共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

サマリー

ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol II伸長複合体に関連する転写物の共転写処理の基礎となるメカニズムを研究するのに有用である。

要約

真核生物mRNA合成は、成熟したmRNAを形成する前駆体RNAの多サブユニット酵素RNAポリメラーゼIIおよび共写物キャッピングおよびスプライシングにより前駆体RNAへのDNAテンプレートの転写を必要とする複雑な生化学的プロセスである。mRNA合成中、RNAポリメラーゼII伸長複合体は、その触媒活性を制御する転写因子の大規模なコレクション、ならびに成熟したmRNAを作成するキャッピング、スプライシング、および3'処理酵素による調節の標的である。mRNA合成の本質的な複雑さのために、その様々な共転写段階の単離および調査を可能にするより単純な実験システムは大きな有用性を持っている。

本稿では,同写物RNAキャッピングの研究に適したそのような単純な実験システムについて述べた.このシステムは、精製されたポリメラーゼおよび人工転写気から組み立てられた定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体に依存する。ビオチン化DNAを介して固定化すると、これらのRNAポリメラーゼII伸長複合体は、同転写RNAキャッピングと、伸び複合体がカッピング酵素を募集し、調節するメカニズムを解剖するための容易に可動化可能なツールを提供します。共写RNAキャッピング。このシステムは、RNAポリメラーゼII伸長複合体に結合されたmRNA成熟の他の段階における役割を有するタンパク質またはタンパク質複合体の募集および/または組み立てを研究するために適応できると期待される。

概要

真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。

当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。<....

プロトコル

1. 人工伸びコンプレックスの組み立てとポルIIウォーキング

1. 磁気ビーズ上の3'ビオチン分子を含む非テンプレートDNAオリゴの1 nmolを固定化する。
   注:次の手順は、将来の実験に備えるために事前に行うことができます。このプロトコルで使用されるすべてのオリゴ配列は表1に示されています。RNAオリゴは、5'-三リン酸修飾で合成される。
   1. 低タンパク質結合1.5 mLチューブに200 μLの磁気ビーズ(10mg/mL)を加え、磁気ラックに2分間置きます。
   2. チューブが磁気ラック上にある間は、ビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り出します。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り外し、5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl を追加し、チューブをラックに戻し、2 分後に洗浄液を取り外します。
   3. 同じバッファーの200 μLを使用して、さらに2回洗い返します。
   4. 10 mMトリス-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl、バッファーの 400 μL で磁気ビーズを再中断します。次に、H2 Oの380 μLと10 μMの非テンプレートバイオチニル化DNAオリゴの20 μLと混合します。チューブをヌタターの上に置き、室温で30分間インキュベートします。
   5. 5 m....

結果

図2および図3は、異なる供給源から拡張またはPol IIを拡張することによって異なる長さの転写物を含む人工伸長複合体を生成するために使用される代表的な結果反応を示す。図4は、これらの伸長複合体を共写性CTDリン酸化依存性RNAキャッピングのアッセイにどのように使用できるかを示す。

図2Aは、人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図である。図2Bは、プロトコル1に記載されているとおりに行われた反応で生成された異なる長さの転写物を示し、開始人工伸長複合体を20ntの合成RNAオリゴを用いて調製した(図2Aの濃い青色);RNA_20mer,

ディスカッション

RNA処理や転写伸長自体の調節などのPol II伸長複合体に結合した事象を解剖しようとする研究は、高度に精製された酵素系を用いることによって大いに促進することができる。このような酵素システムの設定は困難な場合があります。Pol IIによるプロモーター依存転写には、少なくとも5つの一般的な転写因子が必要である。これらの要因の準備と備蓄には数ヶ月かかる場合があります。したがって、このプロセスにおけるレート制限ステップは、多くの場合、試験管内の基底転写を再構成するために必要な転写因子の幹部を単に準備する。

本稿では、精製されたPol IIと合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドのみを用いて、人工転写伸長複合体2、3^を生成するための以前に開発された方法の適応について説明する。得られた伸長複合体は転写活性であり、Pol II転写およびRNAキャッピング5の結合を調査する場合の使用に適している。転写とRNAキャッピングは、クロマチン.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	RNAの放射性標識用
2x RNAローディング色素	New England Biolabs	B0363S	強くお勧めします。ゲルローディング中にRNAを調製するため
40% Bis:アクリルアミド溶液	Biorad	1610144
ウシ血清アルブミン (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg	ミリポア シグマ	14-476	Pol II CTD DNAのリン酸化に使用
ゴヌクレオチド	IDT		純度の仕様については表8を参照
Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1	Life Technologies Invitrogen	65001	我々はまた、Dynabeads M-280ストレプタビジンを問題なく使用しましたが、MyOne Streptavidinビーズは沈殿が遅いため、MyOneストレプトアビジンビーズを好みます
GlycoBlue共沈殿剤(15 mg / mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	を強くお勧めします。1
mmスペーサーと15ウェルコームHoefer SE600標準デュアル冷却垂直電気泳動システム、1mmスペーサーと15ウェルコームを備えた
			水性相と有機相の間に安定したバリアを形成する高密度ゲルが含まれています。抽出中のRNA収量を改善します
プロテイナーゼK溶液(20 mg / mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
RNAオリゴヌクレオチド	Trilink		詳細については表8を参照してください
酵母無機ピロホスファターゼ(100ユニット/ mL)	ニューイングランドバイオラボ	NEBM2403S	キャッピング反応中にのみ必要です

オリ反応をはるかに簡単にする染料核酸ペレットブルーQiagen 129046 強くお勧めします。