方法論記事

大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー

DOI：

10.3791/59595

⸱

2019年6月4日

 , 
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

この記事について

サマリー

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マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.

要約

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(p)ppGppヌクレオチドは、様々な身体的および栄養的ストレスに応答して細菌のグローバルレギュレータとして機能します。これは、数秒で急速な発症を有し、GTPプールのそれらに近づくか、またはそれを超えるレベルの蓄積につながる。ストレス反転は、(p)ppGppの急速な消失を起こし、多くの場合、1分未満の半減期を伴う。(p)ppGppの存在は、ストレスの有害な影響に対抗する細胞遺伝子発現および代謝の変化をもたらす。グラム陰性およびグラム陽性細菌は異なる応答機構を有するが、両方とも(p)ppGpp濃度に依存する。いずれにせよ、重大なストレス移行期間中に10秒から数時間に変化する可能性のある時間間隔で多くの放射標識細菌培養物を同時に監視する必要があります。このプロトコルは、この技術的な課題に対処します。この方法は、成長(吸光度)の並列モニタリングと均一リン酸放射標識培養物の迅速なサンプリングを可能にする温度およびシェーカー制御マイクロタイター皿インキュベーターを利用して、ヌクレオチドプールを解決し、定量化するPEIセルロース上の薄層クロマトグラフィー。分析の複数の技術的および生物学的複製には、少量のサンプルが必要です。ダイオークティック成長や急速な(p)ppGpp回転率などの複雑な成長遷移は、この方法によって定量的に評価することができる。

概要

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(p)ppGpp第2のメッセンジャーは、リボソームおよびアミノ酸1、2を合成するための遺伝子を含む多数の遺伝子の発現を調節するグローバルレギュレータである。最初に大腸菌3で発見されたが、(p)ppGppはグラム陽性およびグラム陰性細菌の両方だけでなく、植物の葉緑体4、5で見つけることができる。大腸菌および他のグラム陰性細菌の場合、(p)ppGppは2つの異なる部位6、7、8でRNAポリメラーゼと直接相互作用する。グラム陽性では、(p)ppGppは、CodYによって感知されるGTPの存在量を阻害し、調節9、10につながる遺伝子特異的DNA認識モチーフを有するGTP結合タンパク質である。(p)ppGppは、異なる栄養素およびストレス条件に対する飢餓に応答して蓄積し、ストレス11、12への適応を可能にする遺伝子発現の成長および調整が遅くなる。

ppGpp累積の正味量は、合成酵素とヒドロラーゼ活性のバランスを反映しています。大腸菌RelAは強い合成酵素であり、SpoTは、強いヒドロラーゼと弱い合成酵素を有する二機能性であり、それぞれがストレス依存的な方法で異なる調節される可能性がある。強力なRelA合成酵素は、タンパク質合成13、14、15の要求に追いつかない場合にリボソームA部位に結合したコドン指定荷電tRNAの利用可能性が活性化される。弱いSpoT(p)ppGpp合成酵素は、強い(p)ppGppヒドロラーゼが他のストレス条件に応答し、他のメカニズムを介して阻害される間活性化される。いくつかの条件下では、ACPまたはRsdのようなタンパク質はSpoTに結合することができ、これは加水分解と合成16、17の間のバランスも変化する。グラム陽性では、合成および加水分解は、強力な合成および加水分解活性を持つ単一のRelA SpoTホモログ(RSH)タンパク質と、より小さなヒドロラーゼおよび/または合成酵素12との間のより複雑なバランスを反映する。

(p)ppGppヌクレオチドは、アミノ酸飢餓3によって誘導される厳しい応答の間に薄層クロマトグラム(TLC)の自動ラジオグラムに現れた珍しい32 P標識スポットとして最初に発見された。 より詳細なラベリングプロトコルが18を見直されました。 ここで説明するプロトコル(図1)は、マイクロティタープレート上の複数のサンプルの増殖を監視することを可能にするこれらのプロトコルの変更である。これは、(p)ppGppの豊富な変化の複数の生物学的および技術的な推定を容易にし、当初はダイオシックシフト19の研究のために開発された。32Pによる(p)ppGppのラベリングとTLCによる検出により、(p)ppGpp分解速度の測定も可能です。質量分析、HPLC20、蛍光ケモセンサ21、22、およびppGpp23の影響を受けるプロモーターへのGFP遺伝子融合などの(p)ppGppレベルを決定するための代替方法が開発され、24.蛍光ケモセンサは、現在、ppGppを結合した後の小さなスペクトルシフトによる限られた使用だけでなく、ppGppとpppGpp21を区別する問題を有する。この方法は、(p)ppGppをインビトロで検出するのに効率的であるが、細胞抽出物では検出しない。HPLCを含む方法は20に改善されましたが、高価な機器を必要とし、高スループットに十分に適応していません。最後に、GFP融合はppGpp依存活性化または阻害の推定値を与えることができるが、ppGpp自体を測定しない。これらの代替方法はそれぞれ価値がありますが、高価な機器や実質的なハンズオン時間が必要な場合や、複数の運動サンプリングやその後の処理に対応できません。ここで説明する方法では、96個のサンプルを約20分(プレート当たり18サンプル)で6枚のTLCプレートに適用することができ、TLC開発により数時間未満で解決され、ラベリングに応じて数時間または一晩後に得られた定量データを用いて強度。

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プロトコル

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1. メディアの準備

  1. MOPS(3-モルフォリノ)プロパンスルホン酸25の場合は、10x MOPS塩の1/10体積、100倍の微量栄養素溶液の1/100体積、一晩培養用リン酸3mM、または32Pで均一な標識を行うためのリン酸0.2mMナトリウムを使用します。 0.2% ブドウ糖と 1 μg/mL チアミン (ビタミン B1).必要に応じて 40 μg/mL でアミノ酸を追加します。
    1. MOPS塩の場合は、400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1mM FeSO 4、95 mM NH4Cl、2.6 mM K2SO 4、5 μM CaCl2、10.56mM MgCl2、および 500 mM NaCl を使用します。降水を避けるために書かれた順序で異なるコンポーネントを追加します。KOHでpH 7.4に調整し、濾過によって殺菌する。
    2. 100倍の微量栄養素溶液の場合は、3 μM (NH4)6(MO7)24、 0.4 mM H3BO 4、30 μM CoCl2、10μM CuSO4、80μM MnCl2、および 10 μM ZnSO4を使用します。オートクレーブで殺菌します。
    3. ブドウ糖用 (20%)リン酸ナトリウム(300mM)溶液を、オートクレーブによって別々の100倍のストックとして殺菌する。濾過によりチアミンとアミノ酸混合物の100倍のストックを殺菌します。各実験のための無菌ストックソリューションから新鮮なメディアを準備します。

2. 32Pのラベリング

  1. リン酸ナトリウム3mでMOPS培養物で一晩培養する。
  2. 24ウェルプレートに、0.2mMリン酸ナトリウム担体を含むMOPS培地の550 μLと各細菌の接種(希釈1/20)の30μLを加えます。これはOD600nm 0.1の初期接種を生成する。無菌制御として新鮮な媒体とよく1つを使用してください。
  3. 37°Cの振盪インキュベーターにプレートを置き、900rpmで30分間振ります。プレートをテープでしっかりと取り付け、傾いたりこぼれたりしないようにします。増殖は、プレートリーダーを用いて32Pを欠損し、同じ条件下でインキュベートする培地において、並列に反復板でモニタリングすることができる。
  4. 32P オルトリン酸の各ウェルに 100 μCi を加えます (5 mCi/mL ストックから 20 μL)。
    注:放射能の量はまた実験的な必要性を満たすために調節することができる。0.2 mMキャリアリン酸塩を含む低基底レベル100 μCiはうまく機能しますが、GTPプールと同等になると予想される測定(p)ppGppレベルの場合、ラベルは25または50 μCiに落とすことができます。リン酸担体を0.2mM以下に下げることは、リン酸レベルが成長を制限するのを避けるために推奨されません。
    注意:32Pはβ発光同位子ですので、安全のために指定された適切なシールドを使用してください。 すべての放射性物質は、可能なすべての予防措置を講じて適切に処分されなければなりません。
  5. 1〜2倍(1時間以上)の振盪インキュベーターで成長し、ストレスを誘発する前に細胞内ヌクレオチドプールで外部標識をほぼ平衡化できるようにする。

3. ストレスや飢餓の誘発

  1. 選択したストレスの種類に応じて、例えば、代謝経路阻害剤の追加、温度の変化、必要な栄養素の枯渇、浸透性シフトのシフト、酸化ストレスの誘発、毒素の追加など、選択した方法を使用してストレスを誘発します。
    1. 例えば、大腸菌K-12株でイソロイシン飢餓を誘導するために100 μg/mL L-バリンを追加します。ppGppの増加したレベルは誘導の5分後に観察される。

4. サンプリングとppGpp抽出

  1. 20 μL の氷冷 6 M ギ酸を含む 0.2 mL PCR チューブに、ラベル付きセルサンプルの 20 μL を追加します。
  2. 直ちにサンプルをドライアイスに入れます。
  3. 凍結および解凍の3サイクルによって細胞の抽出効率を高める。
  4. PEIセルロース薄層クロマトグラムを発見する直前に、クロマトグラム上でそれを見つけないように、ペレット細胞の破片に最高速度で1分間遠心サンプルを試料。

5. 薄層クロマトグラフィー

  1. 柔らかい鉛筆で、20cm x 20 cm PEI-Cellulose TLCプレートの端から1cmの原点線をマークし、上から5cmをはさみで取り除きました。各サンプルの PEI 表面に液滴として 5 μL を塗布します。このスポットを乾燥させることなく開発を開始し、ストリークを最小限に抑えることで解像度を向上させます。
  2. 液体が原点サンプルスポットに触れないように、1.5M KH2PO 4(pH 3.4)溶液の層を持つタンクで上昇開発を行います。気密シールでタンクをカバーし、トリミングシートの上部に液体の上昇を可能にします, 15 cm.1.5MKH2PO4溶液に対してpH3.4を達成するためには、H3 PO4を添加してpHを調整する必要がある。
  3. 完全に開発されたクロマトグラムを取り除き、室温で空気乾燥します。
  4. 自由32Pを含むクロマトグラムの上部(pH前面)部分を放射性廃棄物に切り取って廃棄する。この部分は図 2の黄色で表され、UV 光の下で容易に視覚化できます。GTP よりも遅く移行する(p)ppGpp ヌクレオチドのみを測定する場合は、UV 可視 GTP 標準を実行し、より大きな上部(図 2に示すように GTP を上回るものは)をカットして破棄することをお勧めします。
  5. 蛍光体スクリーンで一晩自動放射線フィルムを公開します。
  6. フィルムを開発します。蛍光体画像器で蛍光体スクリーン信号を捕捉し定量します。

6. (p)ppGppの定量

  1. 画像J26、27で放射性スポットを定量する。
    注:(p)ppGppの量は、各試料で観察されるGヌクレオチドの総量に正規化することができる(図2)。背景の量が均質な場合は、単一のブランク (図 2のボックス 4) を減算して背景を修正できます。合計 G は、検出された GTP + ppGpp + pppGpp の合計です。この正規化は、GMPとGDPレベルがごくわずかであると仮定し、これは大腸菌に当てはまります。与えられたヌクレオチドと合計Gの比率は、適用されたサンプル体積の変動を補正する重要な方法を提供する。

7. ppGpp減衰率の測定

注:このプロトコルを変更すると、ppGpp減衰率の測定が可能になります。

  1. ppGpp蓄積を可能にするのに十分な時間のストレスまたは飢餓を引き起こした後(ステップ3)、加水分解速度の検出を可能にする継続的なppGpp合成をブロックするために応力を逆にする。反転の手順は、応力によって異なります。例えば、任意のアミノ酸の飢餓を逆にするためにクロラムフェニコールの200 μg/mLを追加します。
  2. 減衰率は通常速いが、変化する可能性があるため、20~30sごとに2分毎にサンプルを採取してください。
  3. TLCが開発されると(ステップ5のように)、時間経過中に得られたppGppのレベルを、半対数プロット対時間にプロットして、反動率ゼロの減衰率を直線として、およびppGpp半減期の推定を可能にする。

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結果

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大腸菌K-12株では、バリンの添加はイソロイシンの内因性飢餓を引き起こし、5分3分後にppGppレベルの増加をもたらす。ILVを除くすべてのアミノ酸を含むMOPSで増殖した細胞を、図1に示すように32Pで標識した。標識後、10mg/mL L-バリンの6 μL(100 μg/mL最終濃度)を添加し、イソロイシン飢餓を生成した。試料を0分及び5分後に採取した。5分後(図3A)、ppGppおよびpppGppのレベルの2倍および2.5倍の増加が起こった。陰性対照として、無細胞標識サンプルを用いて、32P源におけるオルトリン酸ではない可能性のある化合物を検出した。また、ppGpp欠損株(ΔrelA ΔspoT)を負の対照として含めると、スポットのより良い同定に役立つ可能性がある。

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ディスカッション

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細胞のほぼ均一な標識を達成することは、このプロトコルの重要なステップです。したがって、MOPSまたはTrisメディアなどの定義された媒体の使用は、キャリアリン酸濃度および特定の活性の変動を可能にするために重要である。M9 やメディア A などのリン酸緩衝メディアは使用できません。ほとんどの未定義の培地には、LB、トリプトン、カサミノ酸などの可変量のリン酸塩が含まれています。リン酸同位体33Pは、置換の32Pに置換することができる弱いエミッタであり、置換の利点は、それがより安全であり、32Pの14日の代わりに25日の半減期を有することである。 しかし、32Pのよりエネルギー的な放出はかなり検出感度を高める。同位体を使用することの危険性と、適切なシールド保護と廃棄を使用することの重要性を強調することが重要です。特異的なppGpp28を検出することができるリボスイッチの最近の発見は、いつかインビトロおよびインビボでppGppを検出するより安全な方法につながる可能性があります。導入で述べたように、リン酸標識の使...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健人間開発研究所(NIH)の内壁研究プログラムを支援しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(NH4)6(MO7)24>Fisher ScientificsA-674
オートラジオグラフィーフィルムデンビルサイエンティフィック社E3218
CaCl2J.T.Baker1-1309
クロラムフェニコールRPIC61000-25.0
CoCl2Fisher ScientificsC-371
CuSO4J.T.Baker1843
FeSO4Fisher ScientificsI-146
ギ酸フィッシャーバイオテックBP1215-500
グルコースマクロン4912-12
H3BO4Macron2549-04
H3PO4J.T.Baker0260-02
K2SO4シグマP9458-250G
KH2PO4Fisher BiotechBP362-500
L-バリンΣ V-6504
MgCl2Fisher ScientificsFL-06-0303
マイクロプレートリーダー Synergy HTBiotekSynergy HT
MnCl2SigmaM-9522
MOPSΣM1254-1KG
Na2HPO4マリンクロット7892
NaClJ.T.Baker3624-01
NaH2PO4Mallinckrodt7917
NH4ClシグマA0171-500G
P-32放射性核種、オルトリン酸1mL水(5 mCi)パーキンエルマーNEX053005MC
ストレージ蛍光体スクリーンダックSO230
モミキサーッペンドルフ5382000015
チアミンシグマT-4625
TLC PEIセルロースFメルクミリポア1.05579.0001
TricineRPIT2400-500.0
Typhoon 9400 イメージャーGE Healthcare
ZnSO4Fisher ScientificsZ-68
コサーエ

参考文献

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ppGppPEI TLC

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