Method Article

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

DOI:

10.3791/59545

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June 4th, 2019

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1Immunology and Diabetes Unit, St. Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Medicine, University of Melbourne, St. Vincent's Hospital

In This Article

Summary

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ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。

Abstract

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記載されているのは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)における抗原特異的CD4+T細胞増殖を測定するための簡便な、インビトロ、色素希釈ベースの方法である。カルボキシフルオレセイン・スクハニミジルエステル(CFSE)のような安定した、非毒性の蛍光色素の開発は、フローサイトメトリーによって検出されるような蛍光染色における減少によって、まれな抗原特異的T細胞を傍観者と区別することを可能にする。この方法は、代替アプローチに対して次の利点があります:(i)低周波T細胞に対して非常に敏感であり、(ii)抗原またはエピトープの知識が必要とされない、(iii)応答細胞の表現型を分析することができ、(iv)生存可能な応答セルを並べ替え、T セルのクローニングなどのさらなる分析に使用できます。

Introduction

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抗原特異的T細胞を検出し、研究する能力は、細胞媒介性免疫の研究において重要である。しかし、これを行うことは、非常に弱く、検出が困難な自己抗原特異的CD4+T細胞応答のために特に困難です。抗原特異的リンパ球増殖の検出に使用される一般的な方法は[3H]-チミジンであり、これは増殖細胞のDNAに組み込まれた放射性標識ヌクレオチドである。[3H]-チミジンアッセイはDNA合成を検出できますが、この方法は細胞分裂の間接的な尺度であり、DNA合成は、遺伝子の複製およびアポトーシス1の間に独立して開始することができるので、細胞分裂の間接的な尺度である。この問題は、細胞の抗原特異的増殖がかなりのアポトーシス2をもたらす可能性があるという事実によって悪化し、抗原特異的増殖の潜在的な過大評価につながる。さらに、[3H]-チミジン法は、抗原ペプチドで刺激されたPBMCにおけるCD4+またはCD8+系統増殖などの増殖リンパ球に対する表現型情報を提供しない。

2003年には、CFSEを用いて初めての染料希釈アッセイを発表し、CFSEベースの増殖アッセイ3、4と呼ばれる。CFSEは、細胞内リジン残渣に対する共生結合を形成すること....

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Protocol

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すべての被験者は、末梢血の採取前にインフォームド・コンセントを与えた。PBMCを用いた実験の倫理的承認は、セントビンセントのホスプティアル(HREC-A 135/08、HREC-A 161/15)によって与えられた。

1. 試薬の調製

  1. ヒトT細胞培養
    1. RPMI 1640、1x非必須アミノ酸、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド(2mM)、ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)、および5%プールヒト血清(PHS)から成るPBMCを培養するためのRP-5培地を調製する。
  2. CFSEストックソリューション
    1. DMSOの約9mLで25mgのCFSEを溶解してマスターストックを準備し、5mMの濃度で最終ストック溶液を達成します。
    2. PBSのマスターストックを希釈して作業ストックを準備し、10 μMの作業濃度を達成します。

2. 全血からのヒトPBMCの調製

  1. ヒト末梢血の0.5〜1.5 x 106 PBMC/mLの間に一般的です。したがって、必要な血液量は、PBMCの所望の数に依存し、PBSを用いてヒト末梢血を少なくとも1:2で希釈....

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Results

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破傷風トキソイドタンパク質を用いたヒトPBMCのインビトロ刺激:PBMCをCFSEで染色し、破傷風トキソイドの存在下で7日間刺激した。ほとんどすべてのドナーは、彼らがワクチン接種されたので、破傷風トキソイドに強いT細胞応答を示した, 破傷風トキソイドは有用な陽性対照抗原になります.図2は、非刺激PBMCからのCD4+T細胞のCFSE増殖が最小限であったことを三文で示す(~12 CFSE薄暗い細胞;図 2A,B,C)破傷風トキソイド(>3,000 CFSE薄暗い細胞)に応答してCD4+T細胞の顕著な増殖があった。図 2D,E,F)

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Discussion

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CFSEベースの増殖は、抗原特異的ヒトCD4+T細胞を検出および列挙するためのシンプルで堅牢な方法です。CFSEの最適な濃度を使用することは、最適な結果4のために不可欠であることを以前に実証されています。あまりにも多くのCFSEは増殖をアブローしますが、あまりにも少なすぎると、分割された細胞と分割されていない細胞を区別することはできません。対照的に、CFSEの比較的高濃度(5.0 μM)は、精製されたマウスT細胞3を標識するために使用される。バッチ間の変動性のため、最適な濃度を決定するために各バッチを計算することをお勧めします。現在のバッチは、元のパブリケーション (200 nM)4よりもはるかに低い濃度 (10 nM) で使用します。

この方法のもう一つの重要な側面は、抗原用量の最適化である。より少ない抗原で培養されたT細胞は、より敏感であり、増強された機能を示すことができることが十分に確立されている。これはもともと.......

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Disclosures

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著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgements

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この研究は、若年性糖尿病研究財団[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)によって支援されました。国家保健医療研究評議会(NHMRC GNT123586)、糖尿病オーストラリア研究信託ミレニアム賞(Y17M1-MANS)(S.M.)、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム(S.M.、A.D.、E.T.、M.S.)、およびNHMRC大学院奨学金APP1094337とJDRF博士トップアップ奨学金(M.S.)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗ヒト CD4-AlexaFluor647Biolegend317422RRID:AB_2716180
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE)ThermoFisherC1157
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare71-7167-00
Glutamax (1x)Gibco35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1Sino Biological40010-V07E
非必須アミノ酸 (1x)Gibco11140
ペニシリン/ストレプトマイシン (1x)Gibco15070063
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichD8537
プールされたヒト血清オーストラリア赤十字社 N/A
プロインスリン C-ペプチド PI33-63Purar ChemicalsN/Aカスタム合成ペプチド
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
傷風トキソイドタンパク質Statens血清研究所N/ A
破を作った

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C.

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CD4 T CellsCFSE Proliferation AssayFlow Cytometry AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsAntigen specific T CellsCell Division IndexFluorescent Dye DilutionT Cell CloningPropidium Iodide StainingDensity Gradient Centrifugation

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