ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価

サマリー

これらのプロトコルは、皮質レンズの形態を分析するために開発された、固定および生きているレンズにおけるゼブラフィッシュレンズ縫合の構造的完全性、および前後部軸に沿ったゼブラフィッシュレンズ核の位置を測定する。

要約

ゼブラフィッシュは、遺伝子操作や生体内イメージングに適しており、逆遺伝子研究や in vivoイメージングのための transgenics の生成において、ますます普及しているモデルとなっています。これらのユニークな機能は、ゼブラフィッシュを眼レンズの開発と生理学を研究する理想的なプラットフォームにします。我々の最近の知見は、アクアポリン-0, Aqp0a は、前眼レンズ縫合の安定性のために必要なだけでなく、加齢に伴うレンズ中心へのレンズ核のシフトのために、ゼブラフィッシュレンズの特性を分析するのに適したツールを開発することに導いた。ここでは、幼虫と成体の両方のレンズに適用することができるレンズ解離の詳細な方法を概説し、組織学的分析、免疫組織化学および画像化のためにそれらを準備する。私たちは、レンズ縫合糸の完全性と皮質細胞の形態の分析に焦点を当て、遺伝子組み換えゼブラフィッシュによって可能になったレンズ形態のin vivoイメージングから得られたデータと解剖レンズから生成されたデータを比較する蛍光マーカーを符号化。軸方向に垂直に切開したレンズの分析により、前後部軸に沿ったレンズ核の相対位置を定量化することができます。初期の前方位置から中心へのレンズ核の移動は、成人ゼブラフィッシュにおける通常のレンズ光学に必要である。したがって、レンズ核位置の定量的測定値は、その光学的特性と直接相関する。

概要

ゼブラフィッシュは、哺乳類のレンズとの解剖学的類似のため、レンズ開発と生理学を研究するための優れたモデルであり、遺伝的および薬物操作の相対的な容易さ、胚眼の発達速度、小さなサイズおよび透明性初期段階では in vivoイメージングを可能にする。ここに記述された方法は、sutural 完全性、インビトロおよびインビボにおける皮質膜形態、およびレンズ核位置の位置に焦点を当てた胚性および成体期におけるゼブラフィッシュレンズ形態を分析するために開発した前後部軸ex 生体。これらの手法は、レンズの発達と生理機能に関する研究の開始点として、またゼブラフィッシュにおけるレンズの表現型についての逆遺伝スクリーンを提供する。

ゼブラフィッシュのレンズ形態の画像化

アクアポリン 0 (AQP0) は、最も豊富なレンズ膜タンパク質で、哺乳動物の複数の必須機能により、レンズの開発と明瞭性の両方にとって重要です。ゼブラフィッシュには2つの Aqp0s (Aqp0a と Aqp0b) があり、それらの機能の欠損を胚と成人の両方のレンズで分析する方法を開発しました。私たちの研究では、 aqp0a^/-変異体が前縫合線の不安定性による極性の前極性不透明度を発現し、 aqp0a/b二重変異体が核不透明度¹を発現していることが明らかになった。AQP0 は、水輸送²において役割を果たすことが示されており、接着性^3、4、細胞骨格固定⁵および屈折率勾配⁶の生成において、これらの研究は大部分で行われてきたインビトロ。ゼブラフィッシュは、Aqp0a や Aqp0b の機能の低下や摂動機能が、生きている水晶体の形態や機能にどのような影響を与えるかを研究する絶好の機会を提供します。開発中にレンズ細胞の形態および sutural の完全性を評価するために、我々は、胚および成体レンズでの使用のために既存のインビトロ免疫組織化法⁷を修飾し、そしてインビボでこのプロセスをモニターする transgenics を生成した.

原形質膜構造の免疫組織学的解析と sutural の完全性を、全固定胚と成体レンズで行った。ゼブラフィッシュレンズは、哺乳類と比較して非常に小さく (レンズの直径は約100μ m、成人では 1 mm まで)、公知ではほとんど捕捉されない点縫合線⁸を有する。したがって、sutural の完全性を分析するためには、全レンズが不可欠です。生体内での前縫合形成、精密レンズ細胞構造のイメージングにおいて、mApple 特異的に標識レンズ膜を発現する transgenics を生成した。

レンズ膜 transgenics のライブイメージングの利点は次のとおりです: 1) 固定アーチファクトの回避、2) タイムラプス映画の動的形態変化の研究、および 3) 以前のイベントを後で相関させることができる縦断的研究を可能にする表現。虹彩の色素沈着は、通常、レンズ周辺の鮮明な撮像を防止する。原基-5 (プリム-5) ステージ⁹の前に 1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU) を添加すると、約4日間 postfertilization (dpf) までのメラニン形成および眼の色素沈着を防止する。しかし、4つの dpf の後、レンズ周辺は、特に古い段階でインビボで不明瞭になる。さらに、レンズ自体の密度は、その後の極の画像化を覆い隠します。したがって、レンズ周辺の形態、または後縫合線を研究するために、4 dpf の後に、レンズを摘出し、固定する必要がある。

トランスジェニックゼブラフィッシュ線は、インビボ10における胚性レンズ膜構造を分析するために使用されてきた。Q01トランスジェニックとは、膜ターゲティング配列に融合したシアン蛍光タンパク質を発現し、Gap43、 EF1αプロモーターおよび hexamer によって駆動される DF4 pax6エンハンサーは、レンズ繊維細胞¹¹に遍在する。Q01は、主な関心がレンズである場合、バックグラウンドシグナルを追加する網膜のアマクリン細胞を含む、余分なレンズを持っています。私たちは、レンズに特に立体的な信号を避けることを目的として、膜連結された mApple を特異的に表現する新しいトランスジェニック線を開発しました。

レンズ nucleus ローカリゼーション

我々は、レンズ核が、幼虫ゼブラフィッシュにおける最初の前方の位置から、成人用レンズの前後部軸の中心位置に移動することを発見した。この高屈折率レンズ核の位置におけるこのシフトは、ゼブラフィッシュレンズ¹の正常な開発のための必要条件であると考えられる。レンズの半径に関しては、レンズ核集中化の定量化が可能です。この方法を用いて、Aqp0a がレンズ核中央¹に必要であることを示し、この簡便な方法は、ゼブラフィッシュモデルにおけるレンズの発達と生理学の他の研究に応用できる。

プロトコル

本研究で使用される動物プロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用のためのアルヴォステートメントに準拠しており、カリフォルニア大学アーバイン校の動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されています。

1. ゼブラフィッシュの飼育と安楽死

1. 標準的な実験室条件¹²の下でゼブラフィッシュ (AB ひずみ) を上げて維持します。胚培地 (EM)¹²で胚を上昇させる。0.003% の PTU を 20-24 h postfertilization (プリム-5 段階の前) から EM に添加して、胚期⁹での画像化に使用される胚¹²の色素形成を防止した。6-30 日 postfertilization (dpf) から 14 dpf までの食餌で幼虫を上げ、14個の dpf¹²の後に生きアルテミア。
   注意:PTU は非常に有毒
2. タッチに非応答するまで tricaine を使用して麻酔魚。
   1. 400の3アミノ安息香酸 acidethylester を 2.1 mL の 1 M トリス (tricaine) を 100 mL の ddH₂O で組み合わせて準備します。 pH 7.0 に調整し、-20 ° c で保存します。
      注意:Tricaine は有毒である。
   2. タンク水 100 mL の tricaine 株の 4.2 mL を麻酔の幼虫/成人に、または EM を麻酔胚 (0.0165% w/v で tricaine の最終濃度) に希釈した。

2. 胚と幼虫の固定

注:免疫組織化プロトコルは、以前公表された材料⁷から適応した。

1. Dechorionated の胚または幼虫を2週間まで postfertilization に固定し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4%(v/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を4° c で1晩ロッカーに入れます。
   注意:PFA は可燃性であり、発癌性です。
2. PBS で10分間、胚を3回洗浄し、10% トリトンおよび 1% DMSO (PBS-T) を4° c で一晩 PBS で透過処理した。
   注意:DMSO は有毒であり、摂取または皮膚吸収によって有害であり、皮膚を通して有害物質を運び、そして可燃性である。トリトンは有毒、腐食性、水生環境に危険である。

(3) 幼虫と成虫によるゼブラフィッシュレンズの解剖

1. 麻酔は、6つの dpf の幼虫から成人期まで tricaine を持ち、接触するまで反応しないが、依然として強い鼓動を示している。ステージング¹³の場合、シリング (2002) あたりの魚の標準の長さを測定します。
2. すぐに、マイクロ解剖はさみを使用して目を切除し、PBS の解剖皿に置きます (大人の目のために示されている図 2 )。
   1. レンズ解剖用のシリコーンを充填したカスタム 35 mm ディッシュを作成します。シリコーンが設定されると、切除中に成人の目/レンズを固定化するために、切り込みの直径が約 2-3 mm、深さが 0.5 mm になります。
3. 成人ゼブラフィッシュレンズの解剖
   1. 成人の目を、PBS で満たされた後側切り込み皿に置く。光学ディスクを通して < 45 °の角度で鉗子を挿入することによって目を固定する。ニックや、レンズを圧縮しないように注意してください。網膜と強膜を通して2つまたは3つの放射状の切開を、視神経乳頭を解剖はさみで毛様域に通してください。
   2. 花びらのように網膜と強膜をはがし、目を反転させ、角膜側を上にします。このような場合は、ハサミの平面で強膜や角膜の操作によって間接的にレンズを固定し、網膜を引き離し、組織を鉗子で固定します。余分なティッシュをレンズから慎重に切り取ってください。
      注:常に健康なレンズを得るためには、慎重に分析することが重要です。
4. 幼虫ゼブラフィッシュレンズの解剖
   1. 幼虫目を、PBS で満たされたシリコーン皿の平らな部分の上に置き、鋭利なタングステン針を使用して網膜と強膜を通してラジアルカットを行いながら、別のタングステン針または鉗子で目を固定化する。
      注:レンズを傷つけないように注意してください。
      1. ワイヤチップを 10%(w/v) NaOH に懸濁させることにより、0.1 mm タングステンワイヤ電解の 2 cm の長さの先端をシャープにし、低電圧交互電流¹⁴を適用する。ブンゼンバーナーを使用してガラス端を溶融させることにより、パスツールのピペットに針を固定します。
         注:代替の細かい解剖ツールも使用することができます。
         注意:NaOH は腐食性である。
   2. 針の鈍い側で解離した目からレンズをやさしくすくい出し、付着した組織を慎重に引き抜きます。

4. 切開したレンズの固定

1. 直ちに 1.5%(v/v) PFA 中の切開したレンズを室温 (RT) で24時間 PBS で固定する。PBS でレンズを3回、それぞれ10分間洗浄します。
2. 透過処理のための全体のマウント分析または cryoprotect のためのレンズを使用してください (セクション8を見てください)。
   1. 透過処理は、4° c で一晩 PBS-T でレンズを装着します。

5. レンズ免疫組織化学

1. ファロイジン-アレクサ Fluor 546 (1:200) および細胞核でのインキュベーションによる固定胚/幼虫または成人用レンズの標識膜 (1: 1000 5Mg/mL 株) を4° c で一晩 PBS にて培養した。
   注意:DAPI は、皮膚及び眼の刺激剤である。
2. PBS-T で3回、それぞれ10分間洗浄します。明確な組織を 30% でインキュベートすることにより、各 RT で少なくとも1時間、4° c で 50% および 70% のグリセロールを PBS-T (v/v) で、または一晩で培養する。
3. 70% のグリセロールで PBS-T (v/v) をガラス底 35 mm のマイクロウェルディッシュに平らにし、カバースリップに対してまっすぐにすることができます。若い魚のために、わずかな前方側面の傾きはカバースリップに平行であるためにレンズの縫合線を向けるのを助けるかもしれない。

6. ゼブラフィッシュ前レンズ縫合をインビボでトランスジェニック線を用いて分析する

1. Tol2 キット¹⁵を使用してTg (βB1cry: mAppleCAAX)ラインを生成します。Tol2 転移因子要素システム¹⁵は、mApple が発現し得た crystallin 配列によって膜に繋がれたヒトβB1-CAAX プロモーター¹⁶の 300 bp によって駆動されるコンストラクトの安定した統合を可能にする特にレンズ繊維細胞膜における。
   注:このコンストラクト (ID: 122451) は購入可能です。
   1. 注射の朝に、注入混合物を準備し、氷の上に維持します。DNase を含む10μ l の最終的な容量に達するためには、追加: 1.5 μ l の HuβB1mAppleCAAX:50 ng/μ l-[0.375-0.75 pg/最終注入] で、1.5 μ l の Tol2 トランスポゼース mRNA の 300 ng/μ l (Tol2 kit)¹⁵ [15-30 pg/最終注入]、1% w/v でのフェノールレッドインジケータの1μ l [1 x10^-5%(w/v)/final インジェクション]。
   2. 注射混合物の 50-100 pL を1細胞期胚¹²に注入する。
2. 3つの dpf で mApple 陽性レンズで胚の頻度を測定することにより、F0 注入胚の今後効率を測定します。
   注:この方法を使用して > 80% の今後効率を期待してください。F0 モザイクは個々の細胞の膜の形態の詳細な分析を可能にする。モザイクの様々なレベルは、1つの細胞の単一または小グループの形態をイメージすることができます, よりグローバルなレンズの表現は、インビボでのレンズ縫合のような多細胞構造の分析を可能にする.
3. Outcross F0 モザイク魚は、すべての繊維細胞膜にラベルを付け、安定したラインを生成します。細胞系列に統合されたトランスジーンを持つ F0 創始者は、トランスジェニック線として維持することができる安定した統合で子孫を生成します。

7. ゼブラフィッシュ前方レンズ縫合線をインビボで使用しての解析

1. 麻酔 3 dpf または成人モザイクまたは安定したトランスジェニック魚と、ガラス底部のマイクロウェルディッシュのカバースリップに対して眼を平らにした tricaine との 1% 低溶融アガロース (LMA) でのマウント。
   1. 1% の LMA を作るために 100 mL の EM (メチレンブルーなし) に LMA 1 g を溶解させます。4° c で 15 mL のストックとして長期保存してください。各チューブが使用されるまで、マイクロ波はストックを溶解し、42° c で保存します。
2. Tricaine の EM が付いている6つの dpf まで魚をカバーする、または LMA が設定されているとき大人のための tricaine が付いているタンク水と。
   1. PTU 処理された魚を画像化する場合は、250μ l の tricaine ストックおよび7μ l のメチレンブルーまたはタンク水なしで 5 mL の EM を混合してください。

8. レンズ Cryosectioning および免疫組織化学

1. Cryoprotect 固定された胚または大人のレンズは、PBS (w/v) で 10% スクロースに配置することにより、RT (または4° c で一晩) で1時間、4° c で 30% ショ糖において 20% のスクロースを有する。
2. 10月にベースモールドにティッシュを埋め込み、12-14 μ m で OCT Cryosection でチャックに固定し、Superfrost/プラス顕微鏡スライド上に集めます。スライドに10分間の暖かいセクションは ~ 35 ° c の prewarmed になります。
3. 各セクションを PBS で3回洗浄し、それぞれ10分間使用します。ファロイジン小麦粉 546 (1:200) と DAPI (1: 1000) または WGA-アレクサ小麦粉 594 (1:200) を用いて、3つの PBS 洗浄を行い、ラベルセクション。アンチフェードマウント媒体でマウントし、マニキュアでシールカバースリップ。

9. イメージング

1. 共焦点顕微鏡で画像を取得する。60x N/A 1.2 を使用して z スタックまたは光学スライスを取得する水浸対物レンズ、または類似の、前方から後方の水晶柱までの特定の領域で。次の取得設定を使用します。1.2 のエアリーディスク 561 nm レーザーを使用して、テキサス州の赤いフィルターファロイジンの小麦粉546か mApple、または DAPI のための紫外線フィルターが付いている405レーザー。
2. レンズに奥行きのある信号損失を打ち消すために、z 強度のレーザーパワーを補正します。これは固定および生きている3つの dpf の胚の後部の棒で強い信号および大人の魚レンズの赤道の光学スライスの強い信号を可能にする。
3. 画像処理ソフトウェアを使用して画像をコンパイルして表示します。

10. 前後部軸におけるレンズ核局在の測定

1. チェンバー底を有する 35 mm ディッシュで PBS の軸方向に新しく摘出したレンズは、焦点面に平行な極と縫合線を有する。レンズの核を識別するために、レンズの皮質とレンズの核の界面で通常発生する屈折率の違いを探します。
   注:健康な野生型の成人用レンズは非常に透明であり、レンズの縫合や核の確認、またはレンズの向きの決定が困難です。このケースでは、レンズカプセルに鉗子を持つわずかなニックは、小さな損傷を引き起こし、縫合糸とレンズの核の明らかに約10分で、この測定のためのレンズの向きを助けます。しかし、現在は損傷しているため、ダウンストリームアプリケーションではレンズが使用できなくなります。
2. カメラが取り付けられた解剖顕微鏡を使用して、DIC 光学系の有無にかかわらず明るいフィールド照明の下でレンズの核とレンズの画像を撮影します。キャリブレーションのために同じ倍率でマイクロメーターをイメージします。
   1. [ライブビュー] ボタンをクリックし、露出設定を調整してレンズの核とレンズ周辺部を視覚化し、[スナップショット] ボタンをクリックして画像を撮影します。Tif ファイルとして保存します。
   2. 画像処理ソフトウェアを使用して、取得したレンズ画像をキャリブレーションします。直線ツールを選択し、マイクロメータ画像に既知の長さの線を引き、[解析] をクリックします。 |スケールを設定します。[既知の距離]、[単位] を入力し、[グローバル] キャリブレーションを選択し、[ok] をクリックします。
3. レンズ核の中心と前極 (a − r) との距離を測定する。
   1. 画像処理ソフトウェアの直線ツールを使用して、レンズ核のイメージされた中心を軸方向に線を描画します。この線の中心をレンズ核の中心としてください。
   2. レンズの前極にこの点から別の線を描画し、距離を測定するために、「分析」メニューで「測定」を選択します (a-r)、 aはレンズの半径、 rはレンズの中心からの中心までの距離核。
   3. 前方から後極に別の線を引き、この距離をレンズの直径 (2a) として測定します。[結果] ウィンドウからこれらの長さをコピーし、スプレッドシートまたは統計プログラムに転送します。
      注:核の中心から前方の極まで、レンズの核の中心からレンズの中心まで正確に測定する方が簡単です。この測定は、ステップ10.3.5 の式によって変換され、レンズの核の中心とレンズの中心との距離を報告する。胚核が明らかであっても、常に成体の核を測定に使用してください。
   4. 直径を2で割り、レンズ半径を計算し、 a.
   5. R/aを計算し 、レンズ半径に対してレンズ核の局在化を行う。
      注: 前極の近くに配置された原子核の場合、 r/aは > 0.0 になり、中央に局在する原子核のr/aは0.0 になります。
4. 標準的な長さの関数として正規化された軸核測定の対数をグラフ化して、ゼブラフィッシュ開発時の水晶体局在の変化を決定します。

結果

成人ゼブラフィッシュアイ解剖は、哺乳動物のものとよく似ている (図 1a)。ゼブラフィッシュと哺乳動物の眼との間のいくつかの相違にもかかわらず、毛様体¹⁷の代わりに毛様帯を有するような、光学的性質¹⁸の違い、および胚発生¹⁹時の形態形成の違い、ゼブラフィッシュアイは、眼の発達を研究し、眼科疾患^20、21、22を理解するための優れたモデルである。水晶体の前極である単純上皮は、赤道において寿命の長い増殖、伸長、繊維細胞への分化の過程を経て、レンズの大部分を構成する。成熟した繊維細胞 (図 1b、水色) は、最初に胚に分化し、オルガネ...

ディスカッション

ゼブラフィッシュレンズ形態の分析は、変異体における表現型、または眼レンズの生物学を研究することを目的とする薬理学的介入の効果を理解する上での最初のステップである。レンズ縫合、皮質繊維細胞の形態、レンズ核の側面を分析する方法を概説します。これらのアプローチは、インビトロおよびインビボでの組み合わせである (表1 に比べた)。インビトロの方法は外の皮質の細胞形態のより大きい細部を、また大人レンズの後部縫合線へのアクセスを可能にする。

In Vivo での分析は、トランスジェニックマーカーを使用して可能である。ここで紹介する導入遺伝子は、レンズ膜特異的であり、既存のQ01ゼブラフィッシュラインと比較して、レンズ膜にラベルを付けながら、アマクリン細胞を含む他の細胞タイプを眼内にも標識し、解釈を複雑にする。.In vivoのシグナルは、胚発生の2日目に形成される眼の色素上皮によって制限されるので、胚はこの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU)	Sigma	P7629	注意 – 非常に有毒
4%パラホルムアルデヒド水溶液	電子顕微鏡 Sciences	RT 157-4	注意 – 健康被害、可燃性
共焦点顕微鏡	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	対物レンズとチャンバー温度を-21に設定 &度;C
DAPI	Invitrogen	D1306	注意 – 目や皮膚に刺激を与える
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Fisher Scientific	D128	注意 – 可燃性、皮膚に浸透する
使い捨てベースモールド	VWRサイエンティフィック	15154-631
パスツールガラスピペット	フィッシャーブランド	13-678-20A
デュモン#5鉗子	デュモン&Fils		は鉗子を鋭く保ちます
エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩(トリカイン)	Sigma-Aldrich	A5040	-有毒
ガラス底マイクロウェル皿(35mmシャーレ、14mmマイクロウェル、#1.5カバーガラス)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
グリセロール	シグマ	G2025
hu&β;B1cry:mAppleCAAX DNAコンストラクト	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements ARソフトウェア	Nikon
Olympus  モデル2.1.1.183コントローラ付き	Olympus Corp	DP70
オリンパスの顕微鏡	オリンパス株式会社	SZX12
ロイジン-アレクサ粉546	サーモフィ	ッシャーA22283
ノールレッドインジケーター(1%w / v)	リッカケミカル	カンパニー5725-16
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	フィッシャーサイエンティフィック	BP399
フォトショップ	Adobe	CS5 v12.0
ショップソフトウェア	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD 対物	ニコン
電源	Wild Heerbrugg	MTr 22	または同等の電源
スライドウォーマーモデル No. 26020FS	フィッシャーサイエンティフィ	12-594
水酸化ナトリウムビーズ	フィッシャーサイエンティフィック	S612-3	注意 - 目や皮膚、標的臓器に腐食性/刺激性 - 呼吸器系、金属に腐食性
スーパーフロスト/プラス 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
シルガード 184 シリコーン ダウ コーニング	ワールド プレビジョン インスツルメンツ
Tissue-Tek O.C.T. コンパウンド	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	注意 –有毒、水生環境に有害、腐食性
Vannasマイクロ解剖はさみ	テッドペラ株式会社	1346	シャープ/シャープストレートチップ
Vectashield退色防止mouting媒体	ベクトル研究所	H-1000
小麦胚芽凝集素(WGA)-アレクサ小麦粉-594	ライフ	テクノロジーW11262