タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。
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方法論記事
生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
神経変調は、脳機能に強力な制御を行使します。.神経調節システムの機能不全は、神経学的および精神的障害をもたらす。その重要性にもかかわらず、細胞分解能を持つ神経調節イベントを追跡する技術が出現し始めたばかりです。ドーパミン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、セロトニンなどの神経調節因子は、それぞれのGタンパク質結合受容体を介して細胞内シグナル伝達イベントを引き起こし、神経興奮性、シナプス伝達、およびその他の神経学的刺激性を調節する。ニューロンネットワークにおける情報処理を調節する。上記の神経調節剤は、cAMP/タンパク質キナーゼA(PKA)経路に収束する。そこで、単細胞分解能を有する生体内PKAイメージングは、神経電気活動に対するカルシウムイメージングに類似した方法で神経調節イベントの読み出しとして開発された。本明細書では、頭部固定振る舞うマウスの皮質における個々のニューロンのレベルでPKA活性を可視化する方法が提示される。これを行うには、Förster共鳴エネルギー伝達(FRET)に基づく改良されたA-キナーゼ活性レポーター(AKAR)がtAKARαと呼ばれる使用されます。この遺伝的にコードされたPKAセンサは、DNAプラスミドの子宮エレクトロポレーション(IUE)、またはアデノ関連ウイルス(AAV)の立体注射を介して運動皮質に導入される。FRETの変化は、光散乱脳組織におけるFRET信号を定量するための比量的FRET測定に対する利点を提供する2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡(2pFLIM)を使用して画像化されます。強制移動中のPKA活動を研究するために、tAKARαは、目を覚ます、頭固定マウスの皮質の上の慢性頭蓋窓を通して画像化され、速度制御された電動トレッドミルで実行または休息します。このイメージングアプローチは、対応する行動誘発PKA活動を研究し、生体内イメージングのための他のFLIMベースのセンサに適用されます。
概要
神経変調は、遅いシナプス伝達としても知られており、ストレス、覚醒、注意、移動1、2、3、などの異なる行動状態の間に脳機能を強力に制御します。4.その重要性にもかかわらず、神経調節イベントがいつどこで起こるかの研究はまだ初期段階にある。アセチルコリン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、および多くの神経ペプチドを含む神経調節剤は、Gタンパク質結合受容体(GPCR)を活性化し、その結果、広範囲のタイムスケールの広いウィンドウを持つ細胞内第2のメッセンジャー経路をトリガーする秒から時間まで。各ニューロモジュレータは、シグナル伝達イベントの明確なセットをトリガするが、cAMP/タンパク質キナーゼA(PKA)経路は、多くのニューロモジュレータ1、5のための共通の下流経路である。cAMP/PKA経路は、神経興奮性、シナプス伝達、可塑性6、7、8、9を調節し、したがって、ニューロンネットワークダイナミクスを調整する。
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、オレゴン州立保健科学大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 2pFLIM顕微鏡セットアップ
- フォトンタイミング計数モジュール(PTCM、材料表)を取り付け、製造元のマニュアルに従ってコンピュータ(図1)に接続します。
注:PTCM は、通常、レーザー パルスタイミングの「同期」入力と光増倍管(PMT)からのフォトン入力を受信するコンピュータボードです。また、2光子イメージング制御ソフトウェアからピクセル、ライン、フレームのクロックタイミングを受信します。PTCM はクロック信号を使用して、個々のフォトンを異なるピクセルとフレームに分離します。 - レーザータイミングを測定するために>200 MHz帯域幅を持つフォトダイオードを追加します。光路に標準のガラスカバースリップを配置し、光路に垂直に配置されたフォトダイオードにレーザー光の小さな一部を反射します(図1)。フォトダイオード出力をPTCMの「同期」入力に接続します。
注:多くの現代のレーザーはまたレーザータイミングを出力する。これらのレーザーの場合、フォトダイオードは必要ありません....
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結果
FRET-FLIMセンサは、神経変調に関与するcAMP/PKA経路を含む多くの異なるシグナル伝達経路の可視化を可能にします。現在のプロトコルは、最近開発されたtAKARαセンサを2pFLIMと組み合わせて利用して、頭部固定振る舞いマウスにおけるPKA活動を可視化する。図 1に示すように、既存の 2 フォトン 顕微鏡のほとんどは、3 ~ 4 つのコンポーネントを追加することで、2pFLIM 機能を使用してアップグレードできます (セクション 1 も参照)。2pFLIM取得画像でFRETを可視化するために、平均寿命の定量は、ピクセル当たり収集されたフォトンタイミングのヒストグラムプロットで行った(図3A,B)。平均寿命は、PKA活性化が寿命の低下につながるので、高い(コールドカラー)と低(暖色)平均寿命がそれぞれ低いと高いPKA活動を表す擬似色の画像を使用して視覚化された。SPC 範囲を正しく設定するには注意が必要です。この.......
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ディスカッション
このプロトコルは、頭固定振る舞いマウスにおける神経変調誘発PKA活性を可視化するためにFRET-FLIMセンサtAKARαの使用を示す。このアプリケーションは、得られたFLIM信号が生理的神経調節イベント17に関連していることを実証するために、vitroおよびインビボにおけるtAKARαの広範な試験および特性に基づいている。ここでは、生体内アプリケーションの1つは、運動皮質における移動誘発PKA活性、脳にセンサを送送るための手順、イメージングのための動物手術、行動および画像データ取得のためのハードウェアおよびソフトウェア要件を記述するために使用される。、およびイメージングデータ分析のためのソフトウェアとアルゴリズム。
tAKARαセンサは、DNAプラスミドのIUEまたはAAV粒子の立体注射によって皮質に導入される。エレクトロポレーションパラメータおよびDNA濃度に応じて、IUEは皮質25の比較的大きな領域にわたって皮質ニューロンの様々な標識密度をもたらす。IUEを用いて標識された皮質層は.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
テス・J・ラマイヤー氏、ルース・フランク氏、マイケル・A・ムニアック博士に対し、編集とコメントをいただき、2pFLIM買収ソフトウェアを提供するマックス・プランク・フロリダの安田良平博士に感謝します。この作品は、2つのBRAINイニシアチブ賞U01NS094247(H.ZとT.M.)とR01NS104944(H.ZとT.M.)、R01助成金R01NS081071(T.M.)、およびR21グラントR21NS097856(H.Z.)によってサポートされました。すべての賞は、神経障害と脳卒中の国立研究所からされています, 米国.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 酢酸セルロースシリンジフィルター | Nalgene | 190-2520 | ステップ 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA 水浸対物レンズ | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3ピンケーブル | USデジタル | CA-MIC3-SH-NC | ステップ2.5。回転センサーを顕微鏡のDAQ入力に接続するには |
| アルミニウムブレッドボード | ThorlabsMB1012 | ステップ2.5。 | |
| AnimalTracker MATLABソフトウェア | N / A | N / A | 2.5およびセクション5 - 6。筆頭著者の |
| バンドパスバリア | フィルターChroma | ET500-40m | ステップ1.4 |
| ケージプレート | Thorlabs | CP01 | ステップ2.4。 |
| マイクロドリル用回転センサー炭素鋼バレット、先端径0.5mm | FST | 19007-05 | 、ステップ3.2.3、4.4 |
| 円形カバースリップ(直径5 mm) | VWR | 101413-528 | ステップ4.5。 |
| カスタムメイドの注射ニードルホルダー | N/A | N/A | ステップ 3.2.4.技術的な詳細は、筆頭著者の |
| 歯科用アクリル | ェーツモトロイド | 44114 | ステップ4.3.および4.5 |
| 歯科用ドリル;Microtorque ii | Ram製品 | 66699 | ステップ3.2.3.および4.4。 |
| ダウシル透明ポリマー | ダウケミカル | カンパニー3-4680 | ステップ4.5。人工硬膜 |
| エレクトロポレーション電極 | Bex | LF650P5 | ステップ 3.1.4. |
| エレクトロポレーター | Bex | CUY21 | ステップ 3.1.4. |
| 高速グリーンFCF | シグマ-アルドリッチ | F7258-25G | ステップ3.1.1。 |
| FLIMimage MATLABソフトウェア | N/A | N/A | セクション5.安田良平博士、マックスプランクフロリダ |
| FLIMview、MATLABソフトウェア | 、N/A | N/A | 、セクション5、6から提供されました。主著者にリクエストに応じて提供されます |
| フォーム対応のり (ゴリラホワイトグルー) | ゴリラ | 5201204 | ステップ2.3。 |
| ヘッドプレート | N/A | N/A | ステップ 4.3.技術的な詳細は、要求に応じて筆頭著者に提供されます |
| ヘッドプレートホルダー | N/A | N/A | ステップ2.6。技術的な詳細は、要求に応じて提供され、筆頭著者は、取り付けポストブラケットと直角ブラケット油圧 |
| マイクロマニピュレータ | Narishige | MO-10 | ステップ3.2.4 |
| Krazyのり | Krazyのり | KG82648R | ステップ4.3。シアノアクリレートベースの接着剤 |
| 低騒音高速光電子増倍管 | 浜松 | H7422PA-40 または H10769PA-40 | ステップ 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | 、ステップ 2.6、セクション 5、6。顕微鏡取得およびデータ分析ソフトウェア |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4 |
| モータースピード | コントローラーElenker | EK-G00015A1-1 | 2.5。 |
| 電動マイクロマニピュレーター | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| 取り付けベース | ThorlabsBA1S | ステップ2.5。PH4およびTR2 | |
| 取り付けポスト | Thorlabs | P14 | ステップ2.6と組み合わせてモーターおよびセンサーのポストに使用されます。PB2 |
| マウンティングポストベース | Thorlabs | PB2 | Step 2.6 と組み合わせてヘッドプレートホルダーポストに使用します。P14 |
| 取り付けポストブラケット | Thorlabs | C1515 | ステップ2.6と組み合わせてヘッドプレートホルダーポストに使用されます。ライトアングルブラケットとヘッドプレートホルダー、 |
| オプティカルポスト | Thorlabs | TR2 | Step 2.5と組み合わせて使用します。BA1SおよびPH4 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Ν/Α | Ν/Α | ステップ 3.2.2.プロトコル:コールドスプリングハーバープロトコル2006、doi:10.1101 / pbd.rec8247 |
| フォトダイオード | Thorlabs | FDS010 | ステップ1.2。 |
| フォトンタイミングカウンティングモジュール | ベッカーとヒックル | SPC-150 | ステップ1.1。 |
| プラスミド:tAKAR&α;(CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | ステップ 3.1.3. |
| ポスト | ホルダーThorlabs | PH4 | 2.5。BA1SおよびTR2と組み合わせてモーターおよびセンサーのポストに使用 |
| 直角ブラケット | Thorlabs | AB90 | ステップ2.6 取り付けポストブラケットおよびヘッドプレートホルダーと組み合わせて使用 |
| 回転エンコーダ | USデジタル | MA3-A10-250-N | ステップ2.4。 |
| ラバーマット | キャ | B01DCR5LUG | ステップ2.1。 |
| シャフトカップリング(1/4インチ×1/4インチ) | McMaster | 6208K433 | 2.3.および2.4。 |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab / Vidrio Technology | N / A | ステップ5.9.および6.1。 |
| シグナルスプリッター | ベッカーとヒックル | HPM-CON-02 | ステップ1.3.1。 |
| ステンレス製アクスル(直径1/4インチ、L = 12インチ) | マク | マスター1327K66 | ステップ2.3。 |
| Stereotaxic alignment systemtsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified;サッターマイクロマニピュレーター、カスタムメイド注射針ホルダー、油圧マイクロマニピュレーター |
| 2光子顕微鏡 | N/A | N/A | Section 5.HHMIジャネリアリサーチキャンパス(https://www.janelia.org/open-science/mimms)のモジュール式in vivo多光子顕微鏡システム(MIMMS)に基づいて構築 |
| Vetbond組織接着剤 | 3M | 14006 | 3.2.6。 |
| ウイルス: tAKARα(AAV2/1 hSyn-tAKAR&α;-WPRE) | Addgene | 119921 | ステップ 3.2.2. |
| ホワイトPEフォームローラー(8インチ×12インチ) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | ステップ 2.1.1. |
| 白いポリスチレンFOMボール半分 | GrahamSweet | 200ミリメートル2中空半分 | ステップ2.1.1。 |
| ジップキッカー | PACER | PT29 | ステップ 4.3.硬化促進剤 |
参考文献
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sa....
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