生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

神経変調は、遅いシナプス伝達としても知られており、ストレス、覚醒、注意、移動1、2、3、などの異なる行動状態の間に脳機能を強力に制御します。^4.その重要性にもかかわらず、神経調節イベントがいつどこで起こるかの研究はまだ初期段階にある。アセチルコリン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、および多くの神経ペプチドを含む神経調節剤は、Gタンパク質結合受容体(GPCR)を活性化し、その結果、広範囲のタイムスケールの広いウィンドウを持つ細胞内第2のメッセンジャー経路をトリガーする秒から時間まで。各ニューロモジュレータは、シグナル伝達イベントの明確なセットをトリガするが、cAMP/タンパク質キナーゼA(PKA)経路は、多くのニューロモジュレータ1、5のための共通の下流経路である。cAMP/PKA経路は、神経興奮性、シナプス伝達、可塑性6、7、8、9を調節し、したがって、ニューロンネットワークダイナミクスを調整する。異なるニューロンまたはニューロンタイプが異なるタイプまたはレベルのニューロモジュレーター^受容体10を発現するので、同じ細胞外神経調節剤の細胞内効果は異なるニューロン間で不均一であり、したがって、細胞分解能で研究。今日まで, 行動中に生体内の個々のニューロンの神経調節イベントを監視することは困難なまま.

神経変調の時空間ダイナミクスを研究するには、適切な記録モダリティが必要である。微小透析および高速スキャン環状ボルタンメトリーは、神経調節剤の放出を研究するために頻繁に使用されるが、それらは細胞事象11、12を監視する空間分解能を欠いている。集団^{イメージング13}におけるニューロン電気活動のプロキシとして使用されているカルシウムダイナミクスに類似して、PKAイメージングは、細胞分解能でニューロン集団全体の神経調節イベントを読み出すために使用されてもよい。本プロトコルは、動物の行動中に生体内でPKA活動を監視するために改良されたA-キナーゼ活動レポーター(AKAR)の使用について説明する。ここで説明する方法は、生理的神経調節的事象を追跡する時間的分解能を有する細胞内分解能でニューロン集団の同時イメージングを可能にする。

Akarsは、PPKAリン酸化基質ペプチドおよび基質14、15のリン酸化セリンまたはスレオニンに結合するフォークヘッド関連(FHA)ドメインによって連結されたドナーおよび受諾蛍光タンパク質から構成される。PKA経路の活性化に際して、AKARの基質ペプチドがリン酸化される。その結果、FHAドメインはリン酸化基質ペプチドに結合し、それによって2つの蛍光体を近接させ、AKARの閉じた状態と呼ばれる。リン酸化AKARの閉じた状態は、ドナーとインセプター蛍光体との間のフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)の増加をもたらす。リン酸化ALEVELの割合はPKA活性16のレベルに関連しているので、生体試料中のFRETの量は、PKA活性16、17、18^{のレベルを定量するために使用することができる。19、20}.

AAKAの初期のバージョンは、主に2色比比^{イメージング14}用に設計されました。脳組織をより深くイメージングする場合、レシオメトリック法は波長依存性光散乱17、18、21による信号歪みに苦しむ。以下に説明するように、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、FLIMがドナー蛍光素18、21によって放出される光子のみを測定するので、この問題を排除する。その結果、FRETのFLIM定量は組織深^度17の影響を受けない。また、アクセプター蛍化素子の「暗い」(すなわち、低量子収率[QY])変異体を使用することができる。これは第2のセンサーまたは形態マーカー17、19、20の同時イメージングを介して直交神経特性の多重測定を容易にするために色チャネルを解放する。

FLIMイメージングは、蛍光素子が励起状態で過ごす時間、すなわち、蛍光^寿命18を定量化する。蛍光素が地上状態に戻ると、励起状態の終わりは、しばしばフォトンの放出と共に起来する。個々の励起分子に対する光子の放出は確率的であるが、集団においては平均蛍光寿命がその特定の蛍光素の特徴である。蛍光色素の純粋な集団が同時に興奮すると、得られた蛍光は単一の指数関数的崩壊に続く。この指数関数的減衰の時間定数は、蛍光タンパク質の平均蛍光寿命に相当し、通常は蛍光タンパク質の1〜4ナノ秒の範囲である。興奮したドナー蛍煙症の地上状態への復帰は、FRETによっても起こりうる。FRETの存在下では、ドナー蛍光の寿命が減少する。非リン酸化AkaRは、比較的長いドナー蛍光寿命を示す。PKAによるリン酸化時に、ドナーとインセプター蛍光体が互いに近づき、FRETが増加するため、センサの寿命が短くなります。したがって、AkaRの集団における蛍光寿命の定量は、PKA活性のレベルを表す。

AAKAの初期のバージョンは、単一細胞分解能での生体内イメージングにうまく使用されていません。これは主に生理的^活性化17に対するAKARセンサの低信号振幅によるものです。近年、2光子蛍光寿命撮像顕微鏡(2pFLIM)に利用可能なAKARセンサを系統的に比較することにより、FLIM-AKARと呼ばれるセンサが代替センサを上回ることがわかった。さらに、微小管(tAKARα)、シトゾール(tAKARβ)、アクチン(tAKARδ)、フィラメントアクチン(tAKARε)、膜(tAKARγ)、特定の細胞下の場所でのPKA活性を可視化するために、標的AkaR(tAKARγ)と呼ばれる一連のFLIM-AKAR変異体が開発されました。ポストナプティック密度(tAKAR)。タカーの中で、tAKARαはノルエピネフリンによって引き起こされた信号振幅を2.7倍増加させた。これは、ニューロン中のPKAの大部分が安静状態22,23の微小管に固定されているという知識と一致している。tAKARαは、2pFLIMの既存のAAKAの中で最高のパフォーマーでした。さらに、tAKARαは、複数の神経調節剤によって引き起こされた生理学的に関連するPKA活性を検出し、およびtAKARαの発現は神経^機能17を変化させなかった。

最近、tAKARαは、頭部固定振る舞い^マウス17におけるPKA活性の可視化に成功した。強制移動は、運動、バレル、および視覚皮質における表面層ニューロン(層1~3、ピアからの約300μmの深さまで)の相馬におけるPKA活性を引き起こしたことが示された。移動誘発PKA活性は、β-アドレナリン受容体およびD1ドーパミン受容体を介したシグナル伝達に部分的に依存していたが、D2ドーパミン受容体拮抗薬の影響を受けなかった。この研究は、2pFLIMを用いて生体内の神経変調イベントを追跡するタカーの能力を示す。

現在のプロトコルでは、強制移動パラダイム中の頭部固定覚醒マウスにおけるPKA活性イメージングの方法全体を6つのステップで説明する。まず、従来の2光子顕微鏡に2pFLIM機能を添加する(図1)。第二に、電動トレッドミルの建設(図2)。第3に、DNAプラスミドの子宮エレクトロポレーション(IUE)、またはアデノ関連ウイルス(AAV)の立体注射によるマウス皮質におけるtAKARαセンサの発現。IUE 24、25^およびウイルス^粒子26の立体注射のための外科のための優秀なプロトコルは、以前に公開されている。使用した主なパラメータを以下に説明します。前に、頭蓋の窓のインストール。優れたプロトコルは、頭蓋窓^{手術27、28}のために以前に公開されています。標準プロトコルから変更されたいくつかの手順について説明します。第5に、生体内2pFLIMで行う。6番目に、2pFLIM画像の解析(図3および図4)。このアプローチは、他の多くのヘッド固定行動パラダイムおよび脳領域に容易に適用されるべきである。

ここに記載されているすべての方法は、オレゴン州立保健科学大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 2pFLIM顕微鏡セットアップ

1. フォトンタイミング計数モジュール(PTCM、材料表)を取り付け、製造元のマニュアルに従ってコンピュータ(図1)に接続します。
   注:PTCM は、通常、レーザー パルスタイミングの「同期」入力と光増倍管(PMT)からのフォトン入力を受信するコンピュータボードです。また、2光子イメージング制御ソフトウェアからピクセル、ライン、フレームのクロックタイミングを受信します。PTCM はクロック信号を使用して、個々のフォトンを異なるピクセルとフレームに分離します。
2. レーザータイミングを測定するために>200 MHz帯域幅を持つフォトダイオードを追加します。光路に標準のガラスカバースリップを配置し、光路に垂直に配置されたフォトダイオードにレーザー光の小さな一部を反射します(図1)。フォトダイオード出力をPTCMの「同期」入力に接続します。
   注:多くの現代のレーザーはまたレーザータイミングを出力する。これらのレーザーの場合、フォトダイオードは必要ありませんし、レーザータイミング出力をPTCMの同期入力に直接接続することができます。
3. TAKARαの場合、緑色チャネルPMTを低ノイズで高速なGaAsP PMT(図1)と交換します。PMT 出力を PTCM の信号入力に接続します。
   1. 従来の2光子イメージングチャネルを介した強度の同時集録が望ましい場合は、任意信号スプリッタ(図1)を追加する。PMT出力を信号スプリッタに接続し、スプリッター出力をPTCMおよび従来の2フォトンイメージングモジュールに接続します。
      注:GaAsP PMTは、従来のバイアルカリPMTよりも高速な単一光子信号を提供し、フォトンタイミングをより正確に決定することができます。GaAsP PMTの特定のモデルは、周囲温度以下の10−35 °Cに冷却することができ、暗いカウントの抑制を毎秒数百以下のレベル(通常は≤200カウント/秒)にすることができます。ノイズフォトン数は蛍光寿命曲線を簡単に区別または減算できないため、この低ノイズレベルは蛍光寿命の正確な測定に重要です。
4. インセプター蛍光素からのスペクトル汚染を最小限に抑えるバンドパス蛍光発光フィルタを追加します。例えば、tAKARαの場合、緑色チャネルに対する500nm±20nmバリアフィルタは、暗い(QY〜0.07)黄色蛍光タンパク質(YFP)29、30であるアクセプタsREAChからの汚染を低減するために使用される。個々のイメージピクセル、ライン、フレームのクロックなどのタイミング信号を、制御ソフトウェアに適宜接続し、PTCM ユーザーマニュアルに記載されています。適切なデータ制御および取得ソフトウェアをインストールします。
   注:一部の PTCM メーカー (材料の表)は、2pFLIM イメージング用のソフトウェアを提供しています。ここでは、安田研究室(マックスプランクフロリダ州、パーソナルコミュニケーション)によって開発されたFLIMimageと呼ばれるカスタムソフトウェアを使用しています。このソフトウェアは、特定の2光子取得ソフトウェア(材料の表)へのアドオンユーザー機能として機能します。2光子イメージング中に適切なタイミングでPTCMを制御し、通信し、2pFLIM画像を取得します。

2. 電動トレッドミルの建設

注:カスタム構築された電動トレッドミルの設計を図2に示します。

1. 細かいハックソーで長さ150mmに泡ローラー(Ø = 200ミリメートル)をカットします。または、泡のボールの2つの半分を一緒に接着し、縫い目の上にテープを置きます。必要に応じて、ローラーのプロファイルを持つゴム製マットを接着して、ローラー上のトラクションを高めます。
2. ローラーの平らな側でローラーの中心を通して1/4インチの直径の穴をドリルするか、泡ボールを使用する場合は、ボールの各半分の中央を通して1/4インチの直径の穴をドリルします。
3. 穴を通して1/4インチの直径の鋼鉄軸を取り付けます。泡互換の接着剤を使用して、泡ローラー/ボールを車軸に接着します。必要に応じて、2 つのフレキシブル シャフト カップリング (1/4 インチ内径) を変更して、車軸をフォーム ローラー/ボールに結合させます。
   注:多くの一般的な接着剤は、泡を溶解する可能性があることに注意してください。
   1. シャフトカップリングごとに、シャフトカップリングを平らな側と長方形の金属板の中心(0.7 mm x 15 mm x 76 mm)に配置します。プレートをシャフトカップリングに溶接します。プレートの中央に1/4インチの穴を開けて、軸に変更されたシャフトカップリングを取り付け、2つのネジ穴を中心から金属板に取り付けます。
   2. シャフトカップリングを泡ローラー/ボールに対して車軸に取り付けます。後者を使用する場合は、ボールの曲率に合わせてプレートを少し曲げます。ネジを横の穴に入れて、車軸のローラー/ボールを固定します。
4. ケージプレートの中央にある3/8-32スレッドをドリルアンドタップし、ロータリーエンコーダを取り付けます。直角モータブラケットの底部にネジ穴を開けて、モーターをポストホルダーに取り付けることができます。フレキシブルシャフトカップリングを使用して、ロータリーエンコーダとモータの両方を車軸の端に取り付けます。
5. モーターとロータリーエンコーダのポストを使用して、組み立てられたトレッドミルをアルミ製のブレッドボードに取り付けます(図2)。モータ入力をスピードコントローラに接続し、ロータリーエンコーダ出力をコンピュータデータ集録(DAQ)ボードのアナログ入力に接続します。
   注:回転角速度は回転エンコーダによって電圧としてエンコードされ、MATLABで書かれたAnimalTrackerと呼ばれるカスタムソフトウェアを使用してデジタル化されます。
6. ヘッドプレート互換ホルダーを直角ブラケットに取り付けます。トレッドミルの前のパンプレートにソリッドポストを取り付け、組み立てられたヘッドプレートホルダーをポストに直角ブラケットで取り付けます(図2)。ヘッドプレートホルダーバーが車軸に揃っていることを確認し、マウスがトレッドミル上で適切で快適な歩行位置を採用できるようにします(図2C)。

3. マウス皮質におけるtAKARαセンサの発現

1. 子宮エレクトロポレーションで
   1. プラスミドDNA(3−4 μg/μL;CAGプロモーター、センサー配列、およびウッドチャック肝炎ウイルスを含むセンサ構造)に高速緑色色素の最終濃度0.2%を加えることで、IUEのDNA溶液を調べ転写後応答性要素[WPRE]翻訳エンハンサー)を水またはトリス-EDTAに溶解/希釈した。
   2. E16²⁴でIUE用の時系列妊娠メスマウス(例えば、C57BL/6)を準備する。イソムランでマウスを麻酔する(誘導は4%、メンテナンスは1.5%、CO2は95%O2で)、5mg/kgメロキシカムと4mg/kgブピバカインを含む周生手術鎮痛薬の皮下注射を行う。メスとハサミで腹腔を切り、慎重に子宮の角を露出させます。
   3. 前述の24.1半球の横心室に胚当たり1μLのDNA溶液を注入する。
   4. 正極末脚を皮質に置き、エレクトロポレーターで1Hzで5つの100ミリ秒角パルス(38V)を使用して皮質ニューロンに対して定期的なIUE²⁴を実行します。
      注:異なる皮質領域は、横心室に対する電極端足の配置を変更することによって、エレクトロポレーションの標的とすることができる。
2. 立体注射
   1. 立体^手術26の出生後30日目にマウスを準備する。ステップ3.1.2.に記載されているマウスを麻酔し、5mg/kgカルプロフェンを含む周生手術鎮痛薬の皮下注射を適用する。
   2. 希釈AAV血清型2/1(AAV2/1)を、シリンジ濾過(0.2 μmセルロース酢酸膜)で経験的に決定されたチター(~1 x 10 9-1 x¹⁰ゲノム/μL)にhSyn-tAKARα-WPREを発現する希釈AAV血清を発現させる。
   3. モーター皮質の次の座標で立体顕微鏡下でハンドヘルドドリルを使用して約500μmの直径穴をドリルします:0.5mm前からブレグマ、1.2mmの横から中線まで。
   4. インジェクター(例えば、油圧マニピュレータ、カスタムメイドのプランジャー/ガラスピペットホルダー付き)を電動マニピュレータに取り付けます。ブレグマラムダ平面に対して、注射針を 15° の角度で配置します。700 μm と 200 μm の進行に相当する X 軸と Z 軸を横切る対角線上の動きを、前部後軸と背部腹部軸に沿ってそれぞれプログラムします。
      注:目的の撮像場の真上の組織への損傷を避けるために、AAV粒子はブレグマラムダ平面に対して相対的な角度で注入される。
   5. ドリル穴の中央に注入針の先端を位置付けし、上述の対角線運動(約25μm/s)をゆっくりと実行します。この手順では、注入の中心を 1.2 mm 前から 1.2 mm、中間線に 1.2 mm、ピアの下に 0.2 mm の位置に配置します。
   6. 希釈ウイルス粒子の20 nLを注入する(〜10 nL/分)。少なくとも10分待ってから、注射針をゆっくりと引き込みます(~12.5 μm/s)。
   7. 立体注射手順を終了し、^皮膚26を接着/縫合する。

4. 頭蓋窓の設置

1. 出生後30日目から60日目の間に、IUE(セクション3.1)またはウイルス粒子の立体注射(セクション3.2)を介してtAKARαを発現するマウスに対して頭蓋窓の配置を行う。ウイルス粒子に感染したマウスの場合は、ウイルス注射後少なくとも2週間後に頭蓋ウィンドウを実装する。前述の^27,28に従って頭蓋ウィンドウをインストールします。ステップ3.1.2.に記載されているマウスを麻酔し、4mg/kgで末限手術鎮痛薬0.075mg/kgブプレネックスおよび抗炎症剤デキサメタゾンの皮下注射を適用する。
2. 骨膜を取り除き、首の筋肉を引き込みます。手術後の頸部の筋肉の露出を避けるために、組織接着剤で頭蓋骨に皮膚の端を接着します。
3. 乾燥し、メスを使用して穏やかに掻き取ることによって頭蓋骨から任意の骨膜を削除します。イメージング ヘッドプレート (内径 8 mm) を配置して、目的のイメージング フィールドを囲みます。シアノクリレートベースの接着剤を使用して頭板を頭蓋骨に接着し、その後に歯科アクリルセメントを貼ります。最適な接着を実現するには、ヘッドプレートが露出した乾燥した頭蓋骨の上にあることを確認します。接着剤加速器は、硬化を加速するために使用することができる。
4. 歯科ドリルを使用して、目的のイメージングフィールド(ステップ3.2.3で指定された座標)の上に直径5mmの円を描き、デュラ母校を露出させます。
5. 透明なポリマーの薄い層(人工硬膜とも呼ばれる)をデュラ表面に塗布し、頭蓋全体を覆います。ポリマーは、デュラ母体を保護し、安定化します。無菌の円形カバースリップ(直径5mm)をデュラ母子に置きます。窓の縁の周りに塗布されたシアノクリレート接着剤でカバースリップを固定し、その後に歯科アクリルセメントが続きます。

5. 生体内2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡検査

1. 頭蓋窓の設置後2週間以内に2pFLIMイメージングを開始する(セクション4)。イメージング研究の開始前にマウスを頻繁に取り扱い、スクラッフィングすることにより、ストレスによる実験干渉を最小限に抑え、マウスを習慣化します。
2. 2 フォトン励起レーザー波長を、2 フォトン レーザーを制御するソフトウェアを使用して 960 nm に設定します。
3. 4%イソファランを用いてマウスを麻酔する。テールピンチと呼吸数の観察によって適切な麻酔を確認します。つまり、テールピンチに対する応答がなく、呼吸数を毎秒約1呼吸に減らす必要があります。不必要な手続き時間を最小限に抑え、麻酔は2〜3分間しか持続しないため、目の潤滑剤は使用されません。
4. 麻酔マウスを電動トレッドミル(図2C)に移し、マウスのヘッドプレートをトレッドミルセットアップのヘッドプレートホルダーに取り付けます(詳細は図2を参照)。70%のエタノールでマウスの頭蓋の表面をきれいにします。
5. 2pFLIMの目的の下に取付けられたマウスとモーターを備えたトレッドミルを置きます。頭蓋の窓カバースリップと目的の間に蒸留水の滴を適用します。
6. 取り付けられたマウスが麻酔から目を覚まし、少なくとも10分間トレッドミルと顕微鏡環境に順応し、取り付けられたマウスが麻酔から目を覚ます間、マウスの呼吸速度を監視します。
7. エピイルミネーションの下の射出位置に移動します。その後のイメージングセッション中に、同じ領域(ROI)のイメージングを支援するために、ブライトフィールドの下に受託者の特徴(すなわち、血管)を文書化します。
8. 脳組織から放射された光以外の入光を除去します。エピイルミネーション光源の電源をオフにし、2pFLIM リグのエンクロージャを閉じます。ハードウェアコマンド電圧制御をオンにして、2pFLIM PMTをアクティブにします。
9. 覚醒マウスにおけるtAKARα陽性ソマタをイメージングするための以下の推奨設定で、2pFLIM取得ソフトウェアFLIMimageを用いてZスタック2pFLIM画像を取得する。フレーム平均を 3 フレームに設定し、スキャン速度を 2 ミリ秒/ライン、イメージ サイズを 128 x 128 ピクセル、視野を 90−100 μm に設定します。準備とハードウェア構成に基づいてイメージング設定を調整します。
10. FLIMviewで取得した画像を検査します(社内で開発されたカスタムソフトウェア、セクション6を参照)。ステップ5.9に従ってイメージング設定を調整して、フォトン数を最適化し、光白離を最小限に抑えます。
    注:生体内のtAKARα陽性ソマの生涯イメージングのためのROIにおける実行可能な統合光子数は、特定の刺激から生じる信号振幅に応じて~1,000−10,000光子である(議論参照)。
    1. 必要に応じて、視野の縮小、スキャン速度の低下、レーザーパワーの向上、平均化するフレーム数の増加を使用して、統合されたフォトン数を増やし、寿命推定誤差を減らします。同時に、光漂白を最小限に抑えるために、最小限の必須レーザーパワー、フレーム平均、およびスキャン速度を使用してください。
11. ステップ5.10で決定した設定を用いてZスタック集録を繰り返すことにより、一定の時間間隔(例えば、30−60秒毎)の画像。トレッドミル速度ゼロで少なくとも15分間ベースライン2pFLIM画像を取得します。
12. トレッドミルの回転速度を2pFLIM画像を取得しながら、15分間~15cm/sに設定します。トレッドミルの回転をオフにした後、≥20分間イメージングを続け、強制移動の停止後のPKA活性の持続時間を評価する。

6. 2pFLIM画像の解析

1. FLIMviewで取得したイメージを開き、FLIMview で次のパラメータを設定します。
   注:パラメータの詳細については、ディスカッションで説明します。
   1. FLIMview の単一フォトンカウント (SPC) の最小範囲フィールドと最大範囲フィールドをクリックします。適切な最小 SPC 範囲値と最大 SPC 範囲値 (通常は 1.2−2 ~ 10-12 ns) を入力します。
   2. FLIMview の t₀値フィールドをクリックし、t₀値 (通常は ~2 ns) を入力します。FLIMview の有効期間輝度最小しきい値フィールドをクリックし、必要なしきい値を 5-30 フォトンに入力します。
2. 新しいグループボタン (N)をクリックし、実験グループ名を割り当てます。これにより、追加された各 FLIM イメージのデータを結合するグループが生成されます。
3. FLIMviewのRoiコントロールモジュールのROIボタンをクリックし、tAKARα陽性ソーマの周りにROIを描画します。FLIMviewのZスタックコントロールスライダの下限と上限を移動してZスタック範囲を小さくし、他のz深さのバックグラウンドフォトンからの信号汚染を最小限に抑えます。
4. +ボタンをクリックして、グループに FLIM イメージを追加します (ステップ 6.2)。Calcボタンをクリックして、ROI と寿命推定誤差 (δτ) の平均寿命 (LT、平均フォトン放出時間 [MPET] とも呼ばれます) を計算します。
5. 慢性的な 2pFLIM イメージング シリーズの次のファイルを開きます。手順 6.4 を繰り返します。時間の経過とともに組織がドリフトする可能性があるため、ROI および Z スタック範囲の位置を調整して、時間の経過と同じ tAKARα 陽性ソーマを測定してください。
6. グループコントロールモジュールのドロップダウンメニューでデルタMPET/MPET₀を選択します。ベースライン#フィールドをクリックし、インデックス(es)を入力します(例えば、ステップ6.3で作成されたグループ内の最初の5つの画像に対して1 2 3 4 5)。これは、ベースラインの有効期間 (LT 0) の計算に使用されるイメージを定義します。
7. プロットをクリックすると、定義されたROIでの実験中にtAKARαのFLIM応答(ΔLT/LT₀₎を含むグラフが生成されます。対応するベースライン寿命(LT₀₎による個々のROIの有効期間(ΔLT)の正規化された変化により、異なるROI間の移動中のPKA活性を比較することができます。

FRET-FLIMセンサは、神経変調に関与するcAMP/PKA経路を含む多くの異なるシグナル伝達経路の可視化を可能にします。現在のプロトコルは、最近開発されたtAKARαセンサを2pFLIMと組み合わせて利用して、頭部固定振る舞いマウスにおけるPKA活動を可視化する。図 1に示すように、既存の 2 フォトン 顕微鏡のほとんどは、3 ~ 4 つのコンポーネントを追加することで、2pFLIM 機能を使用してアップグレードできます (セクション 1 も参照)。2pFLIM取得画像でFRETを可視化するために、平均寿命の定量は、ピクセル当たり収集されたフォトンタイミングのヒストグラムプロットで行った(図3A,B)。平均寿命は、PKA活性化が寿命の低下につながるので、高い(コールドカラー)と低(暖色)平均寿命がそれぞれ低いと高いPKA活動を表す擬似色の画像を使用して視覚化された。SPC 範囲を正しく設定するには注意が必要です。この範囲は、レーザーパルス間隔(例えば、80 MHzのパルスレートの12.5 ns)内に設定し、ハードウェアエッジアーティファクトを最小限に抑える必要があります(セクション6およびディスカッションも参照)。ROI内のPKA活性の計算は、所定のROI内のすべてのピクセルのLTを組み合わせて行った(図3C,D)。頭固定覚醒マウスでは、基礎寿命は1.3〜1.8ns(図3E)の範囲であった。頭固定覚醒マウスにおける運動皮質におけるtAKARαのイメージングは、基底および強制移動中の細胞分解能を有するPKA活性のリアルタイム定量を可能にした(図4)。実験は数日と数ヶ月にわたって繰り返すことができます。強制移動は、マウス運動皮質17の表面層内のニューロンの集団におけるPKA活性を引き起こす。このPKA活性は、βアドレナリンおよびD1受容体17の活性化を介した神経調節に依存する。

図 1: 2pFLIM システムの概略図。2pFLIMは、黄色の強調表示されたハードウェアコンポーネントを追加することにより、従来の2フォトン顕微鏡に実装することができます:フォトンタイミングカウントモジュール、低ノイズ高速フォトマルチプライヤチューブ(PMT)、フォトダイオード(レーザーが持っていない場合にのみ必要)レーザータイミングのための出力シグナリング)とオプションの信号スプリッタ。この図は Ma ら17から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:カスタムメイドの電動トレッドミルの設計。(A) トレッドミルデザインの回路図を正面(左上)、側面(右上)、上面(左下)から。トレッドミル(フォームボール)アクスルは、ロータリーエンコーダと固体アルミニウムパンプレート上の2つのポストに集合的に取り付けられたモーターに接続されています。直角ブラケットのヘッドプレート互換ホルダーは、ソリッドポストに固定され、トレッドミルの上に配置されます。スケマティック図面はスケーリングされません。前面(B) と側面 (C) トレッドミルの写真を表示します。トレッドミル上のマウスの適切な位置は、パネルCに示されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 2pFLIM データの定量化。(A) そのピクセル内のすべてのフォトンの平均寿命(LT)を表す各ピクセル擬似色の FLIM イメージ。(B) 単一ピクセル内のフォトン到着時間(パネルAの紫色の正方形)をヒストグラム(左パネル)にプロットした。積分境界は、単一のフォトン計数範囲(SPC、灰色)を決定するように設定された。SPC範囲内では、フォトンタイミングの積分をフォトンの総数で割り、t 0(1.65 ns、破線)で差し引き、平均寿命(LT、破線と点線間の距離)を1.74nsで引き算した。視野全体の平均寿命(パネルAの水色の正方形)の定量化は、すべてのピクセル(右パネル)で収集されたフォトンタイミングの統合を伴い、平均寿命は1.7nsでした。インセットは、半ログスケールで同じデータを表示します。(CおよびD)対象地域(ROI)あたりの平均寿命の定量化。(C) 2pFLIM画像の代表的な例。2つのROIは、運動皮質の層2/3の2つのソマタの周りに描かれた。(D) フォトンタイミング分布は、各ROI(左パネル)内のすべてのピクセルに統合されています。セルROIは、(パネルCに示すように)赤、セル1に示すように色分けされた。青、セル2。正規化されたフォトンカウントは、2つのROI間のフォトンタイミング分布を比較することができます(右パネル、平均寿命、セル1、1.33 ns;セル2、1.73 ns)。インセットは、半ログスケールで同じデータを表示します。(E)運動皮質の表在層における254の画像化された細胞からの平均基底寿命の分布プロット。L1細胞(n=186細胞/11匹、左パネル)は、ピア以下100μm以内に存在し、AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPREの立体注射後にtAKARαを発現し、L2/3ピラミッド細胞(n=68細胞/4匹、右パネル)、少なくとも150μm以下に存在する。CAG-tAKARα-WPREDNA構築物のIUE後にtAKARαを発現した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:tAKARαは、運動皮質における強制移動誘発PKA活性を追跡する。(A) 運動皮質中の3つのL1細胞の代表的な強度(左パネル)と寿命(中央および右パネル)画像。セル ROI は色分けされました: オレンジ、セル 1;青、 セル 2;黄色、セル3。(B)基底状態時にセル1(上パネル)で測定したフォトンタイミング分布(中央パネルΑで測定されたオレンジ色の微量)と強制移動(loco.、ライトオレンジトレース、右パネルAで測定)。 光子タイミング分布の直接比較が可能な正規化されたフォトン数(下部パネル、平均寿命:基底、1.72 ns;移動、1.42 ns)。インセットは、半ログスケールで同じデータを表示します。(C) Δ寿命/寿命0 (ΔLT/LT0)対応するセルのトレース (上パネル、パネルAを参照) を強制移動速度 (下パネル) で確認します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者は何も開示していない。