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方法論記事

細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究

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DOI:

10.3791/59510

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2019年9月19日

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

この記事について

サマリー

特に酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)の毒性プロファイルを評価するための詳細なプロトコルについて説明し、ヒトMRC5肺線維芽細胞における細胞死の種類および果実フライドロソフィラにおけるROS形成について説明する。

要約

酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NP)は幅広い用途を持っていますが、ZnO NP関連毒性に関する報告の数は近年急速に増加しています。しかし、ZnO NP誘発毒性の根本的なメカニズムを解明する研究はスキャン可能である。インビトロとインビボ実験モデルの両方を用いてZnO NPの毒性プロファイルを決定した。ZnO NP曝露MRC5肺線維芽細胞では細胞生存率の有意な減少が認され、ZnO NPが細胞傷害作用を発揮することを示した。同様に、興味深いことに、ZnO NPに曝露された腸は、フルーツフライショウジョウバエにおける活性酸素種レベル(ROS)の劇的な増加を示した。消費者によるZnO NPの使用率の増加に対するリスク評価を確立するためには、より詳細な研究が必要である。

概要

ナノテクノロジーとは、医学、材料科学、生化学など、あらゆる科学分野で使用されるナノサイズの材料の応用を指します。例えば、紫外線散乱、化学センシング、抗微生物性、高い電気伝導性で知られるZnO NPは、食品包装、化粧品など様々な消費財の製造に活用されています。繊維、ゴム、電池、自動車テールガス処理用触媒、および生物医学関連アプリケーション1、2、3.

しかし、ZnO NPベースの製品の急増は、ZnO NPへの人間の暴露の増加につながる、人間の健康に対する潜在的な悪影響に関する懸念を提起している。インビトロ細胞研究の数は、ZnO NPが酸化ストレス、オートファジー関連細胞毒性、炎症、および無毒性4、5、6、7、8を誘発できることを実証しました.特に、ZnO NPの毒性は、Zn2+イオンを自由に溶解し、ZnOの表面反応性によって引き起こされると仮定され、その結果、細胞イオン性および代謝不均衡が生じ、イオン性恒常性障害およびイオン輸送の阻害4,7,9,10.重要なことに、研究は、活性酸素種(ROS)の生成がZnO NPs関連毒性の基礎となる主要なメカニズムの一つであることを示しています。ROS侮辱後の不十分な抗酸化活性は、細胞毒性およびDNA損傷9を引き起こす原因であることが示されている。ZnO NPの毒性効果は、げっ歯類1、ゼブラフィッシュ11、12、ならびに無脊椎動物のショウジョウバエ13を含む動物モデルでも報告されている。

ショウジョウバエは、化学物質およびナノ材料(NM)14、15の毒性スクリーニングのための確立された代替動物モデルとして機能する。重要なのは、ヒトとショウジョウバエの間には高いレベルの遺伝的類似性があり、NMなどの環境汚染物質に対する生物学的応答を評価するための生体内モデルとしてのショウジョウバエの使用を正当化する。16.さらに、その小さなサイズ、短い寿命、遺伝的なアメニティ、および容易で、費用効果が大きい維持のためにショウジョウバエを使用することの多くの利点がある。さらに、ショウジョウバエは遺伝学、分子、発生生物学の研究に広く採用されており、2000年に完全なゲノムが完全に配列され、様々なハイスループットスクリーニングに適しています。そして、未解決の生物学的問題に取り組むために17,18,19,20,21.近年、ショウジョウバエにおける異なるタイプのNPを用いた免疫毒性に関する多くの研究が15、22、23、24で報告されている。ショウジョウバエを用いた研究から得られたこの基本的な新しい知識は、ナノトキシトロジーの理解に関するより多くの洞察を提供するのに役立ちました。

ROSは、特に、金属ベースのNP25によって引き起こされる細胞毒性および無毒性の既知の原因である。ROSは、分子酸素よりも高い活性特性を有する酸素含有化学種である。スーパーオキシドラジカル(O2-)などのフリーラジカルは、過酸化水素(H2O2)などの非ラジカル分子がROSとして作用しうる。正常な生理学的状態の下では、それらは細胞恒常性26を維持する必要があるが、抗酸化防御システムの過剰産生または不自由による過剰なROSは酸化ストレスを引き起こし、タンパク質への損傷を引き起こす可能性があり、脂質およびデオキシリボ核酸(DNA)27.例えば、ROSレベルが増加し、グルタチオン(GSH)レベルが伴って減少するにつれて、アデノシン三リン酸(ATP)合成の中断が起こり、乳酸脱水素酵素(LDH)レベルが培地中で増加し、細胞死27で終わる。

ここでは、培養哺乳動物細胞とショウジョウバエを用いて細胞解析や遺伝子解析を行い、ZnO NPの潜在的な悪影響を判定するプロトコルを提供する。ZnO NPの毒性試験に用いられる方法の概要を図1に示す。

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プロトコル

1. 生細胞/固定細胞に関する蛍光活性化細胞選別(FACS)分析

  1. 15分間のサスペンションでZnOのニオネート。
  2. 培養細胞の治療に1mg/mL ZnO NPストック溶液を用いて、様々な濃度(例えば、0、10、25、50,100および200 μg/mL)でZnO NPを調用する。
  3. 種子MRC5ヒト肺線維芽細胞(1 x 105細胞/ウェル)を1日前に6ウェル培養プレート上に、その後、8時間、16時間、24時間のZnO NPの2mL(三重)で細胞を処理する。
  4. 各時点で、5分間300 x gで遠心分離して細胞を収集する。
  5. リン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞ペレットを2回洗浄します。
  6. 0.1M HEPES/ナトリウム(NaOH)、1.4M塩化ナトリウム(NaCl)、および25mM塩化ナトリウム(CaCl2)で構成される1x結合バッファーで細胞を再中断し、100 μL当たり1x105細胞の濃度で再濁させる。
  7. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)アネキシンV染色物5μL、ヨウ化プロピジウム(PI)DNA染色の5μLを加え、暗い暗闇の中で室温(RT;25°C)で15分間細胞をインキュベートします。
  8. フローサイトメトリーで細胞をソートする前に、1x結合バッファーの追加の400 μLでサンプルをトップアップします。サンプルごとに最低 10,000 個の細胞が分析されます。
  9. 得られた中央値の強度を使用して棒グラフを集計します。

2.ショウジョウバエへのZnO GPの暴露

  1. バイアルに異なる濃度のナノ粒子の1 mLを追加し、続いて9 mLのフライフードを加え、0.1 mg/mL、0.25mg/mLまたは0.5mg/mL ZnO NPsの最終濃度を作ります。
  2. ピペットを使用してバイアルに完全に食品とナノ粒子を混合します。
  3. ZnO NPを含むフライフードを使用前に少なくとも2~3時間冷却してください。
  4. 大人のオスとメスのハエを5日間バイアルに入れ、食べ物の表面に卵(白い斑点として現れる)を交尾させ、産卵できるようにします。
  5. 親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階(胚、幼虫、子犬、大人の段階)で構成されるさらなる発達を受けることを可能にする。

3. フライの解剖

  1. 分析のためにバイアルの壁から後期3rdのスター幼虫を収集します。新たに産卵した卵は、通常、RTで72-120 h後に遅い3rdの幼虫に発達する。
  2. 解剖皿をきれいにし、解剖媒体/PBSで井戸を満たします。
  3. 一対の鉗子を使用して、立体顕微鏡下で幼虫(後期3rd instar)を解剖する。
  4. 鉗子の先端を使用して小さな穴を作り、幼虫のキューティクル層を開きます。慎重に腸を引き出し、シュナイダーのショウジョウバエ培地を含む1.5mLのマイクロ遠心分離管に入れ、4%パラホルムアルデヒド(PF)の1mLを使用して固定工程に入れます。
  5. 3.5免疫染色などの後続の実験のために、RTで10分間PFの腸を固定します。

4. ジヒドロエチジウム(DHE)染色を用いたROS検出

  1. 手順 2.1 で説明したように、ZnO NP のさまざまな濃度で幼虫を治療します。
  2. セクション3に記載されている第3の第3の星幼虫からの腸の解剖に続いて、組織染色が行われる前にRTでシュナイダーのショウジョウバエ培地で腸をインキュベートする。シュナイダーの培地の1mLにDHE色素の1μL(30mMのストック濃度から)を溶解し、10-30 μM DHE色素の最終作業濃度を作ります。
  3. 暗闇の中でRTで5分間腸をインキュベートし、5分ごとにシュナイダーの培地を使用して3回洗浄します。
  4. 4%PF(オプションステップ)で腸を固定し、4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含むアンチフェードマウント媒体で、ガラススライドに腸を取り付けます。共焦点顕微鏡下で画像をキャプチャします。

5. ImageJソフトウェアを用いて蛍光を測定する

  1. 蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した蛍光画像をImageJソフトウェアに読み込む。
  2. [分析]メニューをクリックし、[測定値を設定]を選択します。
  3. 面積積分強度や平均グレー値などの出力メジャーを選択します。
  4. [測定]をクリックします。
  5. 蛍光のない領域を選択して、背景を設定します。
  6. Excel スプレッドシートにデータをエクスポートし、次に示すように計算を使用して、補正された総細胞蛍光 (CTCF) を決定します。
    CTCF = 統合密度 - (選択した細胞Xの平均蛍光部のバックグラウンド測定値の蛍光)
  7. 棒グラフを作成し、統計分析を実行します。

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結果

NP露光細胞を細胞染色試薬キットで処理し、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞選別を行った。ZnO NP処理細胞(下、右パネル)は、対照細胞(R5、下部、左パネル)よりも早期(R3)/後期アポトーシス細胞(R6)の割合が高い。壊死細胞死はR4(上、右パネル)で示される(図2)。ZnO NP処理MRC-5線維芽細胞に関するFITC/アネキシンVアッセイの結果を図2に示す。

ショウジョウバエ実験では、様々な濃度で超音波処理されたZnO NPを10mLチューブで飛ばすために添加し、ピペットコントローラを用いてよく混合した(図3)。バイアルから採取した後期の3番目のインスター幼虫を立体顕微鏡下で解剖した。幼虫は、残りの食物の残骸を取り除くために最初に洗浄された(<...

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ディスカッション

ZnO NPがMRC5線維芽細胞にアポトーシスを誘導できるかどうかを評価するために、我々は細胞を壊死またはアポトーシス細胞死から区別するためにフローサイトメトリーを使用する。正常な生細胞では、ホスファチジルセリン(PS)は細胞膜に局在する。アポトーシスが発生した場合、PSは血漿膜の細胞外リーフレットに転移し、Fluoresin(FITCアネキシンV)29で標識されたアネキシンVの結合を可能にする。一方、赤蛍光プロピジウムヨウ化物(PI)は、核酸結合色素であり、生細胞およびアポトーシス細胞に対して不浸透性であるが、死細胞30を染色する。これにより、アルゴンイオンレーザーの488nmラインを持つフローサイトメーターを用いて、死細胞(赤と緑)、アポトーシス細胞(緑色蛍光)および生細胞(蛍光がほとんどない)を同定することができます。

ショウジョウバエ腸のDHE染色の場合、長時間保存すると染料が暗い/紫色に変わる色素の自動酸化につながる可能性があるため、実験を開始する直前にDMS...

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開示事項

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

研究は、補助金番号R706-000-043-490によってサポートされました。このスタディは、補助金スポンサーのビューを表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15% メチル 4-ヒドロキシ安息香酸シグマ Aldrich
4% パラホルムアルデヒドシグマ AldrichP6148
バクト寒天BD biosciences
cncCK6/TM3、Sba 博士からの贈り物 Kerppola T
コーンミール、グルコース、酵母醸造機Sigma Aldrich
CyAn ADPSummit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
ジヒドロエチジウム(ヒドロエチジン)サーモフィッシャーサイエンティフィックD11347
FITC アネキシンV アポトーシス検出キット IBD biosciences556547
蛍光顕微鏡オリンパス
グルコリンスーパーマーケット
ImageJソフトウェアNIH
MRC5 ヒト肺線維芽細胞ATCCCCL-171
Schneider's ショウジョウバエ mediumThermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield 退色防止封入剤 with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S;Sod2N308/CyONIG-FLY
酸化亜鉛ナノ粒子Σ Aldrich721077シート2参照

参考文献

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