Method Article

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

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1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

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我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。

Abstract

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原子力顕微鏡ベースの単一細胞力分光法(AFM-SCFS)は、生細胞の生物物理学的特性を研究するための強力なツールです。この技術は、細胞、受容体およびリガンド間の相互作用の強さとダイナミクスを、他の多くのバリエーションと共に調知することを可能にする。また、単一細胞に対して物理的または生化学的刺激を時空間的に制御した方法で送り出すメカニズムとしても機能し、生細胞と組み合わせると、特定の細胞活性化とその後の細胞イベントをリアルタイムで監視することができます。蛍光イメージング。これらのAFM-SCFS測定の重要なステップは、AFM片持ち機能化、つまり、目的の対象を片持ちに取り付けることです。ここでは、免疫学的研究のために、単一のT細胞と単一のポリスチレンビーズでAFM片持ちを修飾する方法を紹介する。前者は、溶液中の平らな片持ちの先端に単一のT細胞を結合する生体適合性の接着剤を含み、後者は空気環境における単一ビーズ接着のためのエポキシ接着剤に依存する。各片持ち修正に関連する2つの免疫学的応用も同様に提供される。ここで説明する方法は、異なる細胞タイプおよび固体粒子に容易に適合させることができる。

Introduction

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原子力顕微鏡(AFM)、汎用性の高いツールは、細胞生物学研究1、2、3、4、5で多くの応用を発見しました。その高解像度イメージング機能とは別に、ネイティブ力プローブ機能により、生細胞の生物物理学的特性を単一細胞レベル6、7の現場で直接調べることができる。これらには、細胞内構造または細胞全体の剛性8、9、10、11、12、特異的リガンド/受容体結合強度が含まれる。細胞表面上の単一分子レベル13は、固体粒子と細胞の単一対間または2つの細胞間の接着力1、2、14、15。後者の2つは、多くの場合、単一細胞力分光法(SCFS)16として分類される。様々なばね定数を持つ容易に利用可能な片持ちのために、AFMにアクセス可能な力範囲は、数十からの力を含む細胞イベントの全範囲を十分にカバーするいくつかのピコニュートン(pN)からマイクロニュートン(μN)までかなり広いです。受容体ベースの単一分子結合などのpNの、nNへの、例えば、咽頭細胞イベント15。この大きなダイナミックフォースレンジは、光学/磁気ピンセットやバイオ膜力プローブなどの他の力プローブ技術に比べてAFMに有利であり、弱力測定に適しており、通常は200 pN17未満の力を持ちます。,18.さらに、AFMは、時空間的に定義された方法で単一細胞に様々な刺激を提供する高精度マニピュレータとして機能することができます 4,19.これは、リアルタイム単一細胞活性化研究に望ましい。生細胞蛍光イメージングと組み合わせることで、特定の刺激に対するその後の細胞応答を同時に監視できるため、AFMベースのSCFSは光学イメージングとして非常に堅牢になり、細胞シグナル伝達をプローブする実用的なツールを提供します。例えば、AFMは、骨芽細胞20でカルシウム過渡を引き出すために必要な株を決定するために使用された。本研究では、AFM先端を用いた培養骨芽細胞への局所的な力の適用後、カルシウム過渡性画像を用いてカルシウム過渡を蛍光で追跡した。最近では、肝系ステラー細胞(HSC)が増殖したコラーゲン線維化を伸縮するためにAFMが採用され、このメカノ変換HSC活性化は蛍光Srcバイオセンサによってリアルタイムモニタリングされ、そのリン酸化物は、バイオセンサの蛍光強度は、HSC活性化3と相関している。

AFMベースのSCFS実験では、AFM片持ち式の適切な機能化が測定の成功に向けた重要なステップです。私たちの研究の関心は免疫細胞の活性化に焦点を当てているので、我々は定期的に食細胞症や強力な免疫応答を引き起こす可能性のある単一固体粒子などの粒子状物質を持つ片持ちを機能化 4,14,活性化樹状細胞(DC)2などの抗原提示細胞を有する免疫シナプスを形成できる15および単一T細胞。 単一固体粒子は、通常、空気中のエポキシ接着剤を介して片持ちに結合されますが、単一のT細胞は、その非粘着性の性質のために、溶液中の生体適合性接着剤を介して片持ちに機能化されます。ここでは、これら2種類の片持ち修正を行い、2つの関連するアプリケーションを提供する方法について説明する。最初の応用は、AFM-SCFSとのT細胞/DC相互作用をプローブし、細胞力学の観点から制御T細胞の抑制機構を理解することです。2つ目は、AFMと生細胞蛍光イメージングを組み合わせて、受容体非依存ホスファチリノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)の分子機構を明らかにするために、固体粒子に対するマクロファージの細胞応答をリアルタイムで監視することを含む。モエシンは、咽頭細胞症を媒介した。このプロトコルの目的は、興味を持つ研究者が免疫学的研究のためのAFMベースの単一細胞分析を用いて独自の実験設定を設計し、実装するための参照フレームワークを提供することです。

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Protocol

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マウス実験プロトコルは清華大学の動物ケアガイドラインに従う

1. 単一T細胞による片持ち可能な機能化

  1. マウス脾臓細胞製剤
    1. 二酸化炭素を用いてマウス(8〜16週齢(どちらかの性別)を犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行う。
    2. 75%のエタノールでマウスをきれいにし、中間線の皮膚切開を行い、脾臓摘出を行います。
    3. ガラススライドを使用して2%の胎児ウシ血清(FBS)を含むPBSの4 mLで脾臓を均質化し、70 μmメッシュナイロンストレーナーを通して細胞懸濁液を通過させることによって凝集体および破片を除去する。
    4. 5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、赤血球溶解バッファーの2mL(室温でバランスをとった)で細胞を5分間再懸濁する。











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Results

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図4Aは、1つのアプローチリトラクトサイクルにおける単一Tセルと単一DCとの結合相互作用からの典型的な力距離曲線を示す。明るい赤い曲線は延長曲線で、濃い赤のカーブは引き込み曲線です。延長曲線は通常、インデントまたは剛性解析に使用されるので、ここでは引き込み曲線のみが細胞接着に関係します。曲線の最小値(緑色の円)は、最大接着力の尺度を与えます。カーブの下の領域(シェード領域)は、T セルを DC から分離するために必要な作業(エネルギー)を表します。完全な分離の前に、鋭利で段階的な破裂事象がしばしば観察される。これは、セル/セル界面で強い結合が原因でセル表面から引き抜かれ、連続引っ張りの下で離散的に破壊される膜テザーと解釈されます。歩数、高さ、およびステップの長さは、細胞膜21の機械的特性を特徴付けるために使用することができる。T細胞-DC相互作用については、結合強度に関心があり、各曲線に対して最大接着力のみが解析されます。図...

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Discussion

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AFMベースの単細胞力分光法は、生細胞の生体物理学的特性に対処するための強力なツールとして進化してきました。これらのアプリケーションでは、目的の細胞上の特定の相互作用または特性をプローブするために、片持ちは適切に機能化する必要があります。ここで、単一T細胞と単一ミクロンサイズのビーズを先端のない片持ち先に結合する方法についてそれぞれ説明する。片持ち式に単一のTセルを付着させるため、細胞接着剤として生体適合性接着剤を選択した。これは、海洋ムール貝から抽出された特別に配合されたタンパク質溶液です。その接着性は、ヒドロキシル基が非特異的な方法で細胞表面に露出した残基と水素結合を形成することができるポリフェノール残基に由来する。この結合方法は、通常、結合された細胞の細胞機能を妨げない。適切な接着のためには、付着する細胞の状態も重要である。新しく精製されたマウスCD4+T細胞の場合、片持ち機能に使用する前に、ヒトIL-2で一晩で処理する必要があります。さもなければ、彼らはかなり迅速に細胞死を受けるでしょう。細胞が良好な状態でない場合、片持ち式に取り付けることができる場合でも、接着強度が弱いために数回の力プローブの後に片持ちから切り離される可能性が...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学財団(31370878)、国家キープログラム(31630023)、革新的研究グループプログラム(81621002)によって支援されています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<強い>素材
10 μl ピペットチップサーモフィッシャー104-Q
15 ml チューブコーニング430791
直径 6 cm 培養皿NALGENE nunc150462
6 ウェル培養プレートJETTCP011006
AFM カンチレバーNanoWorldArrow-TL1-50チップレスカンチレバー
&β;-メルカプトエタノールΣ7604
生体適合性接着剤BD Cell-Tak354240
CD4+ T 細胞単離 カクテルSTEMCELL19852C.1
DC2.4 細胞株K. Rock (マサチューセッツ大学医学部、マサチューセッツ州ウースター) からの贈り物デ
キストラン被覆磁性粒子STEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
エポキシERGO7100
エタノールtwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR blockerSTEMCELL18731
ガラス カバースリップローカル ベンダー (Hai Men Lian Sheng)HX-E37直径 24mm、薄さ 0.17mm
ガラス スライドJinTong研究室および機器管理部門、海門 N/Aカスタマイズ
H2O2 (30%)Sino pharm10011218
H2SO4Sino pharm80120892
HEPESSigma51558
マグネットSTEMCELL18000
メッシュ ナイロン ストレーナーBD FalconREF 352350
実験室でクローニングMoesin-EGFPN/A
CD25 Treg細胞ポジティブ単離キットSTEMCELL18782コンポーネント:FcR Blocker、Regulatory T cell Positive Selection Cocktail、PE Selection Cocktail、Dextran RapidSpheres、
マウス CD4+ Tcell isolation kitSTEMCELL19852コンポーネント:CD4+T 細胞単離カクテル、ストレプトアビジンRapidSpheres、ラット血清
NaOHLanyi化学製品有限公司?北京1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PEセレクションカクテルSTEMCELL18151
ニシリン-ストレプトマイシンHycloneSV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
ポリスチレン微小球6.0μmPolysciences07312-5
ポリスチレン丸底チューブBD Falcon352054
ラット血清STEMCELL13551
RAW264.7 ATCC
組換えヒトインターロイキン-2PeprotechPeprotech, 200-02-1000
赤血球溶解バッファーBeyotimeC3702
制御性T細胞ポジティブセレクションカクテルSTEMCELL18782C
RPMI 1640ライフC11875500BT
サンプルチャンバー自家製
ストレプトアビジン被覆磁性粒子STEMCELL50001
トランスフェクションキットClontech631318
トリプシン0.25%EDTAライフ25200114
ピンセットJDN / A
名前会社カタログ番号<strong>Comments
Equipment
20x 対物レンズ NA 0.8ツァイス420650-9901Plan-Apochromat
原子間力顕微鏡JPKcellHesion200
遠心分離機ベックマン・コールターアレグラ X-12R
蛍光イメージングツァイス顕微鏡スタンド
加湿CO2インキュベーターサーモフィッシャーHERACELL 150i
倒立型光学顕微鏡ツァイスオブザーバーA1 マニュアル
されたペをベースとした自家製対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
  3. Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
  4. Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
  5. Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
  6. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  7. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
  8. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
  9. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  10. Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
  11. Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
  12. Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
  13. Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
  14. Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
  15. Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
  16. Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
  17. Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
  18. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  19. Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
  20. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  21. Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
  22. Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
  23. Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
  24. Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
  25. Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
  26. Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
  27. Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
  28. Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
  29. Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  30. Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).

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