細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

サマリー

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。

要約

黄色ブドウ球菌および他のグラム陽性病原体は、環境からの脂肪酸を膜リン脂質に組み込む。感染中、外因性脂肪酸の大部分は宿主リポタンパク質粒子内に存在する。宿主脂肪酸の貯蔵所や、細菌がリポタンパク質粒子から脂肪酸を抽出するメカニズムに関しては、不確実性が残っている。本研究では、鶏卵黄からの低密度リポタンパク質(LDL)粒子を濃縮し、LDLがS.アウレウスの脂肪酸貯留槽として機能するかどうかを決定するためのプロトコルについて説明する。この方法は、LLLと細菌間の相互作用を探索するための効果的かつ経済的なモデルである、公平なリピドミック分析と鶏LLLを利用する。LDLからの外因性脂肪酸のS.aureus統合の解析は、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を用いて行われ、細菌の脂肪酸組成の特性評価を可能にする。LLLへの曝露時に細菌膜脂質に生じる脂肪酸の新しい組み合わせの膜および公平な同定。これらの高度な質量分析技術は、リン脂質に組み込まれた特定の外因性脂肪酸を明らかにすることによって、脂肪酸の組み込みの比類のない視点を提供します。ここで概説する方法は、他の細菌病原体および複合脂肪酸の代替供給源の研究に適応可能である。

概要

メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、ヘルスケア関連感染の主な原因であり、関連する抗生物質耐性はかなりの臨床的課題である1、2、3である。したがって、新規治療戦略の開発は最優先事項である。グラム陽性病原体の有望な治療戦略は、脂肪酸合成を阻害しており、S.アウレウスにおいて、ホスファチジルグリセロール(PG)、リシル-PG、およびカージリピン4を含むリン脂質産生の要件である。細菌では、脂肪酸合成II経路(FASII)5を介して脂肪酸産生が起こり、真核生物とはかなり異なり、FASIIは抗生物質開発の魅力的な標的となる5,6.FASII阻害剤は、主にFabIを標的とし、脂肪酸炭素鎖伸びに必要な酵素7.FabI阻害剤トリクロサンは、広く消費財や医療用品8、9で使用されています。追加のFabI阻害剤は、S.アウレウス感染症10、11、12、13、14の治療のためにいくつかの製薬会社によって開発されています ^{,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}.しかしながら、S.aureusを含む多くのグラム陽性病原体は、リン脂質合成のための外因性脂肪酸を清掃し、FASII阻害27、28、29をバイパスすることができる。したがって、FASII阻害剤の臨床的可能性は、宿主脂肪酸の供給源と病原体が宿主27、28から脂肪酸を抽出するメカニズムに関する我々の知識のかなりのギャップのために議論される。これらのギャップに対処するために、リポタンパク質粒子からS.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の取り込みを監視する偏りのないリピドミック分析法を開発した。

敗血症の間、宿主リポタンパク質粒子は血管内の宿主由来脂肪酸の潜在的な供給源を表し、宿主脂肪酸の大部分は^粒子30に関連している。リポタンパク質は、リン脂質およびタンパク質からなる親水性シェルからなるもので、トリグリセリドおよびコレステロールエステ^ル31の疎水性コアを囲む。シロミクロン、非常に密度の高いリポタンパク質、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質(LDL)の4つの主要なクラスは、ホストによって生成され、脂質輸送手段として機能し、脂肪酸とコレステロールを送達します。血管系を介して細胞をホストします。LLLは、トリグリセリドおよびコレステロールエステ^ル31を含むエステル化脂肪酸に豊富である。我々は、高度に精製されたヒトLLLがPG合成のための外因性脂肪酸の生存可能な供給源であることを以前に実証し、したがってFASII阻害剤^{バイパス32}のメカニズムを提供する。精製ヒトLLLの浄化は技術的に困難で時間がかかる一方で、精製されたヒトLLLの商業的供給源は日常的に使用したり、大規模な細菌スクリーンを実行するために非常に高価です。これらの制限に対処するために、我々は、リポタンパク質^粒子33の豊富な供給源である鶏卵黄からのLLLの濃縮のための手順を修正した。我々は、S.aureus³²の膜へのヒトLDL由来脂肪酸の取り込みを監視するために、標的とされていない、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を使用することに成功しました。以前に報告された方法とは異なり、このアプローチは、3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプのそれぞれについて個々の脂肪酸異性体を定量することができる。オレイン酸(18:1)は、S.アウレウスリン脂質29、30、32に容易に組み込まれるすべての宿主リポタンパク質粒子内に存在する不飽和脂肪酸である。S.アウレウスはオレイン酸^合成29ができない。従って、リン脂質組み込みオレイン酸の量は、ブドウ球菌^膜29内の宿主リポタンパク質由来脂肪酸の存在を確立する。これらのリン脂質種は、ここで説明する最先端の質量分析法によって同定することができ、脂肪酸源の存在下で培養されたS.aureusの膜組成の前例のない分解能を提供する可能性が高い感染中に遭遇する。

プロトコル

注:鶏卵黄からのLDL粒子の濃縮のための以下のプロトコルは、Moussaら2002³³に由来する。

1. LDL粒子濃縮用鶏卵黄の調製

1. 70%のエタノール溶液で殻を洗って2つの大きな鶏卵を消毒し、空気乾燥を可能にします。
2. 70%のエタノール溶液を使用して卵分離器を消毒し、空気乾燥を可能にします。中型ビーカーの唇に卵セパレータを取り付けます。
3. 卵セパレータに各卵を個別に割り、アルブデンがビーカーに流れるようにします。無傷の卵黄は、セパレータによって保持されます。
4. 卵黄を30mLの無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)で2回洗い、残留アルブミンを除去する。
5. 卵黄をフィルターペーパーの上にそっと置きます。
6. 滅菌ピペット先端でビテリン膜を穿刺し、無菌50 mLの円錐遠心管に膜の内容物を排出します。膜とフィルターペーパーを捨てます。

2. 鶏卵黄からのLDL含有血漿の分画

1. 卵黄にpH 7.0で0.17M NaClの約2つのボリュームを追加し、激しく混ぜます。その後、この溶液を4°Cで60分間混ぜます。
2. 卵黄希釈を10°Cで10°Cで10,000 x gで45分間遠心分離し、粒状画分(ペレット)から無菌50mL円錐管に血漿画分(上清)を取り除きます。
3. 手順 2.2 を繰り返します。

3. プラズマからのLDL粒子の単離

1. プラズマ画分を40%硫酸アンモニウム(w/v)と4°Cで60分間混ぜます。
2. 420 mM NaOH溶液でプラズマ画分のpHを8.7に調整します。
3. 卵黄希釈を4°Cで10,000 x gで45分間遠心分離し、上半固体黄色分画を7kDa細孔サイズ透析チューブに取り除きます。それが膨らむことを可能にするために、チューブに部屋を提供します。
4. 硫酸アンモニウムを除去するために、3Lの超純水で4°Cで一晩透析する。かき混ぜる棒を使って水をそっと混ぜます。
5. 無菌50 mL円錐遠心管に透析液を移します。
6. 45分間、10,000 x gで4°Cで溶液を遠心分離し、慎重に上半固体黄色分画を無菌チューブに取り除き、4°Cで保存します。

4. 脂肪酸源としての鶏肉LLLの評価

1. サブ培養S.アウレウス細胞を脂肪酸フリー1%トリプトンブロスの5mLにし、振盪(225rpm)で37°Cで一晩インキュベートする。脂肪酸の補助栄養, 脂肪酸の供給源と培養物を補う.
2. 1%のトリプトンブロスで0.1の600 nm(OD₆₀₀₎で光学密度(OD)に一晩培養を希釈する。丸底96ウェルプレートの各ウェルにセル懸濁液のピペット50μL。
   注:脂肪酸の補助栄養を使用する場合は、トリプトンスープの2つのボリュームで一晩培養を洗浄し、培養のODを決定する前に脂肪酸の持ち越しを制限するためにトリプトンスープの5 mLで再懸濁します。
3. 未処理のコントロールを含むウェルの場合は、ウェルあたり1%トリプトンブロスの50 μLを追加します。
4. 実験細胞懸濁液を含むウェルに、10%卵黄由来LDL、2μMトリクロサン、または10%卵黄由来LDLおよび2μMトリクロサンの混合物を添加した1%トリプトンブロスの50μLを添加する。
   注:この時点で、各ウェルは100 μLを含み、卵黄由来LDLとトリクロサンの最終濃度は、それぞれ5%と1μMになります。
5. 連続的な線形揺れで37°Cに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、時間の経過とともにOD₆₀₀を測定し、成長を監視します。

5. 膜脂質分析のためのLLLを用したS.アウレウスのインキュベーション

1. 単離されたコロニーを脂肪酸フリー1%トリプトンブロスの5mLに培養し、振盪(225rpm)で37°Cで一晩インキュベートする。
2. 1:100を1%トリプトンブロスの50mLを含む無菌250mLのバッフルフラスコに希釈する。振盪で37°Cで中間対数相(約4時間)にインキュベートします。
3. 25 mLの培養を無菌50mL遠心管に移し、細胞をペレット化する。上清を取り出し、1%トリプトンブロスの750 μLで細胞ペレットを再中断します。
4. 細胞懸濁液の再懸濁細胞とアリコート300 μLを無菌1.5 mL遠心管に組み合わせます。
5. 所望の最終濃度にLLLを加え、4時間振る(225rpm)で37°Cでインキュベートします。
6. 2分間16,000 x gで4°Cの培養物を遠心分離し、細胞ペレットを2体の無菌PBSで洗浄し、その後繰り返します。
7. 各湿った細胞ペレットの重量を記録します。ドライアイスまたは液体窒素でセルペレットをスナップフリーズし、-80°Cで保存するか、セクション6に直接進みます。

6. S.アウレウス膜脂質の抽出

1. 冷凍S.アウレウス細胞ペレットをドライアイスに置きます。各セルペレットの上に0.5mmの酸化ジルコニウムビーズを加え、細胞ペレットの体積とほぼ同じ量のビーズを使用します。
   注:脂質抽出のこの方法の代替として、研究者は、細菌細胞34から脂質を正確にするために確立されたBlighおよびDyerまたはFolch法を使用することができます。
2. 75%メタノール(HPLCグレード)の740 μLを細胞ペレットに直接-80°Cに冷やします。
3. 内部標準として細胞の1mg当たり50 μMジミストイルホスファチジルコリン(メタノールで調布)の2 μLを追加します。試験管を閉じ、各サンプルを含む1.5mL遠心分離管を弾丸ブレンダー組織ホモジナイザーの利用可能なポートに置きます。低速でサンプルを均質化し、2-3を設定し、3分間使用します。
4. サンプルの均質性を視覚的に検査します。細胞の塊が見える場合は、Bullet Blender で均質化を 2 分単位で続行します。
5. 弾丸ブレンダーからサンプルを取り出し、化学ヒュームフードに移します。
6. 各サンプルチューブに270μLのクロロホルムを追加します。30分間精力的にサンプルを渦にします。
   注意: クロロホルムは発癌物質の可能性があります。
7. ベンチトップ遠心分離機でサンプルを最大2,000 x gで最大30分間遠心分離します。互換性のある遠心チューブでより速い速度を使用することができ、遠心分離の持続時間は10分に短縮することができます。
8. 化学ヒュームフードで、単相性上清を収集し、抽出管の底部のタンパク質ペレットを慎重に避けながら、新しい試験管に移します。
9. 75%メタノール(HPLCグレード)の740 μLと270μLのクロロホルムをタンパク質ペレットに加え、上記のステップ6.6-6.8に記載されているように各サンプルを再抽出します。第2抽出から上清を各サンプルについて以前に収集した上清と組み合わせます。
10. 窒素やアルゴンなどの不活性ガスの流れの下、または遠心分離機濃縮器(材料の表)を使用して真空下で抽出溶媒を蒸発させます。
11. 乾燥脂質抽出物を水性10mM炭酸アンモニウム溶液の1.0mLで3回洗浄し、ステップ6.10のようにサンプルを再乾燥させます。
12. イソプロパノールなどの好適な非極性溶媒に乾燥脂質抽出物を再中断する。ステップ5.7で決定された新鮮な細胞重量の1mg当たり20μLを用いてサンプルを再中断する代わりに、細胞ペレットの重量が不明な場合は、イソプロパノールの200μLでサンプルを再中断し、セクション7に進みます。

7. 高解像度・正確質量分析を用いてS.アウレウス脂質プロファイルの解析

1. 完全な脂質分析を行う前に、実験グループから代表的な試験サンプルを選択し、サンプル希釈因子の範囲にわたって分析して、総脂質濃度が線形内にあるサンプル希釈範囲を決定します。質量分析計に対する検出器応答の範囲は、前述の35.
2. 脂質分析を施される各試料脂質抽出物のアリコートを蒸発させ、不活性ガス下または遠心分離器調心(材料表)でアリコートを乾燥させる。
3. 液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)グレードのイソプロパノール:メタノール(2:1、v:v)20mMアンモニウムを含む各乾燥脂質抽出物を再中断し、ステップ7.1で決定した最適なサンプル希釈因子に相当する量を使用する。
4. 標的化されていない脂質分析の場合、サンプルは、フローインジェクションまたは抽出物35、36の直接注入によるクロマトグラフィーを使用せずに、高解像度/正確な質量分析プラットフォームに直接導入され^得る。ステップ7.3で調製した希釈脂質抽出物を適切なオートサンプラーバイアルまたは96ウェルプレートに移します。
5. フローインジェクションベースの解析では、電子フローを備えたHPLC(材料表)などのキャピラリー/低流量アプリケーションが可能なHPLCシステムの温度制御(15°C)オートサンプラーに自動サンプラーを配置します。プロポーショナルおよびフロー監視システム。
6. HPLC溶媒貯留部にLC-MSグレードのイソプロパノール:メタノール(2:1,v:v)を充填し、20mMアンモニウムを含む。
7. アジレントケムステーションソフトウェアを使用して、HPLCオートサンプラーをプログラムして5 μLサンプル注入を行います。[インストゥルメント]メニューで、[インジェクタの設定]を選択し、[射出量]フィールドに「5.0」と入力します。 単位はマイクロリットルとして与えられる。HPLCが2:1(v:v)イソプロパノール:20 mMアンモニウムを含むメタノールの分数当たり1 μLでアイソクラティックフローに設定されていることを確認します。
8. Chemstationインストゥルメントメニューから、[ポンプを設定]を選択し、マイクロフローモードの切り替えスイッチを選択します。
9. [時刻表]フィールドに、次のように入力します:時間 0.00、100% B、フロー 1.0を入力します。[入力]を押して、タイム 10.0、100% B、フロー 1.0と入力して、時刻表の 2 行目を作成します。[ポンプの設定]メニューの下部にある[OK]ボタンを選択します。これらの設定により、毎分1.0 μLの流量で10回の分析実行が可能になります。
10. 低流量(34G)金属針を装着したエレクトロスプレーイオン化源を用いて、HPLC転写ラインから質量分析計への溶出を導入します。
11. サーモチューンプラス計器制御ソフトウェアを使用して、セットアップメニューを選択し、加熱されたESIソースを選択します。これらの値をダイアログ ボックスの対応するフィールドに入力して、イオン化電圧を 4000 V に設定し、シースガスを 5 (任意の単位) に設定します。同様に、毛細血管温度を150°Cに、Sレンズを50%に設定します。
    注: これらの値は、質量分析プラットフォームごとに最適化する必要があります。
12. ターゲットを絞らない脂質分析では、検出器として高解像度/正確な質量MSプラットフォーム(材料の表)を使用します。
13. サーモチューンプラスソフトウェアを使用して、[スキャンの定義]ボタンをクリックし、アナライザメニューで「FTMS」を選択します。 [[一斉範囲]フィールドを[標準]に設定し、[解像度]フィールドで[100,000]を選択します。スキャンの種類が[いっぱい]に設定されていることを確認します。[範囲をスキャン]メニューの下に、[最初の質量 (m/z)]フィールドに200と入力し、[最後の質量 (m/z)] フィールドに2000と入力します。
14. 負の極性が最も豊富なS.アウレウス脂質を検出するために利用されていることを確認してください。
15. イオンマッピングのアンデム質量分析(MS/MS)断片化を用いてサンプル分析を繰り返し、目的のスペクトル領域内のすべての脂質イオンの断片化を行い、脂質構造と脂肪酸成分を確認します。あるいは、目的の選択された脂質イオンは、第8項に初期脂質同定が割り当てられた後にMS/MS分析を受けてもよい。

8. 内因性S.アウレウスおよび外因性LDL由来脂質を同定するためのデータベース検索

1. サーモXcaliburソフトウェアを使用して、観測された質量精度をさらに向上させます。Xcalibur で、[ツール]メニューの下で、[オフラインの再調整]を選択します。[オフラインの再調整]ウィンドウが開いたら、[ファイル]メニューを選択し、[開く] オプションを選択して、再調整するマススペクトル ファイルを読み込みます。
2. 目的のファイルを開き、ビュー ウィンドウの上部にある[行の挿入] ボタンを切り替えて、MS 実行の合計イオン クロマトグラムを表示します。合計イオンクロマトグラムの観測信号ピークの一端でコンピュータマウスを左クリックし、ピークの最も広い部分を横切ってマウスをドラッグすることによって、取得したMS信号を平均化します。
3. [スキャンフィルタ] メニューで、フル スキャン MS データに対応するフィルタを選択します。[読み込み Ref...ボタンを選択し、参照ファイルを選択することにより、少なくとも 3 つの既知のS. aureus内因性脂質の理論上の単一同位体の質量を含む参照ファイルを読み込みます。各脂質単一同体質量の横にある [使用] チェック ボックスをオンにします。
4. 表示ウィンドウの下部にある[検索]ボタンをクリックします。前に行われた合計イオンクロマトグラムの信号ピークを横切ってMS信号を再平均します。
5. 表示ウィンドウの下部にある[変換]ボタンをクリックします。[ダイアログの変換] ボックスが開いたら、[OK] をクリックします。 サーモサイエンティフィック以外のベンダーから質量分析プラットフォームでデータが収集された場合は、この手順を省略します。
6. Xcalibur ソフトウェアを使用して、未処理または LDL 処理された各サンプルの再校正された正確な質量ピーク リストを Excel ファイルのワークシートにエクスポートします。クォール ブラウザアイコンを選択します。[ファイル]メニューを選択し、[開く]オプションを選択して、関心のある再調整されたファイルを開きます。
7. ステップ8.2で説明したように、イオンクロマトグラム全体の広いピーク全体の信号を平均する。
8. マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンを右クリックし、[表示]を選択します |スペクトルリスト:同じメニューから、[表示オプション]を選択し、[表示]メニューの [すべてのピーク]トグル ボックスを選択します。[OK]ボタンをクリックして表示ウィンドウを閉じます。
9. マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンをもう一度右クリックし、エクスポートを選択します |クリップボード (正確な質量).最初のワークシートのエクスポートされたデータ セル A1 を新しい Excel スプレッドシートに貼り付けます。
10. エクスポートされたデータ ファイルの最初の 8 行のテキストを削除して、Excel スプレッドシートのセル A1 にマス スペクトルから最初のマス データ ポイントが含まれるようになりました。エクスポートされたピーク リストごとに Excel ファイルの新しいワークシートを使用して、再調整された MS ファイルごとにエクスポートを繰り返します。
11. 脂質質量スペクトル分析(LIMSA)ソフトウェア37 Excelのアドインを使用して、Hewelt-Belka et al. 2014³⁸で説明した既知のS.アウレウス脂質種の分子式を含むデータベースを構築し、同様にLDLに仮定的に存在する可能性のある脂質種を表す式。
    注:さらに、オレイン(18:1)やリノール酸(18:2)脂肪酸32などの主要なLDL脂肪酸を組み込んだ架空の細菌脂質の潜在的な分子製剤をデータベースに含める必要があります。
12. データベースを構築するには、空白の Excel スプレッドシートを開きます。第1ワークシートの細胞A1に、データベースに添加する脂質種の理論/計算単一同位体質量を入力し、質量分析計で観察されたイオン状態における脂質種の質量に対応する。細胞B1に、PG(34:0)などの脂質種の名前を入力します。
13. 細胞C1において、脂質種の分子式を入力し、質量分析計で観察された脂質のイオン状態に対応する。細胞D1では、質量分析計で観察される脂質種の電荷を入力する。セル A2 に移動して、検索可能なデータベースに入力する次の脂質種の新しいエントリを開始します。
14. すべての目的の脂質種がデータベースに入力されるまで、手順 8.12 と 8.13 を繰り返します。データベース ファイルを保存し、Excel で開いたままにします。
15. Excel で、[アドイン]メニューを選択します。LIMSAソフトウェアを起動するには、LIMSA を選択します。メインメニューから、[複合ライブラリ]ボタンをクリックします。表示される新しいウィンドウで、[コンパウンドのインポート] をクリックします。これにより、LIMSA ソフトウェアで使用する複合データベースがアップロードされます。
16. ベンダーの指示³⁵に従って、LIMSA ソフトウェア アドイン for Excel を使用して、すべての MS スペクトルで正確な質量ベースの脂質識別を実行します。LIMSA メインメニューから、スペクトラムタイプメニューの下でピークリストを選択します。MS データが取得された極性に対応するには、[正モード]または [負のモード]を選択します。
17. ピークfwhm (m/z)ウィンドウに、ピーク検索用の目的の質量検索ウィンドウを入力します。高解像度/正確な質量 MS データには、0.003 ~ 0.005 m/z の質量公差検索ウィンドウを使用することをお勧めします。
18. 感度ウィンドウに、目的のベースラインカットオフ(例えば、0.01%の相対量)を入力します。[同位板補正]メニューで、[線形フィット]または[減算アルゴリズム] を選択します。
19. 利用可能な化合物ウィンドウ内の所望の脂質種をクリックして、データベース検索に含める脂質化合物をハイライト表示します。[追加]ボタンをクリックして、強調表示された脂質の種を検索グループに追加します。
20. 追加された化合物をクリックし、選択した内部標準の対応する濃度に濃度ウィンドウを変更して、内部標準を定義します。
21. 定量する内部標準および選択された脂質種が、追加された各脂質種と内部標準を選択し、Class フィールドにクラス名(PG や脂質など)を入力して、同じクラス名に属していることを確認します。
22. 将来使用するために、検索可能な脂質化合物のグループを保存するには、[グループ]メニューの横にある [保存]ボタンをクリックします。
23. エクスポートされたすべての MS ピーク リストを含む Excel ファイルが、最初のS. aureus MS の実行に対応するシートに開いていることを確認し、LIMSA メイン メニューから[検索]ボタンをクリックします。
    注: LIMSA データベース検索の出力には、ステップ 8.12-8.13 で構築されたデータベースに存在する脂質に一致する質量スペクトル フィーチャの一覧と、選択した 1 つ以上の正規化後の一致したフィーチャの濃度が含まれます。内部標準。
24. Xcaliburソフトウェアを使用して、目的の脂質イオンに対応するm/zの正確な質量MS/MSスペクトルを調べ、各同定された脂質分子種に存在する脂肪酸成分を確認する。クォール ブラウザアイコンを選択します。[ファイル]ドロップダウン メニューを選択し、[開く]オプションを選択して、目的の MS/MS ファイルを開きます。
25. マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンを右マウスクリックして、対象の脂質m/zのMS/MS解析に対応するスキャンフィルタを選択し、メニューから範囲を選択します。表示される新しいウィンドウで、[フィルタ]メニューを選択してスキャンを選択します。
26. ステップ8.2で説明されているように、イオンクロマトグラム全体の信号を平均します。MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) ソフトウェアを使用して、適切な統計テストを実行します。未処理およびLDL処理条件全体で正規化された脂質の存在量を比較することにより、S.アウレウス脂質組成物の統計的有意な差を評価する。

結果

鶏卵黄からのLDLの濃縮のためのプロトコルを図1に示す。このプロセスは、全卵黄を生理食で希釈し、顆粒と呼ばれる卵黄固体をLLLを含む可溶性または血漿分画から分離することから始まる(図1)33。血漿画分のLDL含有量は、〜30〜40kDaβ-ライブチン(図2)33の沈殿によってさらに濃縮される。140、80、65、60および15 kDaにおけるタンパク質バンドの存在は、LLLのアポプロテインと相関する(図2)33、39。トリクロサンによる治療は、脂肪酸フリー培中のS.アウレウスの増殖

ディスカッション

S.アウレウスは、その膜リン脂質27、32、43に外因性脂肪酸を組み込^む。外因性脂肪酸を用いるリン脂質合成は、FASII阻害をバイパスするが、膜27、32、44の生体物理学的特性も変化する。グラム陽性病原体のリン脂質への外因性脂肪酸の取り込みは十分に文書化されているが、宿主脂肪酸貯留の同一性と3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプの構造変化にギャップが残っている。外因性脂肪酸の取り込みから生じる。ここでは、i)鶏卵黄からLDL粒子を濃縮し、脂肪酸の供給源であるii)外因性脂肪酸がS.アウレウスの成長に及ぼす影響を決定し、iii)に対して公平な脂肪分析を利用するプロトコルについて説明する。S.aureusの膜リン脂質へ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
硫酸アンモニウム	フィ	ッシャーBP212R-1	≥純度99.5%
細胞培養インキュベーター	Thermo	MaxQ 6000
Centrafuge	Thermo	75-217-420	Sorvall Legen XTR, ローター F14-6x250 LE
Costar assay plate	Corning	3788	96 well
Filter paper	Schleicher &Schuell	597
Large chicken egg	N/	A N/A	Common store bought egg
マイクロプレート分光光度計	BioTek	Epoch 2
NaCl	Sigma	S9625
S. aureus strain AH1263	N/A	N/A	コロラド大学のAlex Horswill提供
析チューブ	Pierce	68700	7,000MWCO
Tryptone	Becton, Dickison and Company	211705
0.5 mm 酸化ジルコニウムビーズ	Next Advance	ZROB05
Bullet Blender	Next Advance	BBX24B
メタノール (LC-MS グレード)	Fisher	A4561
クロロホルム (試薬グレード)	Fisher	MCX10559
イソプロパノール (LC-MS グレード)	フィ	ッシャーA4611
ジミリストイルホスファチジルコリン	アバンティ極性脂質	850345C-25mg
重炭酸アンモニウム	シグマ	9830	≥純度99.5%
のギ酸アンモニウム	Sigma	70221-25G-F
Xcaliburソフトウェア	Thermo Scientific	OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos 質量分析計	Thermo Scientific		高分解能/精密質量 MS
Agilent 1260 キャピラリーHPLC	Agilent
SpeedVac 真空濃縮器	Thermo Scientific