。
  7. 放射標識されたゲルを蛍光スクリーンにさらす。
  8. 蛍光体を用いて蛍光スクリーンをスキャンし、画像を解析する。

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結果

図2および図3は、異なる供給源から拡張またはPol IIを拡張することによって異なる長さの転写物を含む人工伸長複合体を生成するために使用される代表的な結果反応を示す。図4は、これらの伸長複合体を共写性CTDリン酸化依存性RNAキャッピングのアッセイにどのように使用できるかを示す。

図2Aは、人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図である。図2Bは、プロトコル1に記載されているとおりに行われた反応で生成された異なる長さの転写物を示し、開始人工伸長複合体を20ntの合成RNAオリゴを用いて調製した(図2Aの濃い青色);RNA_20mer,

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ディスカッション

RNA処理や転写伸長自体の調節などのPol II伸長複合体に結合した事象を解剖しようとする研究は、高度に精製された酵素系を用いることによって大いに促進することができる。このような酵素システムの設定は困難な場合があります。Pol IIによるプロモーター依存転写には、少なくとも5つの一般的な転写因子が必要である。これらの要因の準備と備蓄には数ヶ月かかる場合があります。したがって、このプロセスにおけるレート制限ステップは、多くの場合、試験管内の基底転写を再構成するために必要な転写因子の幹部を単に準備する。

本稿では、精製されたPol IIと合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドのみを用いて、人工転写伸長複合体2、3を生成するための以前に開発された方法の適応について説明する。得られた伸長複合体は転写活性であり、Pol II転写およびRNAキャッピング5の結合を調査する場合の使用に適している。転写とRNAキャッピングは、クロマチン...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

私たちは、哺乳類キャッピング酵素cDNAを提供してくれたS.シューマンに感謝します。この研究は、グレーター・カンザスシティ・コミュニティ財団のヘレン・ネルソン医学研究基金からのスタワーズ医学研究所への助成金によって一部支援されました。 この原稿の根底にある元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434のスタワーズオリジナルデータリポジトリからアクセスできます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCRNAの放射性標識用
2x RNAローディング色素New England BiolabsB0363S強くお勧めします。ゲルローディング中にRNAを調製するため
40% Bis:アクリルアミド溶液Biorad1610144
ウシ血清アルブミン (20 mg/mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µgミリポア シグマ14-476Pol II CTD DNAのリン酸化に使用
ゴヌクレオチドIDT純度の仕様については表8を参照
Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1Life Technologies Invitrogen65001我々はまた、Dynabeads M-280ストレプタビジンを問題なく使用しましたが、MyOne Streptavidinビーズは沈殿が遅いため、MyOneストレプトアビジンビーズを好みます
GlycoBlue共沈殿剤(15 mg / mL)Life Technologies InvitrogenAM9516を強くお勧めします。1
mmスペーサーと15ウェルコームHoefer SE600標準デュアル冷却垂直電気泳動システム、1mmスペーサーと15ウェルコームを備えた
水性相と有機相の間に安定したバリアを形成する高密度ゲルが含まれています。抽出中のRNA収量を改善します
プロテイナーゼK溶液(20 mg / mL)Life Technologies Invitrogen25530049
RNAオリゴヌクレオチドTrilink詳細については表8を参照してください
酵母無機ピロホスファターゼ(100ユニット/ mL)ニューイングランドバイオラボNEBM2403Sキャッピング反応中にのみ必要です
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参考文献

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