ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。
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この記事について
サマリー
要約
細菌は、微生物、より大きな生物、および生物学的環境との相互作用によって形成された複雑な根茎圏微生物叢を形成する。実験室条件下では、植物成長促進細菌(PGPB)による根圏コロニー化は、未植民地化された植物に対する宿主植物の健康または発達を増加させることができる。しかし、フィールド設定では、PGPBによる細菌治療は、多くの場合、作物に実質的な利益を提供しません。1つの説明は、これは植物の寿命にわたって内因性土壌微生物との相互作用中にPGPBの損失に起因する可能性があることです。ほとんどの研究は、根茎群科内のPGPBの維持よりも初期の植民地化に焦点を当てているので、この可能性を確認することは困難でした。ここでは、細菌群集の組み立て、共存、維持は根圏微小環境の決定的特徴によって形成され、これらの相互作用がネイティブ環境におけるPGPB生存に影響を与える可能性があると仮定されている。これらの行動を研究するために、水耕植物成長アッセイは、植物の根の初期植民地化中および異なる成長への転移後の細菌の空間分布を定量化し、視覚化するためにアラビドプシスタリアナを使用して最適化されています。環境。このシステムの再現性と有用性は、よく研究されたPGPBシュードモナス・シミアで検証されます。複数の細菌種の存在が植物根の植民地化と維持のダイナミクスにどのように影響するかを調べるために、3つの細菌株(Arthrobacter、Curtobacterium、およびマイクロバクテリウム)からのモデルコミュニティ種)はもともとA.タリアナ根圏から単離され構築される。これらの多様な細菌種の存在は、シーケンシングベースの細菌コミュニティ研究に代わるものとなるこの水耕植物主化アッセイを用いて測定できることが示されている。このシステムを用いた今後の研究は、多種植物微生物叢の細菌行動の理解を時間の経過と共に、環境条件の変化に改善する可能性がある。
概要
細菌や真菌性疾患による作物の破壊は、食糧生産の低下を引き起こし、世界的な安定性を著しく破壊する可能性があります1.抑制土壌中の微生物が植物の健康を増大させる原因であるという発見に基づいて、科学者は、植物の微生物叢が特定の存在と豊富さを修正することによって植物の成長をサポートするために利用することができるかどうか尋ねました。細菌種3.植物の成長または発達を助けるために見出された細菌は、総称して植物成長促進細菌(PGPB)と呼ばれています。最近では、潜在的なPGPBを特定するだけの研究から、土壌、根の周り、根間(根表面を含む直接周囲および根表面を含む領域)における王国間相互作用がPGPBにどのように影響しているかを理解することにシフトしています。アクティビティ4.
PGPBによる根圏の植民地化は、未植民地化された植物に対する多様なストレスに応じて宿主植物の健康または発達を増加させることができる5.しかし、結果は、多くの場合、密接に制御された温室および実験室の設定6で観察されるものと比較して、ネイティブ土壌条件でより可変である。この違いの1つの仮説は、PGPBの増殖または挙動が、フィールド7、8にお....
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プロトコル
注: 実験セットアップはわかりやすく説明されており、このレポートに含まれる代表的な結果を生成するために使用されますが、条件は必要に応じて変更できます。使用される細菌のBSLステータスに従って、すべてのステップはPPEを使用し、安全のための機関および連邦の再調整に従って行われるべきである。
1. 細菌の特性
- 成長培地寒天プレート上の細菌の形態を決定します。およそOD600 = 0.5で細胞を再中断し、1 μLの体積を選択した寒天媒体にプレートする。特定の細菌群集の個々のメンバーをより良く区別するために、20 mg/mLの最終濃度に寒天プレートにX-galを追加します。コロニーが形成されるまで24 °Cまたは30 °Cで成長し、その後、コロニーの形態の写真やメモを撮ります。
- 各細菌株の光学密度とmL16あたりのCFU(コロニー形成単位)数との相関関係を定義する。24ウェルプレートの1mLの水中の細菌を約OD600 =5に再定置し、2倍の連続希釈を行い、すべての希釈のOD600を監視し、各サンプルで複数の光学密度で生存可能なCFU/mLを決定するプレートを行います。
- 各細菌株の最大超音波処理許容度を決定します。これを行うには、アリコート細胞を液体培地を含む24ウェルプレートに入れ、一部の細胞を無言制御試料として....
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結果
よく特徴付けられたPGPB P.シミアエWCS417rは、水耕栽培におけるA.タリアナの根を植民地化することが知られている。この自然蛍光菌は、植民地化後の苗根の顕微鏡検査を用いて容易に可視化できる(図2)。これらのA.タリアナ苗の全長(4-6ミリメートルの長さ)の根を画像化することは可能ですが、多くの植物のためにそうすることは非常に多くの時間がかかります。時間ポイントと細菌の種間のほとんどの変動は、根14のクラウン、中央、先端をイメージングすることによって捕捉することができるので(図1の赤いボックスで示す)、これらの領域は、完全な根をイメージングするのではなく、イメージングのために優先順位が付けられました。長さ。P.シミアエ-植民地化A.タリアナ根(図2)の明.......
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ディスカッション
すべての環境の植物は、異なる細菌や真菌の数百万に数千人と相互作用5,7.これらの相互作用は、作物の収量と食糧生産に潜在的な影響を及ぼす植物の健康にマイナスと肯定的な影響を与えることができます。最近の研究はまた、PGPUによる作物の可変植民地化が、フィールドトライアル22における予測不可能な植物サイズと作物収量を占める可能性があることを示唆している。これらの相互作用の背後にあるメカニズムを理解することは、ストレス24の下でも、植物関連の微生物群相を直接操作して、健康な植物の開発を支援することを可能にするかもしれません。
根の細菌の植民地化と根間の維持は植物微生物の相互作用9にとって重要であるため、これらの細菌行動を再現的に可視化し、定量化するシステムを構築したいと考えました。この水耕栽培、浮遊苗成長システムは、A.タリ.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、エネルギー生物環境研究省(DOE-BER 0000217519 to E.A.S.)、国立科学財団(INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S.)が提供する研究資金によって支援されました。SLHはまた、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援されました。私たちは、細菌株と貴重な洞察力を提供するためにジェフリー・ダングル博士に感謝します。アンドリュー・クライン博士とマシュー・J・パワーズ博士に実験的な提案をいただいただいたことに感謝します。最後に、SLHは、特に創造的でアクセス可能な手段を通じて、科学を広めることが特権と責任であることを私たちに思い出させるためのソーシャルメディア上の接続に感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 必要な材料 | |||
| 1.5 mL エッペンドルフチューブ | 任意の | N/A | |
| 24 ウェルプレート | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | N/A | Stored at -80?40%グリセロール中のC | |
| 、BactoAgar | BD | 2306428を優先します。参照214010 | |
| 漂白剤 | 任意の | N / A | |
| コンビロン | 任意の | N / A | 短日ライトダークサイクル:460-600 &モル/m²/s 9/15 hours 18/21 に明るさ/暗さを設定しますか?C、内部電源コンセント付き |
| デシケータージャー:ガラスまたは重いプラスチック | 任意の | N / A | |
| エタノール 任意の | N / A | ||
| 炎 | 任意の | N / A | |
| 鉗子 | 任意の | N / A | |
| インキュベーター | N / A | 特定の細菌の成長に最適な温度で | |
| 塩酸 | 任意の | N / A | |
| レノックスLBブロス | RPI | L24066-1000.0 | |
| マイクロ遠心分離 | 任意の | N / A | |
| マイクロピペッター | 任意の | N / A | ボリューム5 µLから1000µL |
| 顕微鏡(できれば蛍光) | 任意の | N / A | は、最良の定義が重要でない場合、軽い可能性があります |
| MSソルト+ MES | RPI | M70300-50.0 | |
| ビタルプレートシェーカー任意の | N / A | 96時間220rpmで動作することができます | |
| ペトリ皿 | 任意の | N / A50mL | の総容量 |
| リザーバー任意の | N / A | ||
| 分光光度計 | 任意の | N/A | |
| 標準穴パンチ | 任意の | N/A | 約7mmのパンチ直径 |
| 滅菌水 | 任意の | N/A | |
| サージカルテープ | 3M | MMM1538-1 | |
| テフロンメッシュ | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| 超音波装置 | 任意の N/A | ||
| ボルテックスミキサー | 任意の | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | 他のベンダー 利用可能 |
| 推奨 材料 | |||
| 24 プロング 超音波装置 アタッチメント | 任意の | N/A | 一度に複数のサンプルを超音波処理するため。個別に行うことができます |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| ガラスビーズ | 任意の | N/A | |
| マルチペッター/レペッター | 任意の | N/A | |
| 滅菌96ウェルプレート | 任意の | N/A | 連続希釈用。エッペンドルフチューブ |
| Biological 材料 使用 | |||
| Arabidopsis thaliana 種子 | 任意の N/A | 種子ストック | |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacteriumoceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Haney, et al. 2015年に同様のシステムで公開されました。Cole, et al. 2017 |
参考文献
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39
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