Method Article

刺激されたラマン散乱に基づく非線形顕微鏡の実施

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。

Abstract

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刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡は近赤外線励起光を使用する;したがって、それは多くのマルチフォトン顕微鏡イメージング特性を共有しています。SRSイメージングモダリティは、適切なバンドパスフィルタとロックインアンプ(LIA)検出スキームを備えた非スキャンフォワードディテクタを装備することにより、市販のレーザー走査顕微鏡を使用して得ることができます。典型的なSRS顕微鏡の概略レイアウトには、2つのパルスレーザービーム(すなわち、走査顕微鏡で向けられたポンプとプローブ)が含まれており、これは画像面の空間と時間の両方で重なり合う必要があり、その後、顕微鏡の目的によって焦点を合わせます。サンプルは、X-y 平面を横切る焦点をラスターする 2 つのスキャン ミラー (SM) を介して行います。サンプルとの相互作用の後、送信された出力パルスは上の目的によって集められ、反転された顕微鏡に挿入される前方検出システムによって測定される。ポンプパルスは光学フィルターの積み重ねによって除去され、一方、試料の焦点体積で起こるSRSプロセスの結果であるプローブパルスはフォトダイオード(PD)によって測定される。PD の読み出しは、変調深度を抽出するために LIA によって復調されます。前方検出部を顕微鏡走査ユニットと同期させることにより、2次元(2D)画像を得ることができます。本論文では、SRS顕微鏡の実装について説明し、実証に成功し、直径3μmのポリスチレンビーズのラベルフリー画像の報告に成功した。SRS顕微鏡は市販されていないので、これらの特性を利用するために、自家製の構造が唯一の選択肢です。SRS顕微鏡検査は多くの分野で普及しつつあるため、SRS顕微鏡の実装に関するこの注意深い記述は、科学界にとって非常に有用であると考えられています。

Introduction

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ライフサイエンスアプリケーションでは、SRS顕微鏡検査はラベルフリーイメージングのための強力なツールとして登場しました。SRS顕微鏡検査の基本的な考え方は、振動コントラストの強さと数秒で画像を取得する能力を組み合わせることです。

SRSは、2つのレーザービーム周波数(ポンプ信号とストーク信号が異なる周波数で信号をストーク)と一致し、ラマン散乱を刺激し、有意な結果を引き起こすプロセスです。ストークス信号の増加。線形ラマン分光法とは異なり、SRSは入射光場に非線形依存性を示し、一貫した放射線を生成します。SRSには、1)速度、サンプルの動きや劣化に起因するアーティファクトに対する画像の感度が低くなる、2)優れた信号対雑音比(SNR)の2つの基本的な利点があります。さらに、SRSは自発的なラマンと同一のスペクトルを示し、SRS信号は、励起1、2、3、4、化学結合の濃度に直線的に比例する。5.

私たちの顕微鏡では、フェムト秒(fs)SRS実験セットアップは、高速ミラースキャンユニット(図1)6、7、8を装備....

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Protocol

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1. レーザーシステムの起動

  1. チラーの温度が20°C以下に保たがあるかどうかを確認します。
  2. 湿度制御ユニットが正常に動作し、湿度が約40%の値で維持されているかどうかを確認します。
  3. Ti:Saレーザーをオンにし、マニュアルの指示に厳密に従ってください。
  4. 波長を 810 nm に設定します。
  5. OPO と接続されているミニコンピュータの電源を入れます。OPO レーザーを制御するアプリケーションを実行します。
  6. OPO ボックスの出口で Ti:Sa レーザー出力の 100% が必要な場合は、バイパスを選択します。
  7. Ti:Saレーザー出力とOPOレーザー出力の20%がOPOボックスの出口で必要な場合は、バイパスの選択を解除します。
  8. Ti:Saのシャッターを開き、Ti:SaビームをOPO入力に放します。
  9. 信号出力とポンプアウトをクリックして、OPO 出口で 2 つのレーザー ビームを解放します。
  10. レーザーTi:SaとOPOの両方が安定するまで待ちます(約45-60分)。
  11. 紙検出器カードを使用して、Ti:SaとOPOの両方のOPOボックスの出口にあるビームスポ....

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Results

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SRS測定の例(すなわち、試料の単一点におけるSRS測定)が図7に報告されている。ビームが時間または空間で重なっていない場合、得られた結果は図8aに報告される。オフレゾナンスでは、LIAによって測定される信号の振幅はゼロであり、LIAによって測定された信号の位相は負の値と正の値の間でジャンプします。一方、ビームが空間内で重なり合う場合、遅延線を適切な範囲に移動すると、得られた結果が図8bに報告される。LIAによって測定される信号は、ビームが時間内に完全に重なっているときに最大値に達し、位相はビームが時間内に重なり合う時間の間に固定値を達成し始めます。

同じポリスチレンビーズの単一ビーム(Ti:SaまたはOPO)を用いて得られた吸収画像は、図9a、bに6μmのスケールバーで表される。SRS画像を取得するために、遅延線は<.......

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Discussion

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SRS顕微鏡は、特に細胞や細胞構造の基礎である脂質などの複雑な生物学的構造の研究において、ラベルフリーイメージングを新たな高みに引き上げました。脂質は、生体膜の産生などの複数の生理学的経路に関与し、生合成前駆体およびシグナルトランスデューサ10として機能する。脂質は、脂質液滴(LD)とも呼ばれる特殊な細胞内小器官に包装されています。その直径は数十ナノメートルから数十マイクロメートル11、12までさまざまです。LDsは脂肪細胞およびステロイド産生細胞に豊富に関与するだけでなく、他の細胞株にも存在する。LDは脂質貯蔵などのいくつかの生理学的プロセスで協力する。それらは共通の病理(例えば、変化したコレステロール代謝)13、14で顕著に特徴付けらされている。

従来、脂質の可視化は、蛍光顕微鏡および中性脂質特異的.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgements

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IMM CNRのV.Tufano氏は、貴重な技術支援を受け、ニコンインスツルメンツの製品スペシャリストであるジャコモ・コッツィ氏に対し、有益な議論と継続的なサポートを提供し、感謝しています。この研究は、イタリア国立手術プログラムPONa3 00025(BIOforIU)とユーロバイオイメージング大規模な汎ヨーロッパ研究インフラプロジェクトによって部分的にサポートされました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
取得ツールニコンニコン C2ツール取得対応ツール
APE パルスリンク制御ソフトウェアAPE-APEパルスリンク制御ソフトウェアソフトウェア制御
オートコレレータAPEAPE PulseCheck USB 50オートコレレータ
検出器ThorlabsThorlabs DET10Aフォトダイオード
検出器カードThorlabsThorlabs VRCIR検出器カード
ダイクロイックミラーSemrockムロックFF875-Di01-25X36ダイクロイックミラー
クロイックミラーSemrockFF875-Di01-25X36クロイック
ミラーEOMコオプティクス(EOM CONOPTICS 3350-160 KD * P)。ポッケルスセル
高速検出器ThorlabsThorlabs DET025AL/Mフォトダイオード
高速ミラースキャンユニットニコンC2マイクロスキャニングヘッド
フェムト秒レーザー Ti:SAコヒーレントコヒーレント カメレオンウルトラIIカメレオンウルトラII
機能発電機TTiTG5011 AIM –TTi関数発生器
倒立光学顕微鏡ニコンエクリプス TE-2000-E、ニコンエクリプス TE-2000-E、ニコン
ロックインアンプスタンフォード研究システムSR844-200 MHz デュアルフェーズスタンフォード研究システムからのロックインアンプ
ノッチフィルター、セムロックNF03-808E-25ノッチフィルター
光遅延材ニューポートM-ILS200CC調整可能な光遅延線
光パラメトリック発振器コヒーレント コヒーレント コンパクト OPOコヒーレント コンパクト OPO
オシロスコープWaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroyデジタルオシロスコープ
PCIカードナショナルインスツルメンNI PCIe 6363データ取得カード
位置センサ 検出器ニューポートニューポートコネックス PSD9位置検出器センサー
パワーメーターヘッドCoherentPowerMax PM10、レーザーパワーディテクター
トランスレーションステージThorlabsThorlabs PT1/M標準マイクロメータ付き Meachnical トランスレーションステージ
セダイダイツ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

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