ここでは、パーキンソン病に関与するαシヌクレインの疾患特異的立体構造変異体および複数のタンパク質の同定を可能にする皮膚生検セクションにおける自由浮遊間接免疫蛍光アッセイのプロトコルを提示する。末梢神経系。
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この記事について
サマリー
要約
現在までに、ほとんどの神経変性疾患については、死後の病理学的確定診断のみが利用可能である。パーキンソン病(PD)の場合、診断は、ドーパミン作動性ニューロンのほとんどが既に失われている場合、疾患コースで後に現れる運動関与の臨床徴候にのみ依存しています。したがって、病気の初めに、またはそれを発症するリスクがある患者を識別できるバイオマーカーの強い必要性があります。ここ数年、皮膚生検は、小さな繊維神経障害などの末梢神経疾患の優れた研究および診断ツールであることが証明されています。興味深いことに、小さな繊維神経障害およびαシヌクレイン(αSyn)神経沈着物は、PD患者における皮膚生検によって示されている。確かに、皮膚生検は、病理学になりやすい末梢神経組織の分析を可能にする、簡単にアクセス可能で、最小限に侵襲的で痛みのない手順であるという大きな利点を有する。さらに、同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患進行との縦方向の相関関係を研究することを可能にする。我々は、PD患者の皮膚神経線維におけるαSyn凝集体の存在を調査するために、標準化された信頼性の高いプロトコルを設定した。このプロトコルは、いくつかの短い固定ステップ、クライオトーム断面、次に2つの特異的抗体を用いた自由浮遊免疫蛍光二重染色を伴う:抗タンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)を用いて、皮膚神経線維と検出のための抗5G4をマークする。αSyn凝集体。それはまた、皮膚神経に関心のある他のタンパク質を標的にするために適用することができる汎用性、敏感で簡単にプロトコルを実行することができます。αSyn凝集体をマークする能力は、PDの死後前の病理学的診断を確立するためのツールとしての皮膚生検の使用に向けたもう一つの一歩である。
概要
皮膚生検は神経障害1の分野における診断および研究ツールとして非常に重要である。実際、表皮と真皮には、豊富な体性感覚神経線維(骨髄および未骨髄)、受容性の自由な神経終末、感覚受容体および汗腺、血管、皮脂腺および筋肉の難解な陰核の自律神経の内線が含まれている。2.
20世紀半ばに、PGP9.5抗体の免疫組織化学のセットアップは、ヒト表皮哺乳類皮膚3の広範な内部性の証拠を可能にした。PGP9.5は、中枢および末梢神経系(PNS)の軸に沿って均等に分布するカルボキシル末端ヒドロラーゼである。この抗体の利用可能性は、皮膚におけるPNSの形態および解剖学を明らかにするだけでなく、それに関連する疾患の研究を実施した3,4を可能にした。皮膚生検は、新しい臨床実体の定義に貢献しました: 小さな繊維神経障害.いくつかの国際グループは、皮膚生検分析による小繊維神経障害5の表記/徴候との関連を示し、神経モルホメトリーおよび標準化されたプロトコルを提供した。臨床実践6、7、8で使用される規範
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プロトコル
このプロトコルは、州倫理委員会によって承認されており、すべての登録された被験者は、研究に書面によるインフォームドコンセントを与えました。
1. 皮膚生検コレクション
- 資格のある医師が適切な臨床設定で皮膚生検を行います。
- 皮膚生検を行い、アルコール綿棒でそれをきれいにする領域を選択します。
- 1ccのリドカイン2%で麻酔液を調調します。
- 針を平行にして、局所麻酔を皮下に注入する。
- 麻酔の効果を確認した後、3ミリメートルの使い捨てパンチを取り、皮下脂肪に達するまで、表皮と真皮を介して下に回転する回転と繊細な下向き圧力を適用します。
- パンチを引き出せ
- 使い捨て鉗子を使用して、皮膚プラグをそっと引き上げます。
- 脂肪組織のレベルで標本の基部を切り取るためにはさみを使用してください。
- 試料を10mLの周期リジン-パラホルムアルデヒド(PLP)固定溶液を含むチューブに入れます。
- 領域を消毒し、接着剤包帯でそれをカバーします。
2. 組織固定と貯蔵
- 新しい PLP 固定ソリューションを作成します (表 1を参照)。
- 皮膚生検の採取直後に、10mLのPLP固定....
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結果
記載の手順(図1)に続いて、PD患者の自律神経構造を内面的にする真皮神経筋胞において、5G4抗体で標識されたαSyn凝集体を検出した。アルファシヌクレイン沈着物の形態は、真皮神経の軸索に沿って点線信号として現れる(図2)。実際、3つの解剖学的部位(頸部、大腿および遠位脚)で19人のPD患者と17のコントロールでこのプロトコルを利用すると、5G4は感度の81%、健康なコントロールに対する特異性の86%を有し、P-αSynは56%の感度を有していたことがわかりました。特異性の100.
特に、5G4およびP-αSyn陽性沈着物は、主に汗腺の周りの神経だけでなく、筋エレクターピリ、小血管、および皮下および皮下プレクサスにおいても、精巣内神経線維では決してない。
一般に、汗腺の内膜の中で、5G4/P-αSyn陽性と誤解される可能性のある非特異的信号を観察することができる。.......
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ディスカッション
PDの診断のための皮膚生検のための自由浮遊免疫蛍光アッセイについて説明する:それは抗PGP9.5抗体、パナキソンマーカー、および抗5G4、凝集形態を認識する立体構造特異的抗体との二重免疫染色を利用するαSynの。
PDおよびおそらく他のタンパク質立体障害における診断目的のための皮膚生検の大きな利点は、:1)軽度に侵襲的な技術によって疾患になりやすい神経組織への直接アクセスであり、したがって、より良い決定を期待されるαSynの感度は、血液やCSFのような生体液よりも凝集する。2)神経変性の尺度として表皮および自律神経線維密度を検出し、定量する機会;3)同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患進行との相関を縦方向に研究するために。
ここで提案されるプロトコルは、迅速で汎用性が高く、重要な手順はほとんどありません。まず第一に、組織固定は正しく追求されなければならない、そうでなければ高い自動蛍光は特定の信号をマスクし、データの正しい分析を防ぐ。固定液中のパラホルムアルデヒドは新鮮にし、7.4のpHを正確にチェッ.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
我々は、パーキンソン・シュバイツとABREOC(エンテ・オスペダリエロ・カントナーレ科学研究諮問委員会)に対し、この研究の財政的支援に感謝する。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5G4(反人間&アルファ;Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | マウスモノクローナル |
| AlexaFluor 488ヤギ抗ウサギIgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 ヤギ抗マウスIgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| リン酸水素二ナトリウム溶液 | Merk Millipore | 106586 | |
| エチレングリコール | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-リジン 一塩酸塩 | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| パラホルムアルデヒド | Aldrich ケミストリー | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | ウサギポリクローナル |
| 塩化ナトリウム | シグマ | S3014 | |
| 二水素ナトリウム一水和物 | メルクミリポア | 106346 | |
| (メタ)過ヨウ素酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S1878 | |
| トリズマベース | シグマ | T1503 | |
| トライトン X-100 | シグマ・アルドリッチ | X100 | |
| ベクタシールド | ベクターラボラトリーズ | H-1000 | 封入剤 |
参考文献
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
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