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方法論記事

フルーツハエを扱うシンプルな自家製ツール -ショウジョウバエメラノガスター

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DOI：

10.3791/59613

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2019年7月24日

1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University

この記事について

サマリー

ここでは、大人のショウジョウバエを移動、冷やし、殺すためにいくつかの自家製ツールを使用するだけでなく、ガラス培養バイアルをきれいにし、卵を収集します。これらの用具は作りやすく、ショウジョウバエの取り扱いにかなり効率的である。

要約

フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、生物学の研究と生物学教育の両方で広く使用されています。大人のハエを扱うのは一般的ですが、実際には難しいです。ここでは、ショウジョウバエの取り扱いにおける困難な問題に対処するためのシンプルで費用対効果の高いツールを作成する方法を示します。泡のストッパーの穴が作られ、ピペットの先端か漏斗が穴に挿入される。ハエは、ピペット先端/漏斗アセンブリに一方向にのみ移動し、バイアルに出入りする成人のショウジョウバエの移動を効率的に制御することができます。既存のプロトコルは、砕いた氷で冷やし、冷たく硬い氷パック表面に移すことによって、ハエを冷やすために変更されました。アイスパックは、立体顕微鏡下で調べたときに凝縮された水から固定されたハエを保つ医療ガーゼの一部で覆われています。ハエは最終的にカウントとソートのために安楽死させられ、マイクロウェービングによって廃棄されます。卵を採取するためのボトル状のケージや、省力化装置、ガラス培養バイアルの洗浄プロトコルも開発されています。

概要

フルーツフライは、ショウジョウバエメラノガスター、幅広いトピック1、2を研究するために生物研究および生物学教育で広く使用されているモデル生物である。ショウジョウバエを扱う基本的な問題は、すべての大人(一部の変異体3、4を除く)が飛ぶことができるので、彼らが扱いやすいように、バイアルからバイアルへの大人の移動とハエの固定化です。

従来、研究者は、2つのバイアルを口から口に持ち、ハエをタップして別のバイアルに飛ばすことを許可し、その後、両方のバイアル4を分離し、再接続することによって、1つのバイアルから別のバイアルにハエを移動します。明らかに、これは同じ直径を持つ2つのバイアルの開口部を必要とし、転送されるハエの量を制御することは困難です。一方、これは仕事を得るために迅速な手を必要とし、迷子のハエを逃げると、研究室や教室に問題が発生する可能性があります。すでに準備された十字架に余分な処女ハエや雄ハエを追加することは、ショウジョウバエ実験の別のルーチンタスクです。従来、ハエは余分なハエを添加する前に十字バイアルに固定されなければならない。

成人ショウジョウバエは、エーテル、CO2、または冷え5によって日常的に麻酔される。エーテルおよびCO2暴露と比較して、冷却は成人のショウジョウバエを固定するための最も費用対効果の高い薬剤であり、ハエと研究者(特に若い学生)の両方に最も有害でない6、7。しかし、冷たい表面やチャンバーに連続的に凝縮する水はハエを濡らします。濡れたハエの型を特定することは困難であり、操作8、9の間に容易に損傷を受ける可能性があります。これは、より広く受け入れられるから冷やす方法を防いだ。

フライ転写用のツールとフライ冷却のための方法は、前述の10.ここで、修飾された冷たい麻酔技術は、ショウジョウバエ実験に対して安全で信頼性が高く、実現可能であると報告されている。また、本論文で述べるのは、1)成人を数え、選別または廃棄する方法、2)ガラス培養バイアルを洗浄するための省力化装置とプロトコル、および3)卵を採取するための簡単なケージである。ここで説明する簡単に設計され、費用対効果の高いツールは、フライハンドリングの困難な問題に対処するために使用することができ、これらの方法はテストされ、経験豊富で初心者の研究者のための堅牢で信頼性が高く、扱いやすいことが証明されています。

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プロトコル

1. ツールとアクセサリの準備

  1. 先端/漏斗ストッパー
    1. 2つのスポンジプラグを取得します(プラグの直径は、ハエを転送するために使用されるバイアルの内部直径よりもわずかに大きくなければなりません)。加熱された電気はんだ付け鉄でスポンジプラグの中心に穴を開けます。
    2. 2つの1 mLピペットの先端を取得し、鋭いナイフで横方向に1つを半分にカットし、尖った端を捨てます。次に、2番目のピペット先端から尖った端の1.5cmを切ります。2つのピペットチップの残りを万能接着剤と一緒に接着し、細長いピペットチップを作ります(図1A)。
    3. 漏斗と細長いピペットチップをスポンジプラグに挿入し、先端と漏斗ストッパー(以下、TストッパーおよびFストッパーと呼ばれる)を作り、100 μLマイクロセントリフュージチューブ(図1A)でピペット先端をキャップします。
      注:じょうごの茎の長さは、プラグの高さよりも大きくなければなりません。プラグの高さ以上の短さである場合、ハエは茎の開口部から脱出します。じょうごの茎の端部は、培養培地の表面または空のバイアルの底の上に少なくとも2cm上に配置する必要があります。小さい内部茎の開口直径(<5 mm)が好ましい小さいじょうご(例えば、ディスク直径<60 mm)が好ましい。ガラスまたはプラスチック漏斗のいずれかを使用してFストッパーを作ることができます。しかし、プラスチック漏斗はガラス漏斗よりも容易に壊れにくいので、生物学のクラスに好ましい。
  2. 微分解針
    1. 手に快適に感じる機械的な鉛筆と、リードリフィルの直径に合った昆虫ピン(例えば、0.5mm、0.7mm)を入手します。
    2. ペンチのペアで昆虫のピンの広い端をカットし、カットフラットをファイルします。リードをピンに置き換えます(図1B)。クリックボタンを押し、0.5~1cmのピンを送り出して解剖します。ピンをきれいにし、解剖活動の後に鉛筆シャフトに完全に戻し、誰でも安全に取り扱えるようにします。
      注:微小解剖針は、幼虫唾液腺などの臓器の解剖だけでなく、死んだ大人のハエを数え、選別するのにも役立ちます。
  3. ハードアイスパック
    1. いくつかの自由なハードアイスパックを取得します(大型アイスパックが好ましい)。図1Cは、26.5 cm x 14.5 cm x 2.5 cmを測定し、完全に平らな上下の側面を持つ、うまくいったアイスパックを示しています。
    2. 医療用ガーゼ(非滅菌)を、覆うアイスパックの冷たい表面よりもわずかに小さい部分に切ります。例えば、26.5 cm x 14.5 cmよりわずかに小さい医療用ガーゼの一部は、図1Cに示すアイスパックをカバーすることが好ましい。
      注:これらの冷却ツールに必要な付属品は含まれます:アイスボックス(私たちは1人のための25 cm x 15 cm x 15 cmの泡箱を使用し、複数の人のための37 cm x 28 cm x 20 cmボックスを使用しました)、砕いた氷を保存するために使用されます。彼らの翼によって冷やされたハエをつかみ、バイアルにそれらを転送するために使用される細かい点ピンセットのペア。-20 °C冷凍庫から冷やされたアイスパックを取り出すために使用される保護作業手袋のペア。立体顕微鏡のステージをカバーするために使用されるプラスチックフィルム。
  4. ショウジョウバエ卵採取ケージ
    注:既製のショウジョウバエの卵収集ケージは、多くのバイオテクノロジー企業から入手可能です11.ここに記載されているのは、60mmペトリ皿用の小さなアクリルボトル状の卵コレクションケージです(図1D左、ケージのデザインは中央に示されています)。それは他のペトリ皿のサイズ(例えば、100のmm、35のmm)のために合わせることができる。これにより、ハエをケージに簡単に出入りできます。シンプルなケージは以下のように用意できます。
    1. スナップカッターを使用して、柔らかいプラスチック飲料ボトル(500mL、内径ca.65mm)を約2:1(尖った端:鈍い端)比に切断し、鈍い端を捨てます。
    2. リンゴジュースプレート(内径60mm)の周りにカードペーパーを粘着テープで巻き付けます[リンゴジュースプレートは卵を集めるために使用されます(図1E、右)]
  5. コードレスチューブブラシドライバ
    1. コードレスドリルドライバ(最高速度= 500 rpm)を取得します。
    2. 前面だけでなく、側面に沿って毛を持つチューブブラシを取得します。理想的には、ブラシの直径は、洗浄する必要がある培養バイアルの直径よりもわずかに大きくする必要があります。ドリルチャック(図1D)に挿入できるようにハンドルの端を切り取り、取り扱いの端を切り取る。
      注:これらのクリーニング用具に必要な付属品はステンレス鋼のスポンジおよび長い袖口のゴム手袋を含む。

2. 大人のハエをバイアルAからバイアルBに移す

注:大人のハエをバイアルから別のバイアルに移すのは、ショウジョウバエの実験で行われる最も一般的な習慣です(例えば、古い培養(A)から新鮮な培養(B)またはクロスバイアル(A)から空のバイアル(B))にハエを麻酔用に移す。.ここで説明するプロトコルは、任意の成人フライ転送活動に使用することができます。特に断りのない限り、このプロトコルは、この論文全体を通じてバイアルAからバイアルBにハエを転送するために使用される。

  1. Fストッパーの漏斗の茎とTストッパーのピペット先端を注意深く確認し、ゴム製エアブロワでストッパーに残っているハエをクリアします。このステップは、特にTストッパーとFストッパーの1セットが異なるショウジョウバエラインの連続的な転送に使用される場合に最も重要です。
  2. バイアルAでハエをタップし、そのプラグをTストッパーに交換し、バイアルBをFストッパーで差し込みます。
  3. バイアルAをバイアルBの上に反転させ、Tストッパーのピペット先端端をFストッパーの漏斗開口部に挿入し、反転バイアルAの端をノックして、ハエがピペット先端から漏れ出し、漏斗の茎を通り抜け、バイアルBに落とす。バイアルAの古い食品が小型化した場合、バイアルAが反転してノックされると落ちる可能性があります。このような状況では、バイアルBをバイアルAの上に反転させ、ハエがバイアルBに這い上がるようにする。
  4. TストッパーをFストッパーから切り離します。残りのハエがバイアルAに一時的に他のバイアルに転送する必要がある場合は、200 μLマイクロ遠心管でTストッパーのピペット先端端をキャップします。それ以外の場合は、Tストッパーを取り外し、バイアルAを取り外し、バイアルBを取り外します。

3. 冷やすことでハエを固定する

  1. 使用前に少なくとも24時間、-20 °C冷凍庫に硬い冷凍パックを保管してください。
  2. 冷やした硬いアイスパックを室温(RT)で20分間置き、非無菌の医療ガーゼを流水で少し湿らせ、アイスパックの表面に密着させます。医学のガーゼは次のフライ冷えで再利用することができる。同時に、砕いた氷の中で空のバイアルを冷やします。
  3. 冷蔵空のバイアル(CEV)に固定する必要がある大人のハエを転送します。2つの転送バイアルが分離されるとき、ペトリ皿またはプラグでCEVを覆い、CEVの全てのハエを底までタップするために砕いた氷に対してCEVをノックします。すべてのハエが固定されるまで、このプロセスを数回繰り返します。ハエは30s以内に固定されます。次に、CEVを氷の中に1分間置き、その場に入れます。麻酔のために一度にあまりにも多くのハエを転送することはお勧めできません。
  4. 冷やしたハエをアイスパックを覆う医療ガーゼに注ぎます。重なり合うハエをペイントブラシで広げ、各ハエが氷パックの冷たい表面によって冷やすことができることを確認してください。冷やしたハードアイスパックが少し膨らむ場合は、タオルの上に置き、その平らな側に動作します。
  5. ステレオ顕微鏡からステージクリップを取り外し、プラスチックフィルムでステージを覆い、アイスパックをステージに置きます。トップライト(冷たい光源が望ましい)をオンにし、立体顕微鏡に焦点を合わせ、冷やしたハエがはっきりと見えるまでアイスパックを動かします。

4. カウント、並べ替え、または廃棄のために大人のハエを殺す

  1. 大人のハエを空のバイアルに移し、ペトリ皿で覆います。
  2. バイアルを反転し、電子レンジで1分+20秒加熱し、死んだハエがペトリ皿に落ちるようにします。
  3. 保護作業手袋を着用し、電子レンジからバイアルを取り出します。死んだハエを白い紙のカードに注ぎ、立体顕微鏡の下で微小解剖針でハエを数えたり調べたりし、観察後にハエの体をゴミ箱に捨てます。
  4. 不要なハエを殺すために、電子レンジで2-3分間ハエを加熱し、その後、ゴミ箱に死体をタップします。
    注:野生型のハエに見られる腹部の先端を越えて翼が伸びる場合、死体から判断することは困難であるため、検査のためにいくつかの翼変異株(例えば、翼の長さの変異体)を殺することはお勧めできません。

5. ボトル型卵コレクションケージの出入り

注:前述のように、TストッパーとFストッパーは、卵回収ケージにハエを送り出すために使用されます。ハエは、このプロセス全体を通して麻酔する必要はありません。リンゴジュース培地の準備、卵の採取、減衰などのその他の詳細は、文献12に見出すことができる。

  1. 卵収集ケージをリンゴジュースプレートに挿入するか、リンゴジュースプレートをソフトドリンクボトルで作られたケージに取り付けます。パラフィンフィルムのストリップで2つの成分の周りの関節をシールします。
  2. できるだけ多くのハエをケージに入れ、ハエを移した後、泡ストッパーでケージを差し込みます。
  3. ケージ内のハエの食べ物を変更するには、ケージ内のハエを空のバイアルに移します。
  4. リンゴジュースプレートを交換し、それを再シールし、バイアルからケージに戻ってハエを転送します。
  5. 卵の採取が終わったら、ハエを空のバイアルに移し、培養バイアルに移します。

6. ガラス培養バイアルの洗浄

注:一般的に、古い培養バイアルには生きたハエが含まれています。ここで説明するプロトコルでは、これらのハエはトランスジェニックハエでない限り、洗浄前に殺される必要はありません。

  1. 濡れたステンレス製のスポンジでガラス培養バイアルから永久マーカーインクを取り除きます。
  2. 培養バイアルを流水に浸します。
    1. 実験室の流しに水を入れ、液体食器洗い石鹸を水に加え、混ぜます。
    2. 培養バイアルを水に浸し、プラグを取り外し、水がバイアルに流れ込むことを可能にします。水の中の皿洗剤は、残りの大人のハエが底に沈み、水に溺れさせるでしょう。
    3. 少なくとも30分間、古い培養バイアルを水に浸します。
  3. ドリルのチャックを緩め、試験管ブラシを挿入し、チャックを再締め付けます。回転セレクタの方向を確認し、ドリルが時計回りに回転していることを確認します。速度トリガーを調整し、最大速度が 500 rpm 未満であることを確認します。
  4. 培養バイアルをきれいにします。
    1. 培養バイアルを大まかに清掃します。
      1. 非支配的な手に長い袖口のゴム手袋を置き、水の中でバイアルを保持します。
      2. コードレスチューブブラシドライバを素手で保持し、培養バイアルにブラシを絞り、トリガーを絞ります。
        注:バッテリーを水に浸しにしないでください。回転ブラシは、古い食べ物、子犬などを分解し、廃棄物の95%以上を除去します。
      3. 廃棄物を別のゴミ箱に捨てます。各バイアルの廃棄物のほとんどが洗浄されるまで、このプロセスを繰り返します。
    2. 培養バイアルを徹底的に清掃してください。
      1. チューブブラシをきれいにし、流しを排水し、きれいな水で補充します。
      2. セクション6.4.1に記載されているように、各培養バイアルから残りの廃棄物を除去します。

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結果

T-およびFストッパーはあらゆる飛行の転移活動で合わせ、使用することができる簡単な用具のセットとして開発された。古い文化からいくつかの新鮮な文化にハエを移すには、新鮮なバイアルのプラグを取り外し、Fストッパーに交換し、古いバイアルのハエをタップし、すぐにプラグを取り外し、Tストッパーに置き換えます。古い食品がコンパクトである場合は、古いバイアルを反転し、Fストッパーの開口部にTストッパーの先端を挿入し、新鮮なバイアルにハエをタップすることが重要です。次に、TストッパーとFストッパーを交換し、バイアルを再プラグするが行われる。古い食品があまりコンパクトになる場合は、新鮮なバイアルを裏返し、FストッパーをTストッパーに取り付け、ハエが新鮮なバイアルに這い上がることをお勧めします。

既に準備された十字架に余分なハエを追加するには、クロスバイアルダウンでハエをタップし、そのプラグをFストッパーに交換することが重要です。次に、実験者は、立体顕微鏡下で冷やしたハエ...

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ディスカッション

本稿では、ショウジョウバエの飼育や実験に関わる基本的な活動を処理するための自家製ツールをいくつか解説する。これらのツールはシンプルですが、かなり効果的です。事実上、どのラボでもこれらのツールを簡単に作成でき、研究や教育ラボは、おそらくローカルでは利用できない既製の代替手段を見つける必要はありません。

フライトランスファーは、ショウジョウバエの実験で最も一般的な習慣と困難な作業です。残念ながら、今まで、転写ツール3、4、12、17ここに記載されていない、T-およびFストッパーが記載されている。これらの簡単なツールは、近年遺伝学のクラスで見つかった迷子のハエが少ないことにより証明されるように、ハエをはるかに簡単かつ制御可能にし、移動中に脱出するハエを少なくします。スポンジプラグは弾性なので、バイア...

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開示事項

著者は何も開示していない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ペンチ
コードレスドリルドライバー最高速度:500 rpm
電気はんだごて
ファイル
漏斗直径<60mm
アイスボックス
昆虫ピン
赤外線温度計HCIYET HT-830
カフゴム手袋
ペンシル医療用
ガーゼ
マイクロ遠心チューブ100ul
電子レンジ
パラフィルム
ペリディッシュ内径60mm
ピペットチップ1ml
プラスチックフィルム
プラスチックペリディッシュΦ空のバイアルを覆うために使用される36 mm
ピンセット
保護作業手袋
再凍結可能な硬質アイスパック26.5×14.5回;2.5cm以上
ゴム製送風機
スナップカッター
ソフトドリンクボトル500ml、内径約65mm
スポンジストッパー
ステンレス製スポンジ
チューブブラシ
バイアル&ファイ;34 mm ×90ミリメートル
のペアディスクのロングメカニカルポイント

参考文献

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