胎児と新生児のネズミの長骨の培養と測定

サマリー

ここでは、胎児および新生児の両方の段階での長いネズミ骨の元インビボ培養のための方法を提示し、生体内プロセスを概説しながら制御された条件下で骨および軟骨の発達およびホメオスタシスを分析するのに適している。

要約

長骨は複雑で動的な構造であり、軟骨中間体を介して endochondral 骨化から生じる。健康な人間の骨への限られたアクセスは、マウスやラットなどの哺乳動物モデルの使用は、骨の成長と恒常性の異なる側面を調べるために特に貴重になります。さらに, マウスの洗練された遺伝的ツールの開発は、長い骨の成長のより複雑な研究を可能にし、骨の成長を研究するために使用される技術の拡大を求めます.ここでは、概説のほとんどの in vivo プロセスを使用しながら、厳密に制御された方法で骨と軟骨の研究を可能にする ex vivo ネズミ骨培養の詳細なプロトコルを紹介します。記載された方法は、脛骨、大腿骨、および中足骨を含む骨の範囲の培養を可能にするが、ここでは主に脛骨培養に焦点を当てている。また、タイムラプスライブイメージングや薬物治療などの他の技術と組み合わせて使用することができる。

概要

臓器の成長は、成長障害の出現を防ぐために厳密に調整されなければならない、と体の異なる部分間の複数の細胞型、分子経路およびクロストークの調節を伴う。イメージング技術は、成長している胚において経時的に起こる変化に対処するために不可欠であり、正常な状態においても、またシステムにおいて摂動が誘発された後も同様である。子宮内発育を伴う胚は、広く使用されているげっ歯類モデルのような、生きた画像化および薬物治療のための追加の課題を提示し、これは ex vivo 培養技術を使用して部分的に克服することができる。インビボプロセスを正常に不在し、有意義な結果を得るためには、各器官または組織に対して適切な培養条件を見つけることが重要となる。

哺乳類の骨格のほとんどの骨は endochondral 骨化を通じて成長し、そこでは胚性軟骨 (軟骨細胞と呼ばれるセルで構成される) が長手方向の成長を駆動し、徐々に骨に置換される。このプロセスは、長い骨の末端に位置する成長プレートで発生します, 3 つのゾーンを区別することができます: 安静, 増殖性, 肥大と^1,2.第1に、安静域における丸い前駆軟骨は、増殖性ゾーンにおいて循環柱状軟骨細胞へと移行する。分化の次の段階では、これらの軟骨細胞は肥厚性になり、タイプ X コラーゲンを分泌し始めます。肥大性軟骨細胞は骨化の後続のステップを調整します....

プロトコル

すべての実験は、実験動物の倫理的取扱いに関する地方の政府および制度のガイドラインに従って行われるべきである。

1. 骨培養日前の準備

1. Matings の日 14.5 (E 14.5) 以降から胎児と仔を得るために、時限マウスを設定します。
   注:長い骨の文化は、正常に異なるマウス系統に適用することができます。本プロトコールにおいて、outbred スイスウェブスター野生型マウスが用いられる。
2. 解離培地の調製 (ヒューストン et al.¹⁵): 希釈α-最小エッセンシャル培地 (α-MEM) またはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 1/13 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) および 2Mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) およびフィルター滅菌0.22 μ m、33 mm 直径のスポイトフィルターを通して。アリコートを-20 ° c に保管してください。
3. 胎児の抽出の前日に、0.2% BSA を含む DMEM、0.5 mM L-グルタミン、40 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、0.05 mg/mL アスコルビン酸、および1mm の betaglycerophosphate からなる無血清骨培養培地を準備する。フィルター滅菌は、0.22 μ m、33 mm 径のシリンジフィルターを通して、4° c で最大1ヶ月間....

結果

骨培養は、異なる段階から開始して行うことができる。図 1a− Dにおいて、同一の段階での培養した脛骨と抽出したものとの比較が示されている。第1の観察は、達成された最大2日間の培養が、軟骨および無機骨の両方についてインビボ骨成長に匹敵することである (図 1a、B、D)。培養期間が長いと、培養骨と新たに抽出したものとの間に大きな差が生じる (図 1c)。さらに、このプロトコルで言及されているように、骨の両端をつなぐ軟部組織を除去することは、それ以外の場合、骨が曲がることが重要です。図 1eは軟部組織を伴わない脛骨に対して軟質組織の不完全な除去を伴って成長した脛骨の例を示す。

ディスカッション

骨 ex インビボ培養法は、骨成長²⁸の生物学を評価するためにしばらくの間使用されてきたが、マウス長骨にはめったに適用されていない。画像化技術の発達により、ex vivo の骨培養は、インビボ条件に近い設定でリアルタイムで骨成長を研究する魅力的な方法を提供する。このシナリオでは、長い骨の成長がインビボでの成長に匹敵する条件を定義することが重要である。

本研究では、長い骨培養のためのシンプルで手頃な価格のプロトコルについて説明し、限界と可能な用途に対処する。この方法の最も重要なステップは、骨の単離であり、そのままで、かつ、可能な限りボーンの端部との間の軟部組織として少なくする必要がある。軟部組織を骨の末端の間に残すことは、図 1eに例示されているように骨の正常な成長を防ぎ、屈曲を誘発する。骨の末端にある軟組織は、最終的には消滅するので、残すことができる。特別な注意を必要とする別のステップは、プラスチックピペットに容易に固執することができるように、培養プレートへの骨の移動です。可.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-エチニル-2'-デオキシウリジン	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-デオキシウリジン	Sigma	B5002
50 mL 円錐形遠心分離管	Falcon	352070
60 mm TC処理センターウェル臓器培養皿、20/パック、500/ケース、滅菌	ファルコン	353037-
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
アスコルビン酸	シグマ	A92902
スコープ用ベースユニット	ツァイス	435425-9100-000
ベタグリセロリン酸	シグマ	G9422
双眼鏡	ツァイス	STEMI-2000
ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション v	ロシュ/シグマ	10735086001
DigiRetina 500 カメラ	Aunet
解剖キット	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2インキュベーター	サーモフィッシャー	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
マルチウェル 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
プラスチックピペット 1mL 滅菌済み 個別包装	サーモ	273
シリンジフィルター 0.2 um	ライフサイエンス	PN4612
テルモシリンジ 20 mL	テルモ	DVR-5174
トレチノイン(レチノイン酸)	シグマ	PHR1187-3X
三眼スコープ	オーネット	AZS400T